2025/11/13第十三章

分子發(fā)光分析法13.1.1分子熒光與磷光的產(chǎn)生過程13.1.2熒光光譜的基本特性13.1.3熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)關(guān)系13.1.4影響熒光強(qiáng)度的因素第一節(jié)

分子熒光與磷光分析法的基本原理Molecularluminescenceanalysis

Basicprinciplesofmolecularfluorescenceandphosphorescence2025/11/13概述

1.分子發(fā)光類型

分子激發(fā)模式：

光致發(fā)光：熒光、磷光化學(xué)能導(dǎo)致發(fā)光：化學(xué)發(fā)光

2.分子發(fā)光分析的特點(diǎn)

（1）靈敏度高：比吸收光譜法高2~3個(gè)數(shù)量級；（2）選擇性比較高：吸收普遍，吸光后并非都發(fā)光，

吸收波長與發(fā)射波長不盡相同

（3）試樣量少，操作簡便、線性范圍寬

（4）在生物醫(yī)學(xué)環(huán)境方面顯示優(yōu)越性（成像探針）2025/11/1313.1.1分子熒光與磷光的產(chǎn)生過程

由分子結(jié)構(gòu)理論，主要討論熒光及磷光的產(chǎn)生機(jī)理。1.分子能級與躍遷

分子能級比原子能級復(fù)雜；在每個(gè)電子能級上，都存在振動、轉(zhuǎn)動能級；基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級圖)；速度最快激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1，S2，

…

。第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1，T2，

…

。2025/11/132.電子激發(fā)態(tài)的多重度

電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1

S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；平行自旋比成對自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級比相應(yīng)單重態(tài)能級低；大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；

S0→T1

禁阻躍遷；通過其他途徑進(jìn)入(見能級圖)；進(jìn)入的幾率小。2025/11/133.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量。傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動弛預(yù)無輻射躍遷激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對大；熒光：10-7～10-9

s,第一激發(fā)單重態(tài)最低振動能級→基態(tài)；磷光：10-4～10s；第一激發(fā)三重態(tài)最低振動能級→基態(tài)。2025/11/13非輻射能量傳遞過程：

振動弛豫：同一電子能級內(nèi)以熱交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時(shí)間10-12

s。

內(nèi)轉(zhuǎn)換：同多重態(tài)電子能級中，等能級間無輻射能級交換通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。

外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。系間跨越：不同多重態(tài)有重疊轉(zhuǎn)動能級間的非輻射躍遷。改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋—軌道偶合進(jìn)行。2025/11/13S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫2025/11/13輻射能量傳遞過程：

熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)(多為S1→S0躍遷)，發(fā)射波長為

2的熒光；10-7～10-9

s。發(fā)射熒光的能量比分子吸收的小，波長長；

2>

2>

1；

磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)(T1→S0躍遷)

S0→激發(fā)→振動弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移→系間跨越→振動弛豫→T1發(fā)光速度很慢：10-4～100s。

光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間。2025/11/1313.1.2熒光光譜的基本特性

兩個(gè)特征光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。同步熒光光譜和三維熒光光譜。

1.熒光光譜類型（1）發(fā)射光譜（熒光光譜）

固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長)，化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射光波長關(guān)系曲線。2025/11/13（2）激發(fā)光譜

固定測量波長(選最大發(fā)射波長)，化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與照射光波長的關(guān)系曲線(圖中曲線I)激發(fā)光譜曲線的最高處，激發(fā)態(tài)分子最多，熒光強(qiáng)度最大。2025/11/132025/11/13（3）同步熒光光譜采用同步掃描技術(shù)（兩個(gè)單色器同步轉(zhuǎn)動），同時(shí)記錄所獲得的譜圖，稱為同步熒光光譜。2025/11/13同步掃描可采取三種方式進(jìn)行：

（1）固定波長差同步掃描法。保持激發(fā)波長和發(fā)射波長的波長差固定（

=

em–

ex=常數(shù)）。（2）固定能量差同步掃描法。激發(fā)波長和發(fā)射波長之間保持一個(gè)恒定的波數(shù)差（波數(shù)差=常數(shù)）。（3）可變波長（可變角）同步掃描法。使兩單色器分別以不同速率進(jìn)行掃描，即掃描過程中激發(fā)波長和發(fā)射波長的波長差是不固定的。2025/11/13同步熒光光譜的特點(diǎn)：（1）同步掃描至激發(fā)光譜與發(fā)射光譜重疊波長處，才同時(shí)產(chǎn)生信號。（2）

的選擇直接影響所得到的同步光譜的形狀、帶寬和信號強(qiáng)度。（3）譜圖簡單，譜帶窄，減小了譜圖重疊現(xiàn)象和散射光的影響，提高了分析測定的選擇性。（4）損失了其他光譜帶，提供的信息量減少。

2025/11/13(4)三維熒光光譜

以熒光強(qiáng)度、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜為坐標(biāo)可表現(xiàn)出激發(fā)波長和發(fā)射波長變化時(shí)熒光強(qiáng)度的變化信息，提供了更加完整的熒光光譜信息。

2025/11/132.熒光光譜的基本特征a.Stokes位移

激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，振動弛豫消耗了能量。b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)

電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖

2,

1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光(如

2)。c.

鏡像規(guī)則

通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關(guān)系。

2025/11/13鏡像規(guī)則的解釋:

基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似；

基態(tài)上的零振動能級與第一激發(fā)態(tài)的二振動能級之間的躍遷幾率最大，相反躍遷亦然。2025/11/13200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜2025/11/1318.1.3熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu)；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。熒光量子產(chǎn)率（

）：

熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過程的速率常數(shù)有關(guān)，如外轉(zhuǎn)換過程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射。2025/11/132.化合物的結(jié)構(gòu)與熒光

熒光素和酚酞結(jié)構(gòu)相似，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒有。為什么？（1）躍遷類型：*→熒光效率高，系間跨越過程速率常數(shù)小，有利熒光的產(chǎn)生。（2）共軛效應(yīng)：共軛度高，熒光效率高并產(chǎn)生紅移（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，有很強(qiáng)的熒光。（4）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電基，使熒光增強(qiáng)。2025/11/132025/11/1313.1.4影響熒光強(qiáng)度的因素

影響熒光強(qiáng)度的外部因素1.溶劑的影響

除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化。2.溫度的影響

熒光強(qiáng)度對溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加。3.溶液pH

對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制。2025/11/134.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象

自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。

內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光，如色氨酸中的重鉻酸鉀。2025/11/135.溶液熒光的猝滅

熒光猝滅：熒光分子與溶劑分子或其他分子間相互作用,使熒光強(qiáng)度減弱的現(xiàn)象。

猝滅劑：能引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)。

原因：碰撞猝滅（動態(tài)猝滅