演講人：日期:檢驗科急性白血病實驗室檢驗要點培訓指南目錄CATALOGUE01概述與基礎02標本采集與處理03形態(tài)學篩查方法04免疫表型檢測05分子遺傳學檢驗06結果報告與培訓實施PART01概述與基礎急性白血病定義與分類急性白血病定義急性白血病是一種造血干細胞惡性克隆性疾病，其特征為骨髓中異常原始細胞（如淋巴母細胞或髓系原始細胞）大量增殖并抑制正常造血功能，導致貧血、出血和感染等臨床表現(xiàn)。01急性淋巴細胞性白血?。ˋLL）屬于急性白血病的一種亞型，主要表現(xiàn)為淋巴系前體細胞（淋巴母細胞）在骨髓、血液和其他組織中異常增殖，占兒童急性白血病的75%-80%，成人急性白血病的20%-30%。02急性髓系白血?。ˋML）以髓系原始細胞異常增殖為特征，根據(jù)FAB分型可分為M0-M7共8個亞型，臨床表現(xiàn)和預后差異較大，需結合細胞形態(tài)學、免疫表型和分子遺傳學進行綜合診斷。03混合表型急性白血?。∕PAL）同時表達淋系和髓系標記的罕見類型，診斷需符合WHO標準（如EGIL或WHO2016分型），治療難度大且預后較差。04實驗室檢驗核心流程血常規(guī)與血涂片檢查通過全血細胞計數(shù)（CBC）觀察白細胞計數(shù)、血紅蛋白及血小板水平，血涂片鏡檢可發(fā)現(xiàn)原始細胞比例增高及“白血病裂孔”現(xiàn)象（即少量成熟細胞與大量原始細胞并存）。骨髓穿刺與形態(tài)學分析骨髓涂片需進行瑞氏-吉姆薩染色，計算原始細胞比例（≥20%為急性白血病診斷閾值），并描述細胞形態(tài)特征（如ALL的淋巴母細胞核仁明顯、胞漿少）。流式細胞術免疫分型通過CD45/SSC設門結合系列抗體（如淋系標記CD19、CD10，髓系標記CD13、CD33）明確白血病細胞來源，對ALL需區(qū)分B細胞型（占85%）與T細胞型（占15%）。細胞遺傳學與分子生物學檢測核型分析可識別t(9;22)(Ph染色體)、t(12;21)等特征性異常；PCR或NGS技術檢測BCR-ABL1、ETV6-RUNX1等融合基因，為危險度分層提供依據(jù)。培訓需覆蓋急性白血病的病理生理機制、WHO2016分類標準及臨床分期系統(tǒng)，重點理解ALL的生物學特性與預后因素（如年齡、白細胞計數(shù)、遺傳學異常）。01040302培訓目標與范圍掌握基礎理論包括骨髓穿刺標本采集標準化流程、血涂片/骨髓涂片制備與染色技巧、流式細胞儀操作及數(shù)據(jù)分析要點，確保檢驗結果準確性和可重復性。規(guī)范操作技能培訓應強調整合實驗室數(shù)據(jù)（如形態(tài)學描述+免疫表型+遺傳學結果）形成綜合診斷報告的能力，并能識別高危標志物（如ALL的IKZF1缺失、CRLF2過表達）。熟悉報告解讀學習室內質控（如流式抗體panel驗證）和室間質評要求，了解與臨床、病理科的溝通要點，確保檢驗結果對治療決策（如靶向藥物選擇）的支持作用。質量控制與多學科協(xié)作PART02標本采集與處理血液和骨髓標本收集標準標本標識與記錄采集后須立即標注患者信息、采集時間及部位，同步填寫檢驗申請單，確保臨床病史（如既往治療史）完整傳遞至實驗室。骨髓穿刺操作要求骨髓標本需由經驗豐富的醫(yī)師操作，穿刺部位首選髂后上棘，抽取量控制在0.5-1.0mL，立即與抗凝劑混合并輕柔混勻，防止凝固或細胞破壞。靜脈采血規(guī)范采用無菌技術采集外周靜脈血，推薦使用EDTA抗凝管，避免溶血或凝血，采血量需滿足后續(xù)形態(tài)學、免疫分型及分子檢測需求。臨時保存條件運輸過程中需避免劇烈震蕩和極端溫度，使用專用生物安全運輸箱，內置冰袋維持2-8℃環(huán)境，確保標本穩(wěn)定性。運輸環(huán)境控制特殊檢測標本處理流式細胞術檢測標本需避光保存，分子檢測標本需分離血漿或單個核細胞后-80℃凍存，避免反復凍融。血液標本在室溫下保存不超過4小時，骨髓標本需在2小時內處理；若需延遲檢測，血液可置于4℃冷藏，骨髓需加入細胞保存液并冷藏。