準(zhǔn)豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白抗體鑭系熒光免疫層析法Lanthanidefluorescenceimmunochromatographicassay2025-11-11發(fā)布2025-11-11實施本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件涉及專利。本文件由四川省動物疫病預(yù)防控制中心提出。本文件由中國獸醫(yī)協(xié)會歸口。本文件起草單位：成都海關(guān)技術(shù)中心，成都微瑞生物科技有限公司、成都市動物疫病預(yù)防控制中心、新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所(自治區(qū)動物疾病預(yù)防控制中心)、新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作本文件主要起草人：楊苗、林華、李桂黎、張毅、章建、岳建國、裴超信、陳瑛琪、李敏、陳濤云、李巖、張家瑞、吳俊清、邵靚、徐蜜、周瀟瀟、劉亞濤、古麗曼·木哈買提拜、李舵、加米拉·玉山巴依、居馬別克·夏拉巴依、張旭、李杰、趙化芳、王澤洲。工T/CVMA314—2025本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)提請注意，聲明符合本文件時，可能涉及到條目5、7、9、10、附錄A和附錄B地址：四川省成都市高新西區(qū)科新路6號。1僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本GB19489實驗室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范PRRSV:豬繁殖與呼吸道綜合征病毒(PorciPVC:聚氯乙烯塑料材料(Polyvinylchloride)2號值(T/C比值),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算抗體效價。6.1豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白，制備方法見附錄A。6.2豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白抗體檢測卡，制備方法見附錄B。6.3相關(guān)試劑，配制方法見附錄C。7.2注射器(5mL)。7.3離心機(jī)(最大離心力15000r/min)。7.42℃~8℃冰箱，-20℃冰箱。7.5便攜式鑭系熒光分析儀，操作方法見附錄E。7.6電子天平(精確度為0.1g)。按照NY/T541規(guī)定進(jìn)行樣品的采集和處理。無菌注射器靜脈采血，不少于3mL,用自然析出法分按照NY/T541規(guī)定進(jìn)行血清樣品的存放與運(yùn)輸。血清樣品置2℃~8℃條件下保存。若超過一周檢測，置于-20℃以下冷凍保存。將待檢血清樣品用樣品稀釋液按1:50進(jìn)行稀釋。3避光置于室溫作用15min后，將檢測卡放入便攜式鑭系熒光分析儀檢測。分析儀通過LED燈激發(fā)并收集檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)上的熒光信號，分析儀系統(tǒng)軟件自帶計算功能，將熒光信號值轉(zhuǎn)換成數(shù)值(T線和C線),由T、C熒光信號值轉(zhuǎn)當(dāng)儀器完成讀值后，如果檢測值顯示“無效”新檢測。豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白抗體檢測值≥32,判為抗體陽性；檢測值<32,判為抗體陰性。4(資料性)A.1目的基因的擴(kuò)增pET-32a(+)表達(dá)載體及PMD-18T可購買商品化試劑。根據(jù)pET-32a(+)表達(dá)載體的特點(diǎn)設(shè)計兩擴(kuò)增出目的片段N蛋白基因，擴(kuò)增條件：94℃變性3min,94℃45s,56℃復(fù)性90s,72℃延伸90s,進(jìn)行30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。A.2目的基因的克隆和陽性重組子的篩選PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后切膠回收，與PMD-18T克隆載體16℃過夜連接后，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)用限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI分別酶切T目的片段和pET-32a(+)雙酶切后的大片段，用T4連接酶將兩者16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞，LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