免疫學(xué)病毒免疫監(jiān)測技術(shù)流程一、免疫學(xué)病毒免疫監(jiān)測技術(shù)概述

免疫學(xué)病毒免疫監(jiān)測技術(shù)是通過檢測機體對病毒的特異性免疫反應(yīng)，評估病毒感染狀態(tài)、免疫應(yīng)答水平及疾病進展的重要手段。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查、疫苗效果評價等領(lǐng)域。其核心原理基于機體在病毒感染后會產(chǎn)生特異性抗體或細胞免疫應(yīng)答，通過檢測這些免疫指標(biāo)可間接反映病毒感染情況。

二、免疫學(xué)病毒免疫監(jiān)測技術(shù)流程

（一）樣本采集與處理

1.樣本類型選擇

(1)血清樣本：最常用的樣本類型，用于檢測血清抗體。

(2)全血樣本：適用于流式細胞術(shù)檢測細胞免疫指標(biāo)。

(3)唾液樣本：無創(chuàng)采集，適用于大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查。

(4)組織樣本：用于檢測局部免疫反應(yīng)，如活檢組織。

2.樣本采集規(guī)范

(1)采集前避免抗凝劑干擾，確保血液采集順利。

(2)嚴格無菌操作，防止樣本污染。

(3)標(biāo)記清晰，記錄采集時間及編號。

3.樣本處理步驟

(1)血清分離：離心處理全血樣本，分離血清。

(2)標(biāo)本保存：-80℃凍存，避免反復(fù)凍融。

(3)預(yù)處理操作：根據(jù)檢測需求進行滅活、稀釋等處理。

（二）檢測方法選擇與實施

1.抗體檢測方法

(1)酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：檢測特異性抗體滴度。

-步驟：包被抗原→加樣→孵育→洗板→加酶標(biāo)抗體→顯色→結(jié)果讀取。

-應(yīng)用：IgM/IgG抗體檢測，靈敏度達1:10^3。

(2)免疫熒光技術(shù)（IFT）：觀察細胞表面抗原表達。

-步驟：樣本固定→封閉→孵育一抗→孵育二抗→熒光染色→顯微鏡觀察。

2.細胞免疫檢測方法

(1)流式細胞術(shù)（FCM）：檢測T細胞亞群及活化狀態(tài)。

-步驟：細胞染色→上機檢測→數(shù)據(jù)分析。

-指標(biāo)：CD4+/CD8+比值，典型值為1.0-1.5。

(3)細胞增殖試驗：評估T細胞應(yīng)答能力。

-步驟：細胞共培養(yǎng)→CCK-8法檢測OD值→計算增殖率。

3.分子免疫檢測方法

(1)熒光定量PCR：檢測病毒RNA拷貝數(shù)。

-步驟：樣本提取→逆轉(zhuǎn)錄→PCR擴增→熒光定量。

-靈敏度：可檢測至10^3拷貝/mL。

(2)免疫印跡（WesternBlot）：檢測病毒蛋白表達。

（三）結(jié)果分析與報告

1.定量指標(biāo)分析

(1)抗體滴度計算：通過倍比稀釋法確定IgG/IgM抗體終點滴度。

-示例：IgG滴度1:256為陽性，≥1:512為強陽性。

(2)細胞免疫參數(shù)分析：CD4+/CD8+比值及百分比變化趨勢。

2.半定量指標(biāo)分析

(1)免疫熒光強度分級：0-4級評分系統(tǒng)。

(2)WesternBlot條帶密度分析：灰度值量化。

3.報告規(guī)范

(1)標(biāo)明檢測項目、樣本編號、檢測日期。

(2)列出主要指標(biāo)數(shù)值及臨床意義說明。

(3)附注檢測方法局限性說明。

三、質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)化

（一）室內(nèi)質(zhì)量控制

1.建立質(zhì)控品體系

(1)定期使用質(zhì)控品評估檢測穩(wěn)定性。

(2)每月進行高/低值質(zhì)控，允許偏差±10%。

2.重復(fù)性試驗

(1)同一樣本連續(xù)檢測3次，RSD≤5%。

（二）室間質(zhì)量評價

1.參加能力驗證計劃

(1)每季度提交樣本至第三方機構(gòu)。

(2)評估結(jié)果與參考值一致性。

2.不確定度評定

(1)計算檢測結(jié)果的不確定度范圍。

(2)示例：抗體滴度檢測不確定度±0.2個對數(shù)單位。

（三）標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程（SOP）

1.制定詳細操作手冊

(1)包含樣本處理、試劑配制、儀器校準(zhǔn)等全流程。

(2)每年更新版本，記錄修訂歷史。

2.人員培訓(xùn)與考核

(1)新員工需完成40小時系統(tǒng)培訓(xùn)。

(2)每半年進行操作考核，合格率要求≥95%。

**二、免疫學(xué)病毒免疫監(jiān)測技術(shù)流程**

（一）樣本采集與處理

1.樣本類型選擇

(1)血清樣本：最常用的樣本類型，用于檢測血清抗體。其優(yōu)勢在于操作簡便、穩(wěn)定性好，能夠反映全身性的免疫應(yīng)答水平。適用于大多數(shù)病毒感染的抗體篩查、流行病學(xué)調(diào)查及疫苗效果評估。檢測目標(biāo)包括IgM（早期感染指標(biāo)）、IgG（既往感染或保護性免疫指標(biāo)）等。

*適用場景示例：流感病毒、皰疹病毒、HIV等感染的抗體檢測。

(2)全血樣本：適用于流式細胞術(shù)（FCM）等需要直接檢測細胞表面或內(nèi)源性抗原/抗體的技術(shù)。全血樣本能更好地維持細胞活性，用于評估T細胞亞群（如CD4+T細胞、CD8+T細胞）、T細胞活化狀態(tài)（如CD25表達）、細胞因子分泌等細胞免疫指標(biāo)。

*適用場景示例：評估HIV感染者CD4+T細胞計數(shù)及免疫狀態(tài)、結(jié)核分枝桿菌感染后的細胞免疫應(yīng)答監(jiān)測。

(3)唾液樣本：無創(chuàng)采集，患者依從性高，適用于大規(guī)模、便捷性的流行病學(xué)調(diào)查或兒童群體篩查。唾液樣本主要含有唾液腺分泌物中的抗體成分，可用于檢測唾液IgA（sIgA），反映黏膜局部免疫應(yīng)答。部分研究也探索通過唾液樣本檢測游離病毒RNA。

*適用場景示例：流感病毒sIgA水平調(diào)查、輪狀病毒感染流行病學(xué)監(jiān)測。

(4)組織樣本：通過活檢或手術(shù)獲取的活組織或固定組織，用于檢測病毒在局部組織的感染證據(jù)（如病毒抗原、核酸）或免疫病理改變（如炎癥細胞浸潤、自身免疫現(xiàn)象）。組織學(xué)檢查結(jié)合免疫組化（IHC）或原位雜交（ISH）是診斷某些病毒相關(guān)性病變的關(guān)鍵。