標本保存與運輸要求對溶血、凝血、標識不清或運輸超時的標本需記錄并反饋臨床，必要時重新采集。標本拒收標準骨髓涂片制備前需低速離心（1500rpm，10分鐘）以保留有核細胞，外周血涂片需新鮮制備，避免細胞退變。檢測前離心參數(shù)01020304定期檢查EDTA抗凝管填充量，避免過量或不足導致假性血小板減少或細胞形態(tài)異常?？鼓齽┍壤炞C每日檢測前需運行質控品校準流式細胞儀、血細胞分析儀，確保CD45/SSC設門及細胞計數(shù)準確性。儀器校準與質控質量控制注意事項PART03形態(tài)學篩查方法血紅蛋白與紅細胞參數(shù)異常急性白血病患者常出現(xiàn)血紅蛋白降低、紅細胞體積分布寬度（RDW）增高，提示貧血可能由骨髓造血功能受抑制或無效造血導致。需結合紅細胞平均體積（MCV）區(qū)分正細胞性或大細胞性貧血。白細胞計數(shù)與分類異常白細胞總數(shù)可表現(xiàn)為增高、正?；驕p少，但常伴隨原始細胞比例升高。中性粒細胞絕對值減少是骨髓浸潤的典型表現(xiàn)，需警惕感染風險。血小板減少與形態(tài)異常血小板計數(shù)通常顯著降低，且可能出現(xiàn)巨大血小板或顆粒缺失等病態(tài)造血特征，需與免疫性血小板減少癥鑒別。全血細胞計數(shù)異常分析外周血涂片檢查要點原始細胞識別與分類重點觀察有無原始細胞，記錄其比例及形態(tài)特征（如核染色質細致、核仁明顯）。需區(qū)分髓系（Auer小體）與淋系原始細胞（胞漿稀少）。粒細胞病態(tài)造血表現(xiàn)檢查中性粒細胞是否存在假性Pelger-Huet畸形（分葉過少）或毒性顆粒，這些現(xiàn)象常見于骨髓增生異常綜合征（MDS）轉化白血病。紅細胞形態(tài)學評估注意有無嗜多色性紅細胞、靶形紅細胞或破碎紅細胞，這些改變可能提示骨髓纖維化或微血管病性溶血。通過低倍鏡觀察骨髓有核細胞占比，急性白血病通常表現(xiàn)為增生極度活躍，但少數(shù)病例可因骨髓纖維化導致“干抽”。骨髓增生程度判定高倍鏡下計數(shù)至少500個有核細胞，原始細胞≥20%為急性白血病診斷閾值。注意區(qū)分早幼粒細胞與原始粒細胞。原始細胞比例計算評估巨核細胞數(shù)量是否減少，同時觀察有無網(wǎng)狀纖維增生（需結合銀染色），這對治療方案選擇有指導意義。巨核細胞與基質改變骨髓穿刺初步評估PART04免疫表型檢測流式細胞術應用原理流體動力學聚焦原理樣本細胞在鞘液包裹下形成單細胞流，通過激光束時產生前向散射光（FSC）和側向散射光（SSC），分別反映細胞大小和內部復雜度。結合熒光標記抗體，可同時檢測多個細胞表面/胞內抗原。多色熒光檢測技術細胞分選功能配置采用不同激發(fā)波長的熒光染料（如FITC、PE、APC）標記特異性抗體，通過光電倍增管（PMT）捕獲熒光信號，實現(xiàn)單次檢測中10-30種參數(shù)的同步分析，顯著提高白血病分型的精確度。部分高端流式細胞儀配備分選模塊，通過液滴充電偏轉技術（如BDFACSAria），可基于特定表型特征分選出目標細胞群，純度可達99%，用于后續(xù)分子生物學研究。123CD標志物檢測步驟抗體組合方案設計根據(jù)EGIL標準選擇核心抗體組合，如B系白血病檢測CD19/CD10/CD34/CD45，T系檢測CD7/CD3/CD4/CD8/CD1a。需設置同型對照和熒光補償對照，確保數(shù)據(jù)準確性。03數(shù)據(jù)采集與分析要點上機前用校準微球調整儀器參數(shù)，采集至少10,000個細胞事件。分析時采用"CD45/SSC"雙參數(shù)設門策略，區(qū)分原始細胞群，通過Kaluza或FlowJo軟件計算各標志物陽性率。0201樣本制備標準化流程采集骨髓或外周血后，需采用密度梯度離心法分離單個核細胞，調整細胞濃度至1×10^6/mL。使用紅細胞裂解液（如BDPharmLyse）處理10分鐘，避免紅細胞干擾檢測結果。