2025年上海市醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)人員PCR上崗證考試題含答案一、單項(xiàng)選擇題（每題1分，共40分。每題只有一個(gè)正確答案，請將正確選項(xiàng)字母填入括號內(nèi)）1.在PCR擴(kuò)增體系中，Mg2?濃度對擴(kuò)增效率影響顯著。當(dāng)Mg2?濃度從1.0mmol/L提高到3.0mmol/L時(shí)，最可能出現(xiàn)的產(chǎn)物變化是（）A.特異性條帶亮度顯著增強(qiáng)，非特異條帶消失B.特異性條帶亮度先增后減，非特異條帶增多C.特異性條帶亮度持續(xù)減弱，引物二聚體減少D.所有條帶亮度均下降，擴(kuò)增失敗答案：B。Mg2?過低抑制Taq酶活性，過高降低特異性，3mmol/L時(shí)非特異擴(kuò)增概率顯著上升。2.實(shí)時(shí)熒光PCR中，若ROX參比染料信號在擴(kuò)增過程中持續(xù)下降，最可能提示（）A.反應(yīng)體系蒸發(fā)導(dǎo)致體積減少B.探針降解C.儀器光源老化D.模板濃度過高答案：A。ROX為被動參比，信號下降多因體系揮發(fā)，體積減少使?jié)舛认鄬ι撸瑹晒鈴?qiáng)度反而下降。3.采用ARMS-PCR檢測EGFRT790M突變，野生型引物3′端第2位引入額外錯(cuò)配堿基的目的是（）A.提高引物Tm值B.增強(qiáng)等位基因特異性C.減少引物二聚體D.便于后續(xù)測序答案：B。第2位錯(cuò)配可進(jìn)一步破壞野生型延伸，提高突變型檢出靈敏度。4.數(shù)字PCR中，陽性微滴熒光強(qiáng)度普遍低于陰性微滴基線，最可能的原因是（）A.探針濃度過高B.退火溫度過低C.模板降解D.微滴生成油相污染答案：C。模板降解導(dǎo)致可擴(kuò)增片段減少，終點(diǎn)熒光強(qiáng)度降低。5.以下哪種質(zhì)控策略最能直接監(jiān)測核酸提取過程中的抑制物殘留（）A.內(nèi)源內(nèi)標(biāo)B.外源內(nèi)標(biāo)C.提取空白D.擴(kuò)增空白答案：B。外源內(nèi)標(biāo)與靶標(biāo)共提取共擴(kuò)增，其Ct值變化直接反映抑制物存在。6.采用磁珠法提取血清HBVDNA時(shí)，最后一步洗脫體積由100μL減至50μL，對檢測結(jié)果的影響是（）A.靈敏度提高1倍，精密度下降B.靈敏度提高1倍，精密度不變C.靈敏度提高2倍，精密度提高D.靈敏度不變，精密度提高答案：A。濃度提高1倍，但取樣誤差占比例增大，精密度下降。7.在一代測序峰圖中，出現(xiàn)重疊峰且信號強(qiáng)度比約為1:1，最可能提示（）A.引物污染B.模板存在雜合缺失C.測序引物結(jié)合位點(diǎn)突變D.毛細(xì)管電泳進(jìn)樣過量答案：B。雜合缺失導(dǎo)致野生型與缺失型等位基因并存，峰圖疊加。8.實(shí)時(shí)熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.52，對應(yīng)的擴(kuò)增效率為（）A.93%B.98%C.102%D.107%答案：A。效率=10^(-1/斜率)-1=10^(1/3.52)-1≈0.93。9.采用SYBRGreenI法檢測miRNA時(shí)，熔解曲線出現(xiàn)雙峰，較低Tm峰為78℃，較高Tm峰為82℃，下一步最佳處理是（）A.直接報(bào)告陽性B.提高退火溫度2℃再實(shí)驗(yàn)C.進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)產(chǎn)物大小D.降低引物濃度答案：C。需確認(rèn)78℃峰是否為引物二聚體，電泳最直觀。10.以下關(guān)于UNG酶防污染體系的描述，錯(cuò)誤的是（）A.最佳作用溫度為50℃B.對dUTP摻入的擴(kuò)增產(chǎn)物有效C.對天然DNA模板無影響D.在95℃滅活答案：A。UNG酶最適溫度為25-37℃，50℃活性下降。11.采用多重PCR檢測呼吸道病毒，若其中一靶標(biāo)consistently缺失，其余靶標(biāo)正常，最不可能的原因是（）A.該靶標(biāo)引物降解B.該靶標(biāo)探針熒光通道損壞C.該靶標(biāo)模板濃度極高導(dǎo)致競爭抑制D.該靶標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物過長答案：C。