*適用場景示例：宮頸癌組織中人乳頭瘤病毒（HPV）的檢測、帶狀皰疹皮損中水痘-帶狀皰疹病毒（VZV）抗原的定位。

2.樣本采集規(guī)范

(1)采集前準(zhǔn)備：

*向受采者說明采集目的和流程，獲取知情同意。

*核對受采者身份信息，確保樣本標(biāo)記準(zhǔn)確無誤。

*檢查采集工具（注射器、采血管、拭子等）是否在有效期內(nèi)、清潔和無菌。

*根據(jù)檢測需求選擇合適的抗凝劑（如全血樣本需使用肝素鋰或乙二胺四乙酸EDTA抗凝）或采血管（血清樣本需使用含促凝劑的真空采血管）。

(2)血液樣本采集操作：

*嚴格執(zhí)行手衛(wèi)生和消毒措施（如75%酒精棉片消毒）。

*定位穿刺部位（通常選擇前臂肘正中靜脈），避免在有疤痕、硬結(jié)或炎癥的部位采血。

*固定靜脈，回抽血液至所需量（通常比最終檢測體積多采10-20%，以補償抗凝或處理過程中的損失）。

*避免過度擠壓靜脈，防止組織液混入。

*按照采血管順序注入血液（如先含抗凝劑的管，再含分離膠的管，最后血清管），確保血液充分接觸管內(nèi)添加劑。

*立即正確顛倒混勻采血管（血清管和凝血管需充分混勻，注意避免產(chǎn)生氣泡和血凝塊）。

*標(biāo)記管蓋，記錄采集時間。

(3)唾液樣本采集操作：

*指導(dǎo)受采者用清水漱口（通常3-5秒，避免吞咽），去除口腔內(nèi)食物殘渣和雜菌。

*含住含漱液的棉簽或吸管，確保液體充分接觸口腔黏膜。

*收集唾液至指定容器（如管狀采血管或離心管），避免吞咽。

*建議采集時間在禁食禁水1小時后。

(4)組織樣本采集操作（若涉及）：

*嚴格無菌操作，遵循外科手術(shù)規(guī)范。

*根據(jù)需要切取足夠大?。ㄍǔ?-2mm厚，1-3mm寬）的組織樣本。

*使用生理鹽水或特定保存液（如RNAlater）沖洗組織表面血液。

*立即放入預(yù)冷的含防腐劑的容器中，并標(biāo)注相關(guān)信息。

*盡快將組織樣本送至實驗室處理或進行冷凍保存。

(5)采集后處理與運輸：

*血清/血漿樣本：采集后室溫靜置30-60分鐘（允許血凝塊析出），然后3000-4000rpm離心10-15分鐘分離。分離的血清/血漿應(yīng)立即轉(zhuǎn)移至干凈的無菌管中，-20℃或-80℃凍存。

*全血樣本：采集后應(yīng)盡快處理（如用于FCM需在4小時內(nèi)完成），或按FCM要求進行抗凝處理并立即冷藏（4℃）運輸。

*唾液樣本：常溫保存或4℃短時保存，盡快處理或-20℃凍存。

*組織樣本：立即進行固定（如10%中性緩沖甲醛溶液）、脫水、包埋或直接用于后續(xù)檢測。

*所有樣本在運輸過程中均需使用符合要求的生物安全容器，確保樣本不被污染、不被泄露，并做好標(biāo)識。

3.樣本處理步驟

(1)血清/血漿樣本處理：

*凍融：凍存樣本需在4℃水中緩慢融化，避免反復(fù)凍融對某些抗體的影響。

*稀釋：根據(jù)檢測方法的要求，用生理鹽水或特定緩沖液進行適當(dāng)稀釋，以在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)檢測。

*紅細胞裂解（若用于某些特定分析）：對于某些需要檢測血漿中病毒抗原或抗體的方法，可能需先裂解紅細胞（如使用紅細胞裂解液）。

(2)全血樣本處理（FCM準(zhǔn)備）：

*直接使用抗凝全血進行染色，或按FCM要求制備細胞懸液。

*染色前需進行細胞固定和/或通透處理（如使用固定通透液）。

*染色過程需嚴格控制溫度和時間，避免細胞激活或抗原失活。

(3)唾液樣本處理：

*離心（如需）：若樣本含較多雜質(zhì)，可進行低速離心去除不溶性成分。

*取上清液進行后續(xù)檢測。

(4)組織樣本處理：

*固定：確保組織充分浸泡在固定液中，時間根據(jù)組織大小和固定液類型確定（如4℃過夜）。

*脫水：使用梯度乙醇溶液逐步脫水。

*包埋：將組織包埋在石蠟或其他支持介質(zhì)中，便于切片。

*切片：使用切片機將組織切成4-7μm的薄片。

*脫蠟水化：將石蠟切片重新置于水相中，恢復(fù)水性環(huán)境。

*根據(jù)檢測需求進行后續(xù)處理（如抗原修復(fù)、封閉等）。

（二）檢測方法選擇與實施

1.抗體檢測方法

(1)酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：檢測特異性抗體滴度。

*原理：利用固相載體包被病毒抗原，加入待測樣本，若存在特異性抗體則與抗原結(jié)合，再加入酶標(biāo)二抗（或酶標(biāo)抗原），最后加入底物，產(chǎn)生顏色反應(yīng)，通過酶標(biāo)儀測定吸光度值，定量或半定量檢測抗體。

*具體步驟：

1.**包被：**將已知濃度的病毒抗原包被于酶標(biāo)板微孔中，4℃過夜。

2.**封閉：**洗滌后，加入封閉液（如5%脫脂奶粉或BSA溶液），37℃封閉1-2小時，阻斷非特異性結(jié)合位點。

3.**洗滌：**棄去封閉液，洗滌（通常3-5次，每次3-5分鐘），洗去未結(jié)合的封閉劑。

4.**加樣：**加入待測樣本（血清/血漿），設(shè)陰性對照（未感染/陰性血清）、陽性對照（已知抗體陽性血清），37℃孵育1小時。

5.**洗滌：**同上步，洗去未結(jié)合的樣本抗體。

6.**加酶標(biāo)抗體：**加入酶標(biāo)二抗（針對人IgG、IgM等，根據(jù)需求選擇），37℃孵育1小時。

7.**洗滌：**同上步，洗去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。

8.**顯色：**加入顯色底物（如TMB或ABTS），室溫避光孵育15-30分鐘，溶液顏色由黃變橙黃。

9.**終止：**加入終止液（如H2SO4），終止酶的催化反應(yīng)，溶液顏色由橙黃變黃。

10.**檢測：**立即使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度值（A值）。

*結(jié)果判讀：

*計算樣本A值與陽性對照A值的比值，或與標(biāo)準(zhǔn)曲線的對應(yīng)關(guān)系，確定抗體滴度。

*判斷結(jié)果：通常設(shè)定一個閾值（cut-off值），A值超過閾值判為陽性。IgM抗體陽性通常提示近期感染或急性感染早期；IgG抗體陽性提示既往感染或感染后獲得免疫。

*應(yīng)用：廣泛應(yīng)用于流感病毒、HIV、肝炎病毒（HAV、HBV、HCV）、EB病毒、CMV等多種病毒的抗體篩查和診斷。

*注意事項：嚴格質(zhì)控，定期評估檢測性能（靈敏度、特異性、精密度）；避免交叉反應(yīng)；注意樣本溶血、黃疸、高血脂等干擾。

(2)免疫熒光技術(shù)（IFT）：觀察細胞表面抗原表達或直接檢測樣本中病毒抗原。

*原理（間接法）：利用熒光標(biāo)記的二抗檢測樣本中病毒抗原與一抗（已知的特異性抗體）形成的復(fù)合物。

*具體步驟（細胞表面染色示例）：

1.**細胞制備：**制備細胞懸液或鋪片細胞（如外周血單個核細胞PBMC）。

2.**固定：**使用甲醇或丙酮等固定液固定細胞，使抗原失活并固定在細胞上。

3.**封閉：**加入封閉液（如血清或BSA），37℃封閉30分鐘，減少非特異性結(jié)合。

4.**孵育一抗：**加入特異性抗體（針對病毒抗原），4℃孵育過夜或37℃孵育1-2小時。

5.**洗滌：**PBS或相應(yīng)緩沖液洗滌（3-5次）。

6.**孵育二抗：**加入熒光標(biāo)記的相應(yīng)種屬二抗（如羊抗鼠IgG-FITC），37℃孵育30-60分鐘。

7.**洗滌：**同上步。

8.**復(fù)染（可選）：**可用DAPI等熒光染料復(fù)染細胞核。

9.**封片：**加入抗熒光淬滅封片劑。

10.**觀察：**使用熒光顯微鏡或流式細胞儀觀察。

*結(jié)果判讀：在熒光顯微鏡下觀察細胞是否呈現(xiàn)特定熒光信號，根據(jù)熒光強度和細胞形態(tài)進行判讀。流式細胞術(shù)可定量分析細胞陽性率、平均熒光強度（MFI）等參數(shù)。