B-ALL診斷標準需滿足CD19+且伴隨CD10+/CD34+，胞漿CD79a陽性。根據(jù)CD20表達強度可分為pro-B（CD10-）、common-B（CD10+）和pre-B（CD10+且胞漿μ鏈+）亞型，各型預后差異顯著。T-ALL特征性標志表現(xiàn)為CD7+/CD3+（胞漿或膜），常伴CD1a/CD4/CD8共表達。根據(jù)胸腺分化階段分為pro-T（CD2+CD5+）、pre-T（CD7+CD5+）和皮質/髓質T-ALL，其中CD1a+皮質型對治療反應較差?；旌媳硇桶籽。∕PAL）判定依據(jù)WHO2016標準，需滿足髓系（MPO+或CD117/CD13/CD33中2項+）及淋系（CD19/CD22/CD79a或CD3/CD5中2項+）雙系標記，此類病例需進行分子遺傳學驗證。亞型鑒別診斷標準PART05分子遺傳學檢驗細胞遺傳學分析技術高分辨率染色體技術采用同步化培養(yǎng)和特殊顯帶方法提升分辨率，能夠識別微小缺失或重復（如5q-、7q-等），對隱匿性異常檢出率顯著提高。光譜核型分析（SKY）通過熒光標記全染色體探針實現(xiàn)多色核型分析，快速鑒別復雜染色體易位（如MLL重排），尤其適用于傳統(tǒng)方法難以判定的結構異常。常規(guī)染色體核型分析通過G顯帶技術對骨髓細胞中期分裂象進行染色體形態(tài)和數(shù)量分析，可檢測非整倍體、易位、缺失等異常，是急性白血病分型和預后評估的基礎手段。FISH與PCR檢測流程熒光原位雜交（FISH）標準化操作包括樣本預處理、探針雜交、洗脫及信號判讀，需嚴格把控探針特異性（如BCR-ABL1、PML-RARA融合基因探針），并設置內對照排除假陰性。多重PCR技術應用針對常見融合基因（如RUNX1-RUNX1T1、CBFB-MYH11）設計引物體系，通過電泳或毛細管電泳分離產物，需注意引物退火溫度優(yōu)化和污染防控。實時定量PCR（qPCR）動態(tài)監(jiān)測建立標準曲線定量檢測微小殘留?。∕RD），要求采用國際標準化引物/探針組合（如WT1表達檢測），并定期進行室間質評驗證。靶向測序panel設計原始數(shù)據(jù)經質控、比對、變異注釋后，需依據(jù)ACMG指南對突變進行臨床意義分級，重點報告致病性突變（如IDH1/2、TP53突變）。生物信息學分析流程技術局限性管理針對NGS檢測中嵌合體低比例突變（VAF<5%）的漏檢風險，建議聯(lián)合ddPCR等高靈敏度技術補充驗證，確保結果可靠性。覆蓋白血病相關基因（FLT3-ITD、NPM1、CEBPA等）的熱點突變區(qū)域，需結合臨床需求平衡通量與成本，同時納入內參基因保證測序深度均一性。NGS在分子診斷中的應用PART06結果報告與培訓實施01多參數(shù)關聯(lián)分析結合形態(tài)學、免疫分型、細胞遺傳學和分子生物學結果，綜合分析白血病亞型特征，避免單一指標誤判。需重點關注異常細胞比例、抗原表達模式及基因突變相關性。臨床與實驗室數(shù)據(jù)整合將實驗室檢測結果與患者癥狀、體征及既往病史對比，解釋結果時需考慮化療后殘留病灶動態(tài)變化或繼發(fā)性白血病可能性。臨界值判定與復檢標準明確異常結果的閾值范圍（如原始細胞≥20%），制定復檢流程，對模糊結果建議會診或補充檢測（如流式細胞術驗證）。綜合結果解釋方法0203報告撰寫規(guī)范03審核與簽發(fā)流程實行雙人核對制度，高級職稱人員復核疑難報告，電子簽名需關聯(lián)操作追蹤記錄以確?？勺匪菪?。02術語標準化與風險提示采用WHO分類命名（如B-ALL伴BCR-ABL1），對高風險指標（如TP53突變）需加注警示語，并建議后續(xù)檢測項目（如微小殘留病監(jiān)測）。01結構化模板設計報告需包含標本信息、檢測方法、結果描述（如免疫表型CD34+/CD19+）、結論分級（確診/疑似/陰性）及備注欄（注明樣本局限性或技術干