模板濃度過高導(dǎo)致Ct值前移，而非缺失。12.數(shù)字PCR計(jì)算拷貝數(shù)時(shí)，若陽性微滴數(shù)為850，總微滴數(shù)為3000，Poisson校正后濃度為（）A.0.35copies/μLB.0.40copies/μLC.0.45copies/μLD.0.50copies/μL答案：B。-ln(1-850/3000)=0.40。13.實(shí)時(shí)熒光PCR中，F(xiàn)AM通道出現(xiàn)“S”型曲線但Ct值較歷史數(shù)據(jù)延遲3個(gè)循環(huán)，排除試劑因素后，首先應(yīng)檢查（）A.模板加樣量B.儀器光源C.反應(yīng)體系pHD.離心機(jī)轉(zhuǎn)速答案：A。加樣誤差是最常見原因。14.采用qPCR檢測BCR-ABL融合基因，國際標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)換因子為0.89，若實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果為0.10%，轉(zhuǎn)換為IS值為（）A.0.089%B.0.11%C.0.08%D.0.12%答案：A。0.10%×0.89=0.089%。15.以下哪種情況最可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果（）A.引物3′端與模板錯(cuò)配B.探針5′端標(biāo)記熒光基團(tuán)脫落C.反應(yīng)體系中加入過量BSAD.退火溫度比Tm高2℃答案：A。3′端錯(cuò)配完全阻斷延伸。16.采用磁珠法提取FFPE組織DNA時(shí)，80℃加熱過度延長可導(dǎo)致（）A.片段化加劇B.蛋白殘留增加C.磁珠聚集D.乙醇?xì)埩舸鸢福篈。高溫加速DNA降解。17.實(shí)時(shí)熒光PCR中，若標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.985，但斜率較理想值偏移10%，應(yīng)優(yōu)先采取的措施是（）A.重新制備標(biāo)準(zhǔn)品梯度B.更換熒光通道C.增加重復(fù)次數(shù)D.調(diào)整基線設(shè)置答案：A。斜率偏移提示標(biāo)準(zhǔn)品稀釋誤差。18.采用CRISPR-Cas12a檢測HPV16，熒光報(bào)告探針被切斷后，信號增強(qiáng)的機(jī)制是（）A.淬滅基團(tuán)遠(yuǎn)離熒光基團(tuán)B.熒光基團(tuán)被激活C.探針構(gòu)象改變D.背景熒光降低答案：A。切斷后淬滅效應(yīng)消失。19.以下關(guān)于PCR產(chǎn)物長期保存的描述，正確的是（）A.4℃可穩(wěn)定存放1年B.-20℃需加甘油防凍C.TE緩沖液比純水更易導(dǎo)致降解D.干冰運(yùn)輸需避免反復(fù)凍融答案：D。反復(fù)凍融機(jī)械剪切加劇。20.采用微滴式數(shù)字PCR檢測腫瘤cfDNA，若微滴生成后立即擴(kuò)增，未進(jìn)行熱啟動，最可能出現(xiàn)的異常是（）A.陽性微滴比例偏高B.陰性微滴熒光漂移C.微滴融合D.假陽性率升高答案：D。低溫下引物非特異結(jié)合導(dǎo)致假陽性。21.實(shí)時(shí)熒光PCR中，若基線設(shè)置過高，對Ct值的影響是（）A.提前B.延遲C.無影響D.隨機(jī)波動答案：B。過高基線掩蓋真實(shí)信號起點(diǎn)。22.采用ARMS-PCR檢測KRAS突變，野生型對照出現(xiàn)微弱條帶，最可能提示（）A.引物特異性不足B.模板過量C.循環(huán)數(shù)不足D.電泳上樣量低答案：A。需優(yōu)化引物或增加錯(cuò)配堿基。23.以下哪種方法最適合驗(yàn)證qPCR檢測限（）A.連續(xù)稀釋陰性樣本B.檢測已知低濃度陽性樣本20次C.比較不同試劑盒D.加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)答案：B。LOD定義為95%檢出最低濃度。24.采用SYBRGreenI法進(jìn)行基因表達(dá)分析，若內(nèi)參基因與靶基因擴(kuò)增效率差異>5%，應(yīng)優(yōu)先采用（）A.2^-ΔΔCt法B.Pfaffl法C.標(biāo)準(zhǔn)曲線法D.