)8h～10h,挑取單菌落培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒，用PCR及限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI雙酶切分別鑒定，PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳進(jìn)行分析，篩選陽性克隆，篩選出的陽性克隆菌在LB培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)過夜后，將過夜菌按照1:100的比例接種至1000mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)。N基因轉(zhuǎn)化菌在接種后2h為最佳誘導(dǎo)時機(jī)(OD600nm=0.5),IPTG濃度0.4mmol/L,37℃誘導(dǎo)8h,目的蛋白存將A.4中1000mL菌液12000r/min、4℃離心，棄上清，將菌體用細(xì)胞裂解液裂解，使用含有His純化的豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白放冰箱保存?zhèn)溆谩?(資料性)的3%加入封閉液，混勻，于室溫避光反應(yīng)30min。離心棄上清，用硼酸鹽緩沖液清洗2次，并重懸已標(biāo)記的熒光微球，2℃~8℃保存?zhèn)溆谩０褵晒馕⑶驑?biāo)記PRRSV重組N蛋白稀釋5倍后，用點(diǎn)膜噴金機(jī)設(shè)置噴量為3μL/cm,每張玻璃纖維素膜(10cm×30cm)以7mm間隔噴涂，將噴好的熒光微球墊放置在試管架上，置37℃干燥2h~3h,烘干后于切成7mm于4℃~30℃密封保存?zhèn)溆谩.2.1.1質(zhì)控線(C線)包被溶液用磷酸鹽緩沖液(10mM,pH值7.4)將PRRSV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(其制備方法見附錄C)稀釋至終濃度為1.5mg/mL作為質(zhì)控線(C線)包被膜溶液，置于棕色玻璃瓶中，2℃~8℃保存?zhèn)溆谩.2.1.2檢測線(T線)包被溶液用磷酸鹽緩沖液(10mM,pH值7.4)將PRRSV重組N蛋白稀釋至終濃度為1.2mg/mL作為檢測線包被溶液，置于棕色玻璃瓶中，2℃~8℃保存?zhèn)溆?。按劃線量0.8μL/cm在NC膜上均勻劃出質(zhì)控線(C線)和檢測線(T線),將已劃好的NC膜逐一放置試管架上，37℃干燥8h后，放入裝有干燥劑的鋁箔袋內(nèi)，封口，貼上標(biāo)簽，于4℃~30℃密封保存?zhèn)溆?。?0cm×30cm的玻璃纖維素膜平鋪于潔凈的網(wǎng)架上，用玻纖噴灑機(jī)將樣品墊處理液均勻噴灑玻于4℃~30℃密封保在室溫及濕度≤30%RH的潔凈環(huán)境下，按照以下步驟組裝半成品試紙。6依次按吸水墊、熒光微球墊、樣品墊的順序?qū)⒏髦虚g制品粘貼于包被片材PVC底板各個位置上(如檢測試劑卡示意圖),保證吸水線和熒光微球墊對NC膜相鄰處均有1mm～2mm層疊，樣品墊一邊與PVC底板下沿對齊，并使包被片材上的檢測線靠近樣品墊一側(cè)、質(zhì)控線靠近吸水墊一側(cè)。B.4.2切條將已組裝好的熒光微球大板修剪整齊后，用切條機(jī)將檢驗合格的半成品裁切為3.12mm±0.1mm寬的試紙。挑取印膜無劃痕、無污染，邊緣整齊的試紙，將試紙裝入卡殼中，使用壓卡機(jī)進(jìn)行壓卡，檢測卡示意圖見圖1,檢測卡與干燥劑、滴管放入鋁箔袋并用多功能封口機(jī)封口。吸水濾紙樣品墊層析方向NC膜(硝酸纖維素膜)標(biāo)記物墊PVC底板圖1PRRSV重組N蛋白抗體鑭系高敏熒光免疫分析法檢測試劑卡示意圖7(規(guī)范性)取71.6gNa?HPO?·12H?O溶于1000mL雙蒸水即可。取31.2gNaH?PO?·2H?O溶于1000mL雙蒸水即可。取81mL0.2MNa?HPO?與19mL0.2MNaH?PO?,混勻后分裝，置2℃~8℃?zhèn)溆谩Ｈ?0mL0.2MPB液，加水稀釋至1000mL即可。取100mL0.2MPB液，加入5gBSA溶解，再加水稀釋至1000mL即可。取0.85g氯化鈉(NaCl)、0.1g硫酸葡聚糖鈉鹽((C?H?Na?O??S?)n):MW:40000、0.5g牛血清白蛋白(BSA),加入100mL10mMPB液中，混勻后分裝，置2℃~8℃?zhèn)溆谩?(規(guī)范性)一次，每周無菌采血，用ELISA抗體檢按常規(guī)方法抽取以上免疫并檢測合格的動物(豬、牛、羊)血液2mL～5mL置潔凈干燥的試管中，靜置約1h待血液凝固后于4000r/min離心10min(也可將血液樣品靜置約2h,待血液凝固自然比例混勻，無菌定量分裝，冷凍真空干燥，置-70℃下保存，標(biāo)按常規(guī)方法抽取以上免疫并檢測合格的豬血液2mL～5mL置潔凈干燥的試管中，靜置約1h待血液凝固后于4000r/min離心10min(也可將血液樣品靜置約2h,待血液凝固