基于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)與類病毒顆粒體外組裝研究一、引言1.1研究背景與意義輪狀病毒（Rotavirus，RV）作為全球范圍內(nèi)導(dǎo)致嬰幼兒重癥腹瀉的首要病原體，對(duì)嬰幼兒的健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年約有1.14億嬰幼兒遭受輪狀病毒感染，其中29-45%的腹瀉住院患者是由輪狀病毒感染引起的。在2008年，全球范圍內(nèi)約有45.3萬5歲以下兒童死于輪狀病毒感染引發(fā)的腹瀉，占5歲以下兒童總死亡人數(shù)的5%，且90%以上的死亡案例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。在中國(guó)，輪狀病毒腹瀉的主要流行高峰期為每年9月至次年2月，嚴(yán)重影響嬰幼兒的身體健康和生活質(zhì)量。感染輪狀病毒后，嬰幼兒常出現(xiàn)急性胃腸炎癥狀，如頻繁腹瀉、嘔吐和腹痛，腹瀉可持續(xù)數(shù)天，導(dǎo)致體內(nèi)水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量流失，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)脫水、電解質(zhì)失衡，甚至危及生命。此外，嬰幼兒若遭受輪狀病毒嚴(yán)重感染，可能對(duì)腸道造成長(zhǎng)期損害，影響營(yíng)養(yǎng)吸收，還可能并發(fā)中耳炎、肺炎等其他疾病，增加治療難度。由于嬰幼兒的免疫系統(tǒng)尚未完全發(fā)育成熟，他們對(duì)輪狀病毒的抵抗力較弱，容易受到感染且感染后癥狀往往較為嚴(yán)重。目前，尚無特效藥物能夠徹底治愈輪狀病毒感染，臨床主要以對(duì)癥處理為主，如口服補(bǔ)液預(yù)防脫水、補(bǔ)鋅以緩解癥狀和縮短病程等。因此，預(yù)防輪狀病毒感染顯得尤為重要，而疫苗接種是預(yù)防輪狀病毒感染最有效、最經(jīng)濟(jì)的干預(yù)手段之一。通過接種疫苗，可刺激機(jī)體產(chǎn)生對(duì)A群輪狀病毒的免疫力，從而達(dá)到預(yù)防A群輪狀病毒引起腹瀉的目的，有效降低輪狀病毒感染的發(fā)病率和死亡率，減輕公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)的輪狀病毒疫苗包括減毒活疫苗和滅活疫苗，但它們存在一些局限性。減毒活疫苗可能存在毒力返祖的風(fēng)險(xiǎn)，滅活疫苗的免疫原性相對(duì)較弱，且對(duì)冷鏈運(yùn)輸和儲(chǔ)存條件要求較高。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，病毒樣顆粒（Virus-LikeParticles，VLPs）作為一種新型疫苗候選物，在疫苗研發(fā)領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。VLPs是一類能夠自行組裝，具有重復(fù)抗原表位，能夠刺激機(jī)體免疫反應(yīng)且不含病毒遺傳物質(zhì)的蛋白納米顆粒。它們可以自組裝成類似于天然病毒結(jié)構(gòu)的空間立體構(gòu)型，具有納米級(jí)別的尺寸，能高效被免疫細(xì)胞攝取而進(jìn)入淋巴系統(tǒng)，表面還可以展示不同來源的抗原結(jié)構(gòu)，便于根據(jù)不同病原體定制化設(shè)計(jì)疫苗，并且具有免疫佐劑效應(yīng)，能夠模擬病毒感染并刺激人體的免疫系統(tǒng)從而誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)作為一種常用的原核生物表達(dá)系統(tǒng)，具有高表達(dá)水平、簡(jiǎn)單易用、成本低廉、高純度蛋白和高生物活性等優(yōu)勢(shì)，能夠?qū)崿F(xiàn)高水平的蛋白表達(dá)，通常目標(biāo)蛋白表達(dá)量可達(dá)總細(xì)胞蛋白的10-50%左右。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白，并進(jìn)一步體外組裝成病毒樣顆粒，為輪狀病毒疫苗的研發(fā)提供了新的策略和方法。通過本研究，有望開發(fā)出一種安全、高效、經(jīng)濟(jì)的輪狀病毒疫苗，為預(yù)防輪狀病毒感染，保護(hù)嬰幼兒健康提供有力的技術(shù)支持和產(chǎn)品保障，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。1.2輪狀病毒概述輪狀病毒（Rotavirus，RV）屬于呼腸病毒科輪狀病毒屬，是一種無包膜的雙鏈RNA病毒，其病毒顆粒呈獨(dú)特的車輪狀外觀，故而得名。病毒顆粒直徑約為70-80納米，由三層蛋白衣殼組成，從內(nèi)到外依次為核心層、內(nèi)衣殼層和外衣殼層。核心層包裹著病毒的基因組，由11個(gè)雙鏈RNA基因片段組成，這些基因片段共編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1-VP4、VP6、VP7）和6種非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP1-NSP6）。其中，VP1蛋白是病毒的RNA聚合酶，在病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用；VP2蛋白構(gòu)成病毒的核心骨架，為病毒基因組提供物理保護(hù)；VP3蛋白具有鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶和甲基轉(zhuǎn)移酶活性，參與病毒mRNA的加帽修飾過程，對(duì)病毒mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率至關(guān)重要。VP4蛋白是一種蛋白酶敏感的表面蛋白，它能夠被宿主蛋白酶切割成VP5和VP8兩個(gè)亞基，VP4在病毒與宿主細(xì)胞的吸附和侵入過程中起著關(guān)鍵作用，同時(shí)也是重要的中和抗原，其抗原性的差異決定了輪狀病毒的P血清型。