相對定量法答案：B。Pfaffl法引入效率校正。25.數(shù)字PCR中，若陰性微滴熒光強(qiáng)度分布變寬，最可能提示（）A.探針降解B.微滴體積不均一C.背景熒光升高D.儀器增益過高答案：C。背景升高使分布拖尾。26.實(shí)時(shí)熒光PCR中，若ROX信號在擴(kuò)增后期突然升高，最可能提示（）A.蒸發(fā)嚴(yán)重B.探針?biāo)釩.氣泡產(chǎn)生D.光源波動答案：C。氣泡散射導(dǎo)致信號跳升。27.采用磁珠法提取血漿循環(huán)腫瘤DNA，若carrierRNA過量，對下游PCR的影響是（）A.抑制擴(kuò)增B.提高靈敏度C.無影響D.增加背景答案：A。carrierRNA競爭結(jié)合磁珠，降低靶標(biāo)回收。28.以下關(guān)于PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)壓差要求，正確的是（）A.試劑準(zhǔn)備區(qū)相對陽性擴(kuò)增區(qū)為正壓B.樣本制備區(qū)相對試劑準(zhǔn)備區(qū)為負(fù)壓C.擴(kuò)增區(qū)相對樣本制備區(qū)為正壓D.各區(qū)壓差應(yīng)>20Pa答案：A。防止擴(kuò)增產(chǎn)物逆向污染。29.采用qPCR檢測SARS-CoV-2，若內(nèi)參基因Ct值較平時(shí)提前2個(gè)循環(huán)，但靶基因Ct值不變，最可能提示（）A.采樣質(zhì)量提高B.靶基因發(fā)生突變C.抑制物減少D.試劑批間差答案：A。內(nèi)參提前提示采樣細(xì)胞量增多。30.實(shí)時(shí)熒光PCR中，若標(biāo)準(zhǔn)曲線截距為38，提示（）A.靈敏度極高B.靈敏度極低C.擴(kuò)增效率低D.背景熒光高答案：B。截距高提示檢測起始拷貝數(shù)多，靈敏度差。31.采用CRISPR-Cas13a進(jìn)行RNA檢測，熒光報(bào)告探針序列設(shè)計(jì)的關(guān)鍵是（）A.避免二級結(jié)構(gòu)B.5′端標(biāo)記FAMC.長度>30ntD.3′端磷酸化答案：A。二級結(jié)構(gòu)阻礙Cas13a切割。32.以下關(guān)于PCR儀溫度校準(zhǔn)的描述，錯(cuò)誤的是（）A.需使用可追溯標(biāo)準(zhǔn)溫度計(jì)B.每年至少一次C.只需檢測95℃和60℃兩點(diǎn)D.需記錄偏差修正值答案：C。需覆蓋全程溫度梯度。33.采用微滴式數(shù)字PCR檢測融合基因，若野生型微滴熒光強(qiáng)度出現(xiàn)雙峰，最可能提示（）A.探針濃度不足B.野生型模板存在拷貝數(shù)變異C.微滴體積不均D.退火溫度過低答案：B?？截悢?shù)差異導(dǎo)致終點(diǎn)熒光分層。34.實(shí)時(shí)熒光PCR中，若擴(kuò)增曲線在平臺期出現(xiàn)鋸齒狀波動，最可能提示（）A.蒸發(fā)B.電源不穩(wěn)C.探針降解D.光源衰減答案：B。電壓波動導(dǎo)致信號采集噪聲。35.采用ARMS-PCR檢測β-地貧突變，若突變型引物3′端與模板存在A:C錯(cuò)配，延伸效率下降約為（）A.10倍B.100倍C.1000倍D.10000倍答案：C。單個(gè)3′端錯(cuò)配降低效率約1000倍。36.以下關(guān)于PCR產(chǎn)物克隆測序的描述，正確的是（）A.需使用Taq酶擴(kuò)增便于加A尾B.需使用高保真酶減少錯(cuò)誤C.無需凝膠回收D.可直接使用菌落PCR鑒定答案：A。Taq酶加A尾提高TA克隆效率。37.采用qPCR進(jìn)行基因表達(dá)分析，若靶基因與內(nèi)參基因Tm值相差>5℃，應(yīng)優(yōu)先采用（）A.兩步法擴(kuò)增B.三步法擴(kuò)增C.降落PCRD.快速PCR答案：B。三步法可分別優(yōu)化退火溫度。38.數(shù)字PCR中，若陽性微滴數(shù)占總微滴數(shù)>30%，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)（）A.直接采用Poisson公式B.稀釋樣本后重做C.增加微滴數(shù)D.降低熒光閾值答案：B。高陽性率超出Poisson線性范圍。39.實(shí)時(shí)熒光PCR中，若標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.999，但重復(fù)孔間Ct值SD=0.5，提示（）A.