*應(yīng)用：檢測病毒感染細胞（如HIV感染CD4+T細胞）、病毒抗原在組織內(nèi)的定位、或用于病毒抗體介導(dǎo)的細胞毒試驗（如CTL試驗）。

*注意事項：優(yōu)化抗體濃度和孵育時間；設(shè)置陰性對照（未加一抗）；熒光信號的淬滅和過濾。

(3)免疫印跡（WesternBlot，WB）：檢測病毒蛋白表達。

*原理：將病毒抗原（通常由純化病毒或重組蛋白組成）或組織裂解物進行SDS電泳分離，再轉(zhuǎn)移至固相膜（如PVDF膜或NC膜），與特異性抗體結(jié)合，最后加入酶標(biāo)二抗和底物顯色，通過蛋白條帶的位置和強度進行分析。

*具體步驟：

1.**制備樣品：**病毒裂解物或組織勻漿物，加入樣本加載緩沖液，煮沸變性。

2.**SDS電泳：**將樣品上樣至十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，進行電泳分離蛋白質(zhì)。

3.**蛋白轉(zhuǎn)移：**將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF或NC膜上。

4.**封閉：**膜用封閉液（如5%脫脂奶粉或BSA）封閉，減少非特異性結(jié)合。

5.**孵育一抗：**加入特異性抗體（針對目標(biāo)病毒蛋白），4℃孵育過夜。

6.**洗滌：**TBST或相應(yīng)緩沖液洗滌（3-5次）。

7.**孵育二抗：**加入酶標(biāo)二抗（如HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG），室溫孵育1小時。

8.**洗滌：**同上步。

9.**化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測：**加入ECL底物，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)上捕捉信號。

10.**成像與分析：**拍攝圖像，使用軟件分析條帶大小（分子量）和強度（表達水平）。

*結(jié)果判讀：根據(jù)條帶位置與分子量標(biāo)準(zhǔn)品對照，鑒定病毒蛋白；根據(jù)條帶強度比較不同樣本間蛋白表達水平的差異。

*應(yīng)用：病毒鑒定（通過特異性蛋白條帶）、病毒蛋白表達量分析、抗病毒藥物篩選（觀察藥物對蛋白表達的影響）。

*注意事項：抗體特異性要求高；需設(shè)置陽性對照和陰性對照；條帶強度定量分析需考慮加載量一致性。

2.細胞免疫檢測方法

(1)流式細胞術(shù)（FCM）：檢測T細胞亞群及活化狀態(tài)。

*原理：利用熒光標(biāo)記的單克隆抗體（熒光素如FITC、PE、PerCP、APC等）同時或先后標(biāo)記細胞表面的不同分子（如細胞因子受體、活化標(biāo)志物），通過流式細胞儀檢測每個細胞所帶的熒光信號，從而定量分析細胞亞群比例、細胞功能狀態(tài)等。

*具體步驟（檢測CD4+/CD8+T細胞及活化狀態(tài)示例）：

1.**樣本處理：**全血樣本需使用特定抗凝劑（如EDTA），并盡快處理。若需檢測活化狀態(tài)，可能需在體外短時刺激（如PMA/Ionomycin）。

2.**細胞染色：**

***固定/通透（可選）：**對于某些活化標(biāo)志物（如內(nèi)源性CD69），可能需要先進行細胞固定和通透處理。

***標(biāo)記：**使用含有不同熒光標(biāo)記抗體的混合液對細胞進行染色。例如：

*FITC標(biāo)記抗CD4抗體（檢測所有CD4+T細胞）

*PE標(biāo)記抗CD8抗體（檢測所有CD8+T細胞）

*APC標(biāo)記抗CD25抗體（檢測活化的CD4+或CD8+T細胞）

*PerCP標(biāo)記抗CD45RA抗體（區(qū)分記憶細胞和效應(yīng)細胞）

*染色過程需在冰上避光進行，嚴格控制抗體濃度和孵育時間。

3.**洗滌：**用流式專用洗滌液洗滌細胞，去除未結(jié)合的抗體。

4.**上機檢測：**將細胞懸液上樣至流式細胞儀，設(shè)置檢測參數(shù)（如設(shè)門去除雜質(zhì)，如血小板、細胞碎片）。

5.**數(shù)據(jù)分析：**使用流式軟件（如FlowJo）對數(shù)據(jù)進行分析，計算細胞亞群百分比、絕對數(shù)量（需結(jié)合細胞計數(shù)），比較不同群體間的標(biāo)記物表達差異。

*結(jié)果判讀：

*CD4+/CD8+T細胞比例：正常成人通常CD4+/CD8+比值約為1.0-1.5。比值降低可能提示免疫抑制或某些疾病狀態(tài)。

*活化T細胞比例：CD25陽性細胞比例增高通常表示T細胞活化。

*記憶細胞亞群：通過CD45RA與其他記憶標(biāo)記物（如CD27,CD28）結(jié)合分析，區(qū)分中央記憶、效應(yīng)記憶等亞群。

*應(yīng)用：評估HIV感染者免疫狀態(tài)（CD4+T細胞計數(shù)是關(guān)鍵指標(biāo)）、結(jié)核病等細胞免疫依賴性疾病的診斷和監(jiān)測、腫瘤免疫治療療效評估、疫苗誘導(dǎo)的細胞免疫應(yīng)答研究。

*注意事項：抗體特異性、同型對照設(shè)置、熒光補償、細胞活力要求（通常>95%）、不同實驗間可比性。

(2)細胞增殖試驗：評估T細胞應(yīng)答能力。

*原理：利用細胞增殖相關(guān)的代謝指標(biāo)（如脫氧核糖核苷酸摻入或ATP水平），檢測病毒抗原或特定刺激物（如PMA/Ionomycin）誘導(dǎo)的T細胞增殖程度。

*具體步驟（CCK-8法示例）：

1.**細胞準(zhǔn)備：**制備外周血單個核細胞（PBMC）或特定T細胞亞群。

2.**預(yù)刺激（可選）：**部分細胞（實驗組）與病毒抗原、共刺激分子（如抗CD3/CD28抗體）或PMA/Ionomycin等混合物共孵育。

3.**加入CCK-8試劑：**在培養(yǎng)不同時間點（如第1、3、5天），向每個孔中加入CCK-8試劑。CCK-8在活細胞線粒體酶的作用下轉(zhuǎn)化為水溶性的橙黃色形式。

4.**孵育：**37℃孵育1-4小時。

5.**酶標(biāo)儀檢測：**使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度值（A值）。

6.**數(shù)據(jù)分析：**以時間為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。計算刺激指數(shù)（StimulationIndex,SI）=實驗組A值平均值/對照組A值平均值。SI>1表示細胞增殖。

*結(jié)果判讀：通過生長曲線形態(tài)和SI值評估T細胞的增殖能力和應(yīng)答強度。

*應(yīng)用：評價疫苗或免疫療法的T細胞激活能力、篩選免疫刺激劑、研究細胞因子對T細胞增殖的影響。

*注意事項：設(shè)置空白對照（不含細胞的培養(yǎng)基+CCK-8）、調(diào)零對照（不含CCK-8的培養(yǎng)基+細胞）、重復(fù)實驗確保結(jié)果的可靠性、排除非特異性增殖因素。

(3)細胞因子檢測：評估Th1/Th2等免疫應(yīng)答類型。

*原理：通過檢測細胞因子（如IFN-γ,IL-4,IL-2,TNF-α等）的產(chǎn)生水平，判斷免疫應(yīng)答的類型和強度。

*具體方法：

***ELISA：**分離細胞上清液，使用ELISA試劑盒檢測特定細胞因子濃度。

***LuminexxMAP技術(shù)：**同時檢測多種細胞因子（可達30-100種），靈敏度更高，適用于多因素分析。

***流式細胞術(shù)（多色）：**染色細胞表面的細胞因子受體（如IFN-γR）、細胞因子轉(zhuǎn)錄因子（如Tbet,GATA3）或直接檢測細胞內(nèi)預(yù)存的細胞因子（需固定裂解）。

*結(jié)果判讀：

*ELISA：比較不同樣本間細胞因子濃度，或計算Th1/Th2比值（如IFN-γ/IL-4）。

*Luminex：分析每種細胞因子的濃度和比例。

*流式：分析表達特定標(biāo)志物的細胞亞群比例。

*應(yīng)用：研究病毒感染后的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)、評估疫苗誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答、理解疾病發(fā)生發(fā)展的免疫機制。

*注意事項：細胞因子易被中性粒細胞吞噬或受其他細胞因子影響，樣本處理需迅速；ELISA需設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線；流式檢測需優(yōu)化抗體組合和設(shè)門。

3.分子免疫檢測方法

(1)熒光定量PCR（qPCR）：檢測病毒RNA拷貝數(shù)。

*原理：利用PCR技術(shù)特異性擴增病毒核酸片段，通過熒光信號累積實時監(jiān)測擴增過程，以標(biāo)準(zhǔn)曲線或相對定量方法確定病毒核酸拷貝數(shù)。

*具體步驟：

1.**樣本提?。?*從血液、組織、細胞培養(yǎng)上清等樣本中提取病毒RNA（或DNA，如HBVDNA）。常用方法包括柱式提取、試劑盒提取。需注意去除DNA污染（若檢測RNA）或RNA降解（若檢測DNA）。

2.**逆轉(zhuǎn)錄（檢測RNA）：**使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA（主要是mRNA）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

3.**PCR反應(yīng)體系配制：**將cDNA（或DNA）、上下游引物、特異性探針（或熒光染料如SYBRGreen）、PCR反應(yīng)緩沖液、dNTPs、TaqDNA聚合酶等混合。

4.**PCR擴增：**使用實時熒光定量PCR儀，按照優(yōu)化的程序（變性、退火、延伸）進行擴增。探針法可在延伸步驟同時檢測熒光信號。

5.**數(shù)據(jù)分析：**通過熒光曲線圖判斷是否擴增（Ct值）。使用標(biāo)準(zhǔn)品（已知拷貝數(shù)的病毒RNA/DNA）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，或采用相對定量方法（如2^-ΔΔCt法）比較不同樣本間的病毒載量。

*結(jié)果判讀：根據(jù)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算病毒核酸的絕對拷貝數(shù)（如RNA病毒載量，copies/mL）。Ct值越小，病毒載量越高。

*應(yīng)用：靈敏檢測病毒感染（如HIVRNA載量監(jiān)測、HBVDNA載量監(jiān)測）、評估抗病毒治療效果、病原體負荷定量。

*注意事項：嚴格的核酸提取質(zhì)量控制；引物和探針設(shè)計需特異性強，避免非特異性擴增；設(shè)置陰性對照（無模板對照）；標(biāo)準(zhǔn)品的建立和驗證；PCR污染防控。

(2)免疫印跡（WesternBlot，WB）：檢測病毒蛋白表達（如前所述，此處側(cè)重于病毒感染細胞的蛋白分析）。

*原理：檢測病毒感染細胞裂解物中病毒蛋白的表達水平和修飾狀態(tài)。

*具體步驟（類似檢測重組蛋白，但樣本為感染細胞裂解物）：

1.**細胞感染與處理：**細胞系或PBMC感染病毒，收集不同時間點的細胞。

2.**裂解：**使用裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑）裂解細胞，提取總蛋白。

3.**SDS電泳：**分離蛋白。

4.**蛋白轉(zhuǎn)移：**轉(zhuǎn)移至膜。

5.**封閉：**封閉非特異性位點。

6.**孵育一抗：**使用特異性抗體（如針對病毒衣殼蛋白、酶等）。

7.**孵育二抗：**使用酶標(biāo)二抗。

8.**洗滌與顯色：**洗滌并加入ECL底物顯色。

9.**成像與分析：**拍攝圖像，分析目標(biāo)病毒蛋白條帶的強度和分子量。

*結(jié)果判讀：比較感染組與對照組病毒蛋白的表達量變化，或檢測病毒蛋白的翻譯后修飾（如磷酸化）。

*應(yīng)用：研究病毒蛋白在感染過程中的動態(tài)變化、病毒蛋白與宿主蛋白的相互作用、評估抗病毒藥物對病毒蛋白合成的影響。

*注意事項：確保病毒感染特異性；蛋白提取效率需一致；抗體需嚴格驗證。

（三）結(jié)果分析與報告

1.定量指標(biāo)分析

(1)抗體滴度計算：通過倍比稀釋法（如1:10稀釋，連續(xù)稀釋至樣本A值下降至閾值附近）測定抗體效價。記錄能產(chǎn)生陽性結(jié)果的最大稀釋倍數(shù)，即為抗體滴度。例如，樣本在1:160稀釋時仍陽性，而在1:320稀釋時陰性，則抗體滴度為1:160。

(2)細胞免疫參數(shù)分析：

***細胞百分比：**計算特定標(biāo)記細胞占總細胞數(shù)的百分比。例如，CD4+T細胞占PBMC的百分比。

***絕對數(shù)量：**結(jié)合樣本中總細胞計數(shù)（如通過流式細胞術(shù)或細胞計數(shù)板測定），計算特定細胞亞群的絕對數(shù)量。例如，外周血CD4+T細胞絕對計數(shù)（個/μL）=(CD4+細胞百分比/100)×總細胞計數(shù)。

***平均熒光強度（MFI）：**反映單個細胞表面標(biāo)記物表達的平均熒光水平。MFI越高，通常表示細胞活化程度越高或標(biāo)記物表達量越多。

(3)病毒載量計算：根據(jù)qPCR實驗中標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和公式，計算樣本中病毒RNA或DNA的拷貝數(shù)濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線通常使用系列稀釋的已知濃度病毒模板制作。

(4)WesternBlot條帶定量：可使用圖像分析軟件對條帶進行灰度值分析，進行半定量比較。

2.半定量指標(biāo)分析

(1)免疫熒光強度分級：通常采用0-4級評分系統(tǒng)：

*0級：無熒光。

*1級：弱熒光，僅細胞核/細胞邊緣有少量散在熒光。

*2級：中等熒光，細胞呈現(xiàn)較明顯但均勻的熒光。

*3級：強熒光，細胞呈現(xiàn)非常明亮且均勻的熒光。

*4級：極強熒光，細胞呈現(xiàn)非常明亮且可能略帶熒光彌散的強熒光。

(2)WesternBlot條帶密度分析：使用ImageJ等軟件對WB圖像進行背景扣除，然后對目標(biāo)條帶進行區(qū)域選擇和灰度值積分，以相對灰度值反映蛋白表達水平。注意需使用內(nèi)參蛋白（如β-actin）進行標(biāo)準(zhǔn)化。

3.報告規(guī)范

(1)標(biāo)明基本信息：樣本編號、受檢者姓名/標(biāo)識符、檢測項目名稱、檢測日期、檢測實驗室名稱。

(2)列出主要指標(biāo)數(shù)值：清晰展示抗體滴度、細胞免疫參數(shù)（百分比、絕對數(shù)）、病毒載量、WB條帶灰度值等關(guān)鍵數(shù)據(jù)。

(3)提供結(jié)果判讀：根據(jù)實驗室內(nèi)部或公認的參考值范圍/標(biāo)準(zhǔn)，對結(jié)果進行陽性/陰性或正常/異常的判斷，并說明判斷依據(jù)。

(4)說明臨床意義（可選）：結(jié)合檢測結(jié)果，提供對受檢者免疫狀態(tài)或疾病發(fā)展的初步解釋和建議（注意：最終臨床診斷應(yīng)由醫(yī)生結(jié)合病史和其他檢查結(jié)果做出）。