系統(tǒng)誤差B.隨機(jī)誤差C.標(biāo)準(zhǔn)品問題D.儀器問題答案：B。SD大提示操作隨機(jī)誤差。40.采用SYBRGreenI法進(jìn)行HRM分析，若突變型與野生型Tm差值<0.5℃，最佳改進(jìn)策略是（）A.增加擴(kuò)增子長度B.縮短擴(kuò)增子至<100bpC.提高M(jìn)g2?濃度D.降低模板量答案：B。短片段放大Tm差異。二、多項(xiàng)選擇題（每題2分，共30分。每題有兩個(gè)或兩個(gè)以上正確答案，請將所有正確選項(xiàng)字母填入括號內(nèi)，漏選、錯(cuò)選均不得分）41.以下哪些措施可有效降低PCR假陽性風(fēng)險(xiǎn)（）A.使用dUTP-UNG系統(tǒng)B.分區(qū)操作C.增加循環(huán)數(shù)D.使用帶濾芯槍頭E.紫外照射工作臺答案：A、B、D、E。增加循環(huán)數(shù)提高靈敏度但易致假陽性。42.實(shí)時(shí)熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線出現(xiàn)“倒S”形，可能原因包括（）A.標(biāo)準(zhǔn)品降解B.高濃度抑制C.移液誤差D.熒光閾值設(shè)置過低E.探針濃度過高答案：A、B、C。高濃度抑制導(dǎo)致低濃度Ct值反常。43.以下哪些指標(biāo)可用于評估數(shù)字PCR性能（）A.動態(tài)范圍B.精確度C.重復(fù)性D.靈敏度E.特異性答案：A、B、C、D、E。44.采用磁珠法提取核酸時(shí)，可能導(dǎo)致得率下降的因素有（）A.樣本裂解不充分B.磁珠用量不足C.洗脫體積過大D.乙醇?xì)埩鬍.CarrierRNA過量答案：A、B、E。洗脫體積大降低濃度但總得率不變；乙醇?xì)埩粢种芇CR但不一定降低得率。45.以下哪些情況需重新驗(yàn)證qPCR方法（）A.更換引物探針廠家B.更換儀器型號C.更改樣本類型D.更改核酸提取試劑E.更改操作人員答案：A、B、C、D。人員變更需培訓(xùn)但無需全面驗(yàn)證。46.實(shí)時(shí)熒光PCR中，可導(dǎo)致Ct值延遲的因素有（）A.模板降解B.抑制物殘留C.退火溫度過高D.引物濃度過低E.探針熒光基團(tuán)脫落答案：A、B、C、D。探針脫落導(dǎo)致信號降低但Ct不一定延遲。47.以下哪些屬于PCR實(shí)驗(yàn)室“三區(qū)域”劃分的基本要素（）A.人員流向B.物品流向C.空氣流向D.廢物流向E.數(shù)據(jù)流向答案：A、B、C、D。48.采用ARMS-PCR檢測突變時(shí)，可提高特異性的策略有（）A.引入3′端錯(cuò)配B.縮短引物長度C.提高退火溫度D.降低模板量E.使用高保真酶答案：A、C。縮短引物降低Tm，可能降低特異性。49.以下哪些屬于數(shù)字PCR的優(yōu)勢（）A.絕對定量B.高靈敏度C.高耐受抑制物D.需標(biāo)準(zhǔn)曲線E.可檢測稀有突變答案：A、B、C、E。無需標(biāo)準(zhǔn)曲線。50.實(shí)時(shí)熒光PCR中，可導(dǎo)致平臺期熒光強(qiáng)度下降的因素有（）A.探針淬滅B.產(chǎn)物降解C.蒸發(fā)D.光源衰減E.熒光基團(tuán)光漂白答案：B、C、E。51.以下哪些措施可減少PCR引物二聚體形成（）A.降低引物濃度B.提高退火溫度C.縮短延伸時(shí)間D.使用熱啟動酶E.優(yōu)化Mg2?濃度答案：A、B、D、E。縮短延伸時(shí)間無直接作用。52.采用qPCR進(jìn)行基因表達(dá)分析時(shí)，可接受的擴(kuò)增效率范圍包括（）A.90%B.95%C.100%D.105%E.110%答案：A、B、C、D。>110%提示非特異擴(kuò)增。53.以下哪些屬于PCR實(shí)驗(yàn)室生物安全二級要求（）A.生物安全柜B.高壓滅菌器C.洗眼器D.自動門禁E.負(fù)壓病房答案：A、B、C。自動門禁非強(qiáng)制；負(fù)壓病房為三級要求。54.實(shí)時(shí)熒光PCR中，若陰性對照出現(xiàn)陽性信號，可能原因有（）A.污染B.探針降解C.基線設(shè)置錯(cuò)誤D.熒光閾值過低E.儀器背景噪聲答案：A、C、D、E。探針降解導(dǎo)致信號降低。55.采用數(shù)字PCR檢測融合基因，可導(dǎo)致假陰性的因素有（）A.