(5)附注：說明檢測方法、參考區(qū)間（如有）、檢測局限性（如窗口期、交叉反應(yīng)可能性、方法靈敏度限制等）、樣本量要求、抗凝劑要求等。

三、質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)化

（一）室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC）

1.建立質(zhì)控品體系：

(1)使用定期的、已知的、低、中、高濃度水平的質(zhì)控品（如商業(yè)試劑盒提供的質(zhì)控品或?qū)嶒炇易耘涞亩?biāo)品）。質(zhì)控品應(yīng)覆蓋臨床診斷的參考范圍。

(2)每次常規(guī)檢測時均需檢測質(zhì)控品，確保檢測過程穩(wěn)定。

(3)記錄質(zhì)控品結(jié)果，計算變異系數(shù)（CV），通常要求CV≤5%或≤10%（根據(jù)檢測項目和方法要求）。

(4)若質(zhì)控品結(jié)果超出可接受范圍，需立即調(diào)查原因并采取糾正措施（如重新校準(zhǔn)儀器、重新配制試劑、重新培訓(xùn)人員）。

2.重復(fù)性試驗：

(1)對同一份樣本（或使用已知濃度樣本）進行連續(xù)3次或更多次檢測。

(2)計算結(jié)果的變異系數(shù)（CV），評估檢測方法的精密度。高質(zhì)量控制的CV應(yīng)低于方法允許的限度。

(3)每月或每季度進行一次重復(fù)性測試，監(jiān)控方法性能的持續(xù)性。

（二）室間質(zhì)量評價（EQA）

1.參加能力驗證計劃：

(1)定期（如每季度或半年）從第三方機構(gòu)（如國家衛(wèi)健委臨檢中心、省級臨檢中心或國際組織）購買能力驗證樣品。

(2)使用與常規(guī)檢測相同的操作流程和方法，完成對能力驗證樣品的檢測。

(3)將檢測結(jié)果提交給組織方，獲取個人/實驗室成績報告。

(4)分析自身結(jié)果與參考值/中位值的差異，若結(jié)果不合格，需深入分析原因并采取改進措施。

2.不確定度評定：

(1)根據(jù)檢測方法學(xué)原理、儀器性能、試劑質(zhì)量、操作經(jīng)驗等因素，評估并報告檢測結(jié)果的不確定度范圍。

(2)例如，對于ELISA抗體檢測，可評估為±0.2個對數(shù)單位或±15%的絕對偏差。對于細胞計數(shù)，可評估為±5%的相對偏差或±50個細胞/μL的絕對偏差。

(3)不確定度評定有助于更準(zhǔn)確地解釋檢測結(jié)果，特別是在結(jié)果接近臨界值時。

（三）標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程（SOP）

1.制定詳細操作手冊：

(1)按照SOP格式，詳細編寫覆蓋樣本接收、處理、存儲、運輸、檢測全過程、儀器校準(zhǔn)與維護、數(shù)據(jù)記錄與報告等所有環(huán)節(jié)的操作步驟。

(2)明確各環(huán)節(jié)的責(zé)任人、所需設(shè)備耗材、關(guān)鍵參數(shù)設(shè)置、時間要求、廢棄物處理等。

(3)定期（如每年）進行SOP的評審和修訂，確保其科學(xué)性、實用性和時效性，并記錄修訂歷史。

(4)新引進的檢測項目或方法必須先建立相應(yīng)的SOP，并通過驗證后方可實施。

2.人員培訓(xùn)與考核：

(1)所有參與檢測工作的人員（包括新員工和轉(zhuǎn)崗員工）必須接受系統(tǒng)的SOP培訓(xùn)，理解操作原理、關(guān)鍵步驟和注意事項。

(2)培訓(xùn)內(nèi)容應(yīng)包括理論講解、現(xiàn)場操作演示和實際操作練習(xí)。

(3)培訓(xùn)結(jié)束后進行考核，形式可以是筆試、口試或?qū)嶋H操作考核。

(4)考核標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)明確，要求掌握率達95%以上?？己撕细裾叻娇缮蠉彶僮鳌?/p>

(5)定期（如每年）組織復(fù)訓(xùn)和再考核，確保人員持續(xù)符合崗位要求。

一、免疫學(xué)病毒免疫監(jiān)測技術(shù)概述

免疫學(xué)病毒免疫監(jiān)測技術(shù)是通過檢測機體對病毒的特異性免疫反應(yīng)，評估病毒感染狀態(tài)、免疫應(yīng)答水平及疾病進展的重要手段。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查、疫苗效果評價等領(lǐng)域。其核心原理基于機體在病毒感染后會產(chǎn)生特異性抗體或細胞免疫應(yīng)答，通過檢測這些免疫指標(biāo)可間接反映病毒感染情況。

二、免疫學(xué)病毒免疫監(jiān)測技術(shù)流程

（一）樣本采集與處理

1.樣本類型選擇

(1)血清樣本：最常用的樣本類型，用于檢測血清抗體。

(2)全血樣本：適用于流式細胞術(shù)檢測細胞免疫指標(biāo)。

(3)唾液樣本：無創(chuàng)采集，適用于大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查。

(4)組織樣本：用于檢測局部免疫反應(yīng)，如活檢組織。

2.樣本采集規(guī)范

(1)采集前避免抗凝劑干擾，確保血液采集順利。

(2)嚴格無菌操作，防止樣本污染。

(3)標(biāo)記清晰，記錄采集時間及編號。

3.樣本處理步驟

(1)血清分離：離心處理全血樣本，分離血清。

(2)標(biāo)本保存：-80℃凍存，避免反復(fù)凍融。

(3)預(yù)處理操作：根據(jù)檢測需求進行滅活、稀釋等處理。

（二）檢測方法選擇與實施

1.抗體檢測方法

(1)酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：檢測特異性抗體滴度。

-步驟：包被抗原→加樣→孵育→洗板→加酶標(biāo)抗體→顯色→結(jié)果讀取。

-應(yīng)用：IgM/IgG抗體檢測，靈敏度達1:10^3。

(2)免疫熒光技術(shù)（IFT）：觀察細胞表面抗原表達。

-步驟：樣本固定→封閉→孵育一抗→孵育二抗→熒光染色→顯微鏡觀察。

2.細胞免疫檢測方法

(1)流式細胞術(shù)（FCM）：檢測T細胞亞群及活化狀態(tài)。

-步驟：細胞染色→上機檢測→數(shù)據(jù)分析。

-指標(biāo)：CD4+/CD8+比值，典型值為1.0-1.5。

(3)細胞增殖試驗：評估T細胞應(yīng)答能力。

-步驟：細胞共培養(yǎng)→CCK-8法檢測OD值→計算增殖率。

3.分子免疫檢測方法

(1)熒光定量PCR：檢測病毒RNA拷貝數(shù)。

-步驟：樣本提取→逆轉(zhuǎn)錄→PCR擴增→熒光定量。

-靈敏度：可檢測至10^3拷貝/mL。

(2)免疫印跡（WesternBlot）：檢測病毒蛋白表達。

（三）結(jié)果分析與報告

1.定量指標(biāo)分析

(1)抗體滴度計算：通過倍比稀釋法確定IgG/IgM抗體終點滴度。

-示例：IgG滴度1:256為陽性，≥1:512為強陽性。

(2)細胞免疫參數(shù)分析：CD4+/CD8+比值及百分比變化趨勢。

2.半定量指標(biāo)分析

(1)免疫熒光強度分級：0-4級評分系統(tǒng)。

(2)WesternBlot條帶密度分析：灰度值量化。

3.報告規(guī)范

(1)標(biāo)明檢測項目、樣本編號、檢測日期。

(2)列出主要指標(biāo)數(shù)值及臨床意義說明。

(3)附注檢測方法局限性說明。

三、質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)化

（一）室內(nèi)質(zhì)量控制

1.建立質(zhì)控品體系

(1)定期使用質(zhì)控品評估檢測穩(wěn)定性。

(2)每月進行高/低值質(zhì)控，允許偏差±10%。

2.重復(fù)性試驗

(1)同一樣本連續(xù)檢測3次，RSD≤5%。

（二）室間質(zhì)量評價

1.參加能力驗證計劃

(1)每季度提交樣本至第三方機構(gòu)。

(2)評估結(jié)果與參考值一致性。

2.不確定度評定

(1)計算檢測結(jié)果的不確定度范圍。

(2)示例：抗體滴度檢測不確定度±0.2個對數(shù)單位。

（三）標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程（SOP）

1.制定詳細操作手冊

(1)包含樣本處理、試劑配制、儀器校準(zhǔn)等全流程。

(2)每年更新版本，記錄修訂歷史。

2.人員培訓(xùn)與考核

(1)新員工需完成40小時系統(tǒng)培訓(xùn)。

(2)每半年進行操作考核，合格率要求≥95%。

**二、免疫學(xué)病毒免疫監(jiān)測技術(shù)流程**

（一）樣本采集與處理

1.樣本類型選擇

(1)血清樣本：最常用的樣本類型，用于檢測血清抗體。其優(yōu)勢在于操作簡便、穩(wěn)定性好，能夠反映全身性的免疫應(yīng)答水平。適用于大多數(shù)病毒感染的抗體篩查、流行病學(xué)調(diào)查及疫苗效果評估。檢測目標(biāo)包括IgM（早期感染指標(biāo)）、IgG（既往感染或保護性免疫指標(biāo)）等。

*適用場景示例：流感病毒、皰疹病毒、HIV等感染的抗體檢測。

(2)全血樣本：適用于流式細胞術(shù)（FCM）等需要直接檢測細胞表面或內(nèi)源性抗原/抗體的技術(shù)。全血樣本能更好地維持細胞活性，用于評估T細胞亞群（如CD4+T細胞、CD8+T細胞）、T細胞活化狀態(tài)（如CD25表達）、細胞因子分泌等細胞免疫指標(biāo)。

*適用場景示例：評估HIV感染者CD4+T細胞計數(shù)及免疫狀態(tài)、結(jié)核分枝桿菌感染后的細胞免疫應(yīng)答監(jiān)測。

(3)唾液樣本：無創(chuàng)采集，患者依從性高，適用于大規(guī)模、便捷性的流行病學(xué)調(diào)查或兒童群體篩查。唾液樣本主要含有唾液腺分泌物中的抗體成分，可用于檢測唾液IgA（sIgA），反映黏膜局部免疫應(yīng)答。部分研究也探索通過唾液樣本檢測游離病毒RNA。

*適用場景示例：流感病毒sIgA水平調(diào)查、輪狀病毒感染流行病學(xué)監(jiān)測。

(4)組織樣本：通過活檢或手術(shù)獲取的活組織或固定組織，用于檢測病毒在局部組織的感染證據(jù)（如病毒抗原、核酸）或免疫病理改變（如炎癥細胞浸潤、自身免疫現(xiàn)象）。組織學(xué)檢查結(jié)合免疫組化（IHC）或原位雜交（ISH）是診斷某些病毒相關(guān)性病變的關(guān)鍵。

*適用場景示例：宮頸癌組織中人乳頭瘤病毒（HPV）的檢測、帶狀皰疹皮損中水痘-帶狀皰疹病毒（VZV）抗原的定位。

2.樣本采集規(guī)范

(1)采集前準(zhǔn)備：

*向受采者說明采集目的和流程，獲取知情同意。

*核對受采者身份信息，確保樣本標(biāo)記準(zhǔn)確無誤。

*檢查采集工具（注射器、采血管、拭子等）是否在有效期內(nèi)、清潔和無菌。

*根據(jù)檢測需求選擇合適的抗凝劑（如全血樣本需使用肝素鋰或乙二胺四乙酸EDTA抗凝）或采血管（血清樣本需使用含促凝劑的真空采血管）。

(2)血液樣本采集操作：

*嚴格執(zhí)行手衛(wèi)生和消毒措施（如75%酒精棉片消毒）。

*定位穿刺部位（通常選擇前臂肘正中靜脈），避免在有疤痕、硬結(jié)或炎癥的部位采血。

*固定靜脈，回抽血液至所需量（通常比最終檢測體積多采10-20%，以補償抗凝或處理過程中的損失）。

*避免過度擠壓靜脈，防止組織液混入。

*按照采血管順序注入血液（如先含抗凝劑的管，再含分離膠的管，最后血清管），確保血液充分接觸管內(nèi)添加劑。

*立即正確顛倒混勻采血管（血清管和凝血管需充分混勻，注意避免產(chǎn)生氣泡和血凝塊）。

*標(biāo)記管蓋，記錄采集時間。

(3)唾液樣本采集操作：

*指導(dǎo)受采者用清水漱口（通常3-5秒，避免吞咽），去除口腔內(nèi)食物殘渣和雜菌。

*含住含漱液的棉簽或吸管，確保液體充分接觸口腔黏膜。

*收集唾液至指定容器（如管狀采血管或離心管），避免吞咽。

*建議采集時間在禁食禁水1小時后。

(4)組織樣本采集操作（若涉及）：

*嚴格無菌操作，遵循外科手術(shù)規(guī)范。

*根據(jù)需要切取足夠大?。ㄍǔ?-2mm厚，1-3mm寬）的組織樣本。

*使用生理鹽水或特定保存液（如RNAlater）沖洗組織表面血液。

*立即放入預(yù)冷的含防腐劑的容器中，并標(biāo)注相關(guān)信息。

*盡快將組織樣本送至實驗室處理或進行冷凍保存。

(5)采集后處理與運輸：

*血清/血漿樣本：采集后室溫靜置30-60分鐘（允許血凝塊析出），然后3000-4000rpm離心10-15分鐘分離。分離的血清/血漿應(yīng)立即轉(zhuǎn)移至干凈的無菌管中，-20℃或-80℃凍存。

*全血樣本：采集后應(yīng)盡快處理（如用于FCM需在4小時內(nèi)完成），或按FCM要求進行抗凝處理并立即冷藏（4℃）運輸。

*唾液樣本：常溫保存或4℃短時保存，盡快處理或-20℃凍存。

*組織樣本：立即進行固定（如10%中性緩沖甲醛溶液）、脫水、包埋或直接用于后續(xù)檢測。

*所有樣本在運輸過程中均需使用符合要求的生物安全容器，確保樣本不被污染、不被泄露，并做好標(biāo)識。

3.樣本處理步驟

(1)血清/血漿樣本處理：

*凍融：凍存樣本需在4℃水中緩慢融化，避免反復(fù)凍融對某些抗體的影響。

*稀釋：根據(jù)檢測方法的要求，用生理鹽水或特定緩沖液進行適當(dāng)稀釋，以在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)檢測。

*紅細胞裂解（若用于某些特定分析）：對于某些需要檢測血漿中病毒抗原或抗體的方法，可能需先裂解紅細胞（如使用紅細胞裂解液）。

(2)全血樣本處理（FCM準(zhǔn)備）：

*直接使用抗凝全血進行染色，或按FCM要求制備細胞懸液。

*染色前需進行細胞固定和/或通透處理（如使用固定通透液）。

*染色過程需嚴格控制溫度和時間，避免細胞激活或抗原失活。

(3)唾液樣本處理：

*離心（如需）：若樣本含較多雜質(zhì)，可進行低速離心去除不溶性成分。

*取上清液進行后續(xù)檢測。

(4)組織樣本處理：

*固定：確保組織充分浸泡在固定液中，時間根據(jù)組織大小和固定液類型確定（如4℃過夜）。

*脫水：使用梯度乙醇溶液逐步脫水。

*包埋：將組織包埋在石蠟或其他支持介質(zhì)中，便于切片。

*切片：使用切片機將組織切成4-7μm的薄片。

*脫蠟水化：將石蠟切片重新置于水相中，恢復(fù)水性環(huán)境。

*根據(jù)檢測需求進行后續(xù)處理（如抗原修復(fù)、封閉等）。

（二）檢測方法選擇與實施

1.抗體檢測方法

(1)酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：檢測特異性抗體滴度。

*原理：利用固相載體包被病毒抗原，加入待測樣本，若存在特異性抗體則與抗原結(jié)合，再加入酶標(biāo)二抗（或酶標(biāo)抗原），最后加入底物，產(chǎn)生顏色反應(yīng)，通過酶標(biāo)儀測定吸光度值，定量或半定量檢測抗體。