探針結(jié)合位點(diǎn)突變B.模板片段化C.微滴融合D.退火溫度過高E.引物二聚體答案：A、B、D。微滴融合影響定量但不一定假陰性；引物二聚體致假陽性。三、判斷題（每題1分，共15分。正確請?zhí)睢啊獭?，錯(cuò)誤請?zhí)睢啊痢保?6.實(shí)時(shí)熒光PCR中，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2>0.99即可認(rèn)為擴(kuò)增效率一定合格。（）答案：×。R2僅反映線性，需同時(shí)滿足斜率。57.數(shù)字PCR無需標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)絕對定量。（）答案：√。58.采用SYBRGreenI法時(shí)，熔解曲線出現(xiàn)單峰即可排除非特異擴(kuò)增。（）答案：×。可能為大小相近的非特異條帶。59.PCR實(shí)驗(yàn)室各區(qū)域可共用同一套移液器，只要更換槍頭即可。（）答案：×。需專用移液器防污染。60.實(shí)時(shí)熒光PCR中，Ct值與初始模板量呈線性反比關(guān)系。（）答案：×。僅在對數(shù)期內(nèi)成立。61.采用ARMS-PCR檢測突變時(shí)，野生型引物完全無產(chǎn)物才視為特異性良好。（）答案：×。允許極低背景。62.數(shù)字PCR對PCR抑制物的耐受能力高于qPCR。（）答案：√。63.實(shí)時(shí)熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率絕對值越大，靈敏度越高。（）答案：×。斜率絕對值大提示效率低。64.采用磁珠法提取核酸時(shí)，乙醇?xì)埩艨梢种葡掠蜳CR。（）答案：√。65.實(shí)時(shí)熒光PCR中，探針降解可導(dǎo)致Ct值提前。（）答案：×。信號降低，Ct延遲或無效。66.PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，使用高電壓可縮短時(shí)間且不影響分辨率。（）答案：×。高電壓產(chǎn)熱加劇，條帶模糊。67.數(shù)字PCR中，微滴數(shù)越多，定量精確度越高。（）答案：√。68.采用qPCR進(jìn)行基因表達(dá)分析時(shí)，內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定即可無需驗(yàn)證。（）答案：×。需驗(yàn)證穩(wěn)定性。69.實(shí)時(shí)熒光PCR中，平臺期熒光強(qiáng)度與初始模板量成正比。（）答案：×。平臺期受多種因素限制。70.PCR實(shí)驗(yàn)室廢液需經(jīng)含氯消毒劑處理后方可排入下水道。（）答案：√。四、簡答題（每題5分，共25分）71.簡述實(shí)時(shí)熒光PCR中，如何利用標(biāo)準(zhǔn)曲線評估方法性能并列出可接受標(biāo)準(zhǔn)。答案：1.制備至少5個(gè)數(shù)量級的標(biāo)準(zhǔn)品梯度，每個(gè)濃度重復(fù)3次；2.以Ct值為縱坐標(biāo)，log??(拷貝數(shù))為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸；3.可接受標(biāo)準(zhǔn)：R2≥0.99，斜率-3.1~-3.6（效率90-110%），截距合理（如15-35Ct）；4.計(jì)算檢測限（LOD）為95%檢出最低濃度；5.計(jì)算定量限（LOQ）為CV<20%且偏差<±20%的最低濃度；6.重復(fù)驗(yàn)證至少3次，確保穩(wěn)定。72.數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)中，如何優(yōu)化微滴生成步驟以提高成功率？答案：1.確保樣本與微滴生成油溫度一致（20-25℃），避免溫差導(dǎo)致微滴破裂；2.樣本體積與油相比例嚴(yán)格按說明書，過量油相致微滴過?。?.避免氣泡：移液時(shí)緩慢吸打，離心后靜置2min；4.模板濃度勿過高，>10?copies/μL易致微滴融合；5.使用低吸附槍頭及PCR管，減少核酸吸附；6.微滴生成后30min內(nèi)開始PCR，防止融合；7.若微滴數(shù)<80%理論值，檢查芯片或卡槽密封性，重新密封或更換耗材。73.簡述ARMS-P