*具體步驟：

1.**包被：**將已知濃度的病毒抗原包被于酶標(biāo)板微孔中，4℃過夜。

2.**封閉：**洗滌后，加入封閉液（如5%脫脂奶粉或BSA溶液），37℃封閉1-2小時，阻斷非特異性結(jié)合位點。

3.**洗滌：**棄去封閉液，洗滌（通常3-5次，每次3-5分鐘），洗去未結(jié)合的封閉劑。

4.**加樣：**加入待測樣本（血清/血漿），設(shè)陰性對照（未感染/陰性血清）、陽性對照（已知抗體陽性血清），37℃孵育1小時。

5.**洗滌：**同上步，洗去未結(jié)合的樣本抗體。

6.**加酶標(biāo)抗體：**加入酶標(biāo)二抗（針對人IgG、IgM等，根據(jù)需求選擇），37℃孵育1小時。

7.**洗滌：**同上步，洗去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。

8.**顯色：**加入顯色底物（如TMB或ABTS），室溫避光孵育15-30分鐘，溶液顏色由黃變橙黃。

9.**終止：**加入終止液（如H2SO4），終止酶的催化反應(yīng)，溶液顏色由橙黃變黃。

10.**檢測：**立即使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度值（A值）。

*結(jié)果判讀：

*計算樣本A值與陽性對照A值的比值，或與標(biāo)準(zhǔn)曲線的對應(yīng)關(guān)系，確定抗體滴度。

*判斷結(jié)果：通常設(shè)定一個閾值（cut-off值），A值超過閾值判為陽性。IgM抗體陽性通常提示近期感染或急性感染早期；IgG抗體陽性提示既往感染或感染后獲得免疫。

*應(yīng)用：廣泛應(yīng)用于流感病毒、HIV、肝炎病毒（HAV、HBV、HCV）、EB病毒、CMV等多種病毒的抗體篩查和診斷。

*注意事項：嚴格質(zhì)控，定期評估檢測性能（靈敏度、特異性、精密度）；避免交叉反應(yīng)；注意樣本溶血、黃疸、高血脂等干擾。

(2)免疫熒光技術(shù)（IFT）：觀察細胞表面抗原表達或直接檢測樣本中病毒抗原。

*原理（間接法）：利用熒光標(biāo)記的二抗檢測樣本中病毒抗原與一抗（已知的特異性抗體）形成的復(fù)合物。

*具體步驟（細胞表面染色示例）：

1.**細胞制備：**制備細胞懸液或鋪片細胞（如外周血單個核細胞PBMC）。

2.**固定：**使用甲醇或丙酮等固定液固定細胞，使抗原失活并固定在細胞上。

3.**封閉：**加入封閉液（如血清或BSA），37℃封閉30分鐘，減少非特異性結(jié)合。

4.**孵育一抗：**加入特異性抗體（針對病毒抗原），4℃孵育過夜或37℃孵育1-2小時。

5.**洗滌：**PBS或相應(yīng)緩沖液洗滌（3-5次）。

6.**孵育二抗：**加入熒光標(biāo)記的相應(yīng)種屬二抗（如羊抗鼠IgG-FITC），37℃孵育30-60分鐘。

7.**洗滌：**同上步。

8.**復(fù)染（可選）：**可用DAPI等熒光染料復(fù)染細胞核。

9.**封片：**加入抗熒光淬滅封片劑。

10.**觀察：**使用熒光顯微鏡或流式細胞儀觀察。

*結(jié)果判讀：在熒光顯微鏡下觀察細胞是否呈現(xiàn)特定熒光信號，根據(jù)熒光強度和細胞形態(tài)進行判讀。流式細胞術(shù)可定量分析細胞陽性率、平均熒光強度（MFI）等參數(shù)。

*應(yīng)用：檢測病毒感染細胞（如HIV感染CD4+T細胞）、病毒抗原在組織內(nèi)的定位、或用于病毒抗體介導(dǎo)的細胞毒試驗（如CTL試驗）。

*注意事項：優(yōu)化抗體濃度和孵育時間；設(shè)置陰性對照（未加一抗）；熒光信號的淬滅和過濾。

(3)免疫印跡（WesternBlot，WB）：檢測病毒蛋白表達。

*原理：將病毒抗原（通常由純化病毒或重組蛋白組成）或組織裂解物進行SDS電泳分離，再轉(zhuǎn)移至固相膜（如PVDF膜或NC膜），與特異性抗體結(jié)合，最后加入酶標(biāo)二抗和底物顯色，通過蛋白條帶的位置和強度進行分析。

*具體步驟：

1.**制備樣品：**病毒裂解物或組織勻漿物，加入樣本加載緩沖液，煮沸變性。

2.**SDS電泳：**將樣品上樣至十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，進行電泳分離蛋白質(zhì)。

3.**蛋白轉(zhuǎn)移：**將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF或NC膜上。

4.**封閉：**膜用封閉液（如5%脫脂奶粉或BSA）封閉，減少非特異性結(jié)合。

5.**孵育一抗：**加入特異性抗體（針對目標(biāo)病毒蛋白），4℃孵育過夜。

6.**洗滌：**TBST或相應(yīng)緩沖液洗滌（3-5次）。

7.**孵育二抗：**加入酶標(biāo)二抗（如HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG），室溫孵育1小時。

8.**洗滌：**同上步。

9.**化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測：**加入ECL底物，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)上捕捉信號。

10.**成像與分析：**拍攝圖像，使用軟件分析條帶大?。ǚ肿恿浚┖蛷姸龋ū磉_水平）。

*結(jié)果判讀：根據(jù)條帶位置與分子量標(biāo)準(zhǔn)品對照，鑒定病毒蛋白；根據(jù)條帶強度比較不同樣本間蛋白表達水平的差異。

*應(yīng)用：病毒鑒定（通過特異性蛋白條帶）、病毒蛋白表達量分析、抗病毒藥物篩選（觀察藥物對蛋白表達的影響）。

*注意事項：抗體特異性要求高；需設(shè)置陽性對照和陰性對照；條帶強度定量分析需考慮加載量一致性。

2.細胞免疫檢測方法

(1)流式細胞術(shù)（FCM）：檢測T細胞亞群及活化狀態(tài)。

*原理：利用熒光標(biāo)記的單克隆抗體（熒光素如FITC、PE、PerCP、APC等）同時或先后標(biāo)記細胞表面的不同分子（如細胞因子受體、活化標(biāo)志物），通過流式細胞儀檢測每個細胞所帶的熒光信號，從而定量分析細胞亞群比例、細胞功能狀態(tài)等。

*具體步驟（檢測CD4+/CD8+T細胞及活化狀態(tài)示例）：

1.**樣本處理：**全血樣本需使用特定抗凝劑（如EDTA），并盡快處理。若需檢測活化狀態(tài)，可能需在體外短時刺激（如PMA/Ionomycin）。

2.**細胞染色：**

***固定/通透（可選）：**對于某些活化標(biāo)志物（如內(nèi)源性CD69），可能需要先進行細胞固定和通透處理。

***標(biāo)記：**使用含有不同熒光標(biāo)記抗體的混合液對細胞進行染色。例如：

*FITC標(biāo)記抗CD4抗體（檢測所有CD4+T細胞）

*PE標(biāo)記抗CD8抗體（檢測所有CD8+T細胞）

*APC標(biāo)記抗CD25抗體（檢測活化的CD4+或CD8+T細胞）

*PerCP標(biāo)記抗CD45RA抗體（區(qū)分記憶細胞和效應(yīng)細胞）

*染色過程需在冰上避光進行，嚴格控制抗體濃度和孵育時間。

3.**洗滌：**用流式專用洗滌液洗滌細胞，去除未結(jié)合的抗體。

4.**上機檢測：**將細胞懸液上樣至流式細胞儀，設(shè)置檢測參數(shù)（如設(shè)門去除雜質(zhì)，如血小板、細胞碎片）。

5.**數(shù)據(jù)分析：**使用流式軟件（如FlowJo）對數(shù)據(jù)進行分析，計算細胞亞群百分比、絕對數(shù)量（需結(jié)合細胞計數(shù)），比較不同群體間的標(biāo)記物表達差異。

*結(jié)果判讀：

*CD4+/CD8+T細胞比例：正常成人通常CD4+/CD8+比值約為1.0-1.5。比值降低可能提示免疫抑制或某些疾病狀態(tài)。

*活化T細胞比例：CD25陽性細胞比例增高通常表示T細胞活化。

*記憶細胞亞群：通過CD45RA與其他記憶標(biāo)記物（如CD27,CD28）結(jié)合分析，區(qū)分中央記憶、效應(yīng)記憶等亞群。

*應(yīng)用：評估HIV感染者免疫狀態(tài)（CD4+T細胞計數(shù)是關(guān)鍵指標(biāo)）、結(jié)核病等細胞免疫依賴性疾病的診斷和監(jiān)測、腫瘤免疫治療療效評估、疫苗誘導(dǎo)的細胞免疫應(yīng)答研究。

*注意事項：抗體特異性、同型對照設(shè)置、熒光補償、細胞活力要求（通常>95%）、不同實驗間可比性。

(2)細胞增殖試驗：評估T細胞應(yīng)答能力。

*原理：利用細胞增殖相關(guān)的代謝指標(biāo)（如脫氧核糖核苷酸摻入或ATP水平），檢測病毒抗原或特定刺激物（如PMA/Ionomycin）誘導(dǎo)的T細胞增殖程度。

*具體步驟（CCK-8法示例）：

1.**細胞準(zhǔn)備：**制備外周血單個核細胞（PBMC）或特定T細胞亞群。

2.**預(yù)刺激（可選）：**部分細胞（實驗組）與病毒抗原、共刺激分子（如抗CD3/CD28抗體）或PMA/Ionomycin等混合物共孵育。

3.**加入CCK-8試劑：**在培養(yǎng)不同時間點（如第1、3、5天），向每個孔中加入CCK-8試劑。CCK-8在活細胞線粒體酶的作用下轉(zhuǎn)化為水溶性的橙黃色形式。

4.**孵育：**37℃孵育1-4小時。

5.**酶標(biāo)儀檢測：**使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度值（A值）。

6.**數(shù)據(jù)分析：**以時間為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。計算刺激指數(shù)（StimulationIndex,SI）=實驗組A值平均值/對照組A值平均值。SI>1表示細胞增殖。

*結(jié)果判讀：通過生長曲線形態(tài)和SI值評估T細胞的增殖能力和應(yīng)答強度。

*應(yīng)用：評價疫苗或免疫療法的T細胞激活能力、篩選免疫刺激劑、研究細胞因子對T細胞增殖的影響。

*注意事項：設(shè)置空白對照（不含細胞的培養(yǎng)基+CCK-8）、調(diào)零對照（不含CCK-8的培養(yǎng)基+細胞）、重復(fù)實驗確保結(jié)果的可靠性、排除非特異性增殖因素。

(3)細胞因子檢測：評估Th1/Th2等免疫應(yīng)答類型。

*原理：通過檢測細胞因子（如IFN-γ,IL-4,IL-2,TNF-α等）的產(chǎn)生水平，判斷免疫應(yīng)答的類型和強度。

*具體方法：

***ELISA：**分離細胞上清液，使用ELISA試劑盒檢測特定細胞因子濃度。

***LuminexxMAP技術(shù)：**同時檢測多種細胞因子（可達30-100種），靈敏度更高，適用于多因素分析。

***流式細胞術(shù)（多色）：**染色細胞表面的細胞因子受體（如IFN-γR）、細胞因子轉(zhuǎn)錄因子（如Tbet,GATA3）或直接檢測細胞內(nèi)預(yù)存的細胞因子（需固定裂解）。

*結(jié)果判讀：

*ELISA：比較不同樣本間細胞因子濃度，或計算Th1/Th2比值（如IFN-γ/IL-4）。

*Luminex：分析每種細胞因子的濃度和比例。

*流式：分析表達特定標(biāo)志物的細胞亞群比例。

*應(yīng)用：研究病毒感染后的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)、評估疫苗誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答、理解疾病發(fā)生發(fā)展的免疫機制。

*注意事項：細胞因子易被中性粒細胞吞噬或受其他細胞因子影響，樣本處理需迅速；ELISA需設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線；流式檢測需優(yōu)化抗體組合和設(shè)門。

3.分子免疫檢測方法

(1)熒光定量PCR（qPCR）：檢測病毒RNA拷貝數(shù)。

*原理：利用PCR技術(shù)特異性擴增病毒核酸片段，通過熒光信號累積實時監(jiān)測擴增過程，以標(biāo)準(zhǔn)曲線或相對定量方法確定病毒核酸拷貝數(shù)。

*具體步驟：

1.**樣本提?。?*從血液、組織、細胞培養(yǎng)上清等樣本中提取病毒RNA（或DNA，如HBVDNA）。常用方法包括柱式提取、試劑盒提取。需注意去除DNA污染（若檢測RNA）或RNA降解（若檢測DNA）。

2.**逆轉(zhuǎn)錄（檢測RNA）：**使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA（主要是mRNA）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

3.**PCR反應(yīng)體系配制：**將cDNA（或DNA）、上下游引物、特異性探針（或熒光染料如SYBRGreen）、PCR反應(yīng)緩沖液、dNTPs、TaqDNA聚合酶等混合。

4.**PCR擴增：**使用實時熒光定量PCR儀，按照優(yōu)化的程序（變性、退火、延伸）進行擴增。探針法可在延伸步驟同時檢測熒光信號。

5.**數(shù)據(jù)分析：**通過熒光曲線圖判斷是否擴增（Ct值）。使用標(biāo)準(zhǔn)品（已知拷貝數(shù)的病毒RNA/DNA）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，或采用相對定量方法（如2^-ΔΔCt法）比較不同樣本間的病毒載量。

*結(jié)果判讀：根據(jù)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算病毒核酸的絕對拷貝數(shù)（如RNA病毒載量，copies/mL）。Ct值越小，病毒載量越高。

*應(yīng)用：靈敏檢測病毒感染（如HIVRNA載量監(jiān)測、HBVDNA載量監(jiān)測）、評估抗病毒治療效果、病原體負荷定量。

*注意事項：嚴格的核酸提取質(zhì)量控制；引物和探針設(shè)計需特異性強，避免非特異性擴增；設(shè)置陰性對照（無模板對照）；標(biāo)準(zhǔn)品的建立和驗證；PCR污染防控。

(2)免疫印跡（WesternBlot，WB）：檢測病毒蛋白表達（如前所述，此處側(cè)重于病毒感染細胞的蛋白分析）。

*原理：檢測病毒感染細胞裂解物中病毒蛋白的表達水平和修飾狀態(tài)。

*具體步驟（類似檢測重組蛋白，但樣本為感染細胞裂解物）：

1.**細胞感染與處理：**細胞系或PBMC感染病毒，收集不同時間點的細胞。

2.**裂解：**使用裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑）裂解細胞，提取總蛋白。

3.**SDS電泳：**分離蛋白。

4.**蛋白轉(zhuǎn)移：**轉(zhuǎn)移至膜。

5.**封閉：**封閉非特異性位點。

6.**孵育一抗：**使用特異性抗體（如針對病毒衣殼蛋白、酶等）。

7.**孵育二抗：**使用酶標(biāo)二抗。

8.**洗滌與顯色：**洗滌并加入ECL底物顯色。

9.**成像與分析：**拍攝圖像，分析目標(biāo)病毒蛋白條帶的強度和分子量。

*結(jié)果判讀：比較感染組與對照組病毒蛋白的表達量變化，或檢測病毒蛋白的翻譯后修飾（如磷酸化）。

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