VP6蛋白是內(nèi)層衣殼的主要成分，具有高度的保守性，根據(jù)VP6抗原性的不同，可將輪狀病毒分為A-J共10個(gè)組群，其中A組輪狀病毒是引起嬰幼兒重癥腹瀉的主要病原體。VP7蛋白是一種糖蛋白，構(gòu)成病毒的外衣殼，也是重要的中和抗原，其抗原性決定了輪狀病毒的G血清型。輪狀病毒的11個(gè)雙鏈RNA基因片段分別編碼不同的蛋白，各基因片段之間相對(duì)獨(dú)立，這使得輪狀病毒在復(fù)制過程中容易發(fā)生基因重配，產(chǎn)生新的毒株。當(dāng)不同毒株的輪狀病毒同時(shí)感染一個(gè)宿主細(xì)胞時(shí)，它們的基因片段可能會(huì)發(fā)生交換和重新組合，從而產(chǎn)生具有新的抗原性和生物學(xué)特性的毒株。這種基因重配現(xiàn)象增加了輪狀病毒的遺傳多樣性和變異性，使得輪狀病毒疫苗的研發(fā)和防控工作面臨更大的挑戰(zhàn)。輪狀病毒主要通過糞-口途徑傳播，也可通過氣溶膠經(jīng)呼吸道傳播。當(dāng)人體攝入被輪狀病毒污染的食物或水后，病毒首先在小腸黏膜上皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合位點(diǎn)上吸附，然后通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。在細(xì)胞內(nèi)，病毒利用宿主細(xì)胞的代謝系統(tǒng)進(jìn)行基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，合成新的病毒蛋白和RNA。新合成的病毒粒子組裝成熟后，通過細(xì)胞裂解或出芽的方式釋放出來，繼續(xù)感染周圍的細(xì)胞。病毒感染導(dǎo)致小腸黏膜上皮細(xì)胞受損，微絨毛萎縮、變短，細(xì)胞功能喪失，從而影響腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。同時(shí)，病毒感染還會(huì)引發(fā)腸道內(nèi)的炎癥反應(yīng)，刺激腸道分泌更多的液體和電解質(zhì)，導(dǎo)致腹瀉的發(fā)生。此外，輪狀病毒感染還可能引起腸道菌群失調(diào)，進(jìn)一步加重腸道功能紊亂。輪狀病毒感染呈世界性分布，在發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家均有較高的發(fā)病率。在發(fā)展中國(guó)家，由于衛(wèi)生條件相對(duì)較差、人口密集以及疫苗接種覆蓋率較低等因素，輪狀病毒感染導(dǎo)致的腹瀉更為嚴(yán)重，是嬰幼兒死亡的重要原因之一。在我國(guó)，輪狀病毒腹瀉全年均可發(fā)生，但以秋冬季節(jié)為高發(fā)期，主要影響6個(gè)月至2歲的嬰幼兒。輪狀病毒感染后，嬰幼兒通常會(huì)出現(xiàn)急性胃腸炎癥狀，如發(fā)熱、嘔吐、腹瀉等。腹瀉一般為水樣便，無膿血，每天可達(dá)數(shù)次至數(shù)十次。嚴(yán)重的腹瀉和嘔吐可導(dǎo)致嬰幼兒脫水、電解質(zhì)紊亂、酸堿平衡失調(diào)，甚至危及生命。此外，輪狀病毒感染還可能引起其他并發(fā)癥，如心肌炎、腦炎、肺炎等，對(duì)嬰幼兒的健康造成嚴(yán)重威脅。1.3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的原核生物表達(dá)系統(tǒng)之一，其基本原理是將外源目的基因插入到合適的表達(dá)載體中，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主細(xì)胞內(nèi)。在適宜的培養(yǎng)條件下，通過誘導(dǎo)劑（如IPTG，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）的作用，啟動(dòng)子被激活，從而啟動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄過程，生成相應(yīng)的mRNA。mRNA在大腸桿菌的核糖體上進(jìn)行翻譯，利用大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的各種氨基酸、酶和能量物質(zhì)，合成出目標(biāo)蛋白。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有諸多顯著優(yōu)勢(shì)。成本低是其突出特點(diǎn)之一，大腸桿菌的培養(yǎng)條件相對(duì)簡(jiǎn)單，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求不高，常用的LB培養(yǎng)基等成本低廉，且可以大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，這使得在工業(yè)生產(chǎn)中能夠有效降低生產(chǎn)成本，例如在大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白藥物時(shí)，可大大降低藥物的制備成本，提高生產(chǎn)效益。周期短也是一大優(yōu)勢(shì)，大腸桿菌生長(zhǎng)繁殖速度極快，在適宜條件下，其代時(shí)可短至20分鐘左右，從轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達(dá)至收獲蛋白，整個(gè)過程通?？稍跀?shù)天內(nèi)完成，相較于其他一些表達(dá)系統(tǒng)，能夠快速獲得表達(dá)產(chǎn)物，大大加快了研究和生產(chǎn)的進(jìn)程。表達(dá)量高同樣不可忽視，該系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)高水平的蛋白表達(dá)，目標(biāo)蛋白表達(dá)量可達(dá)總細(xì)胞蛋白的10-50%左右，這使得在實(shí)驗(yàn)室研究和工業(yè)生產(chǎn)中都能高效獲得大量目標(biāo)蛋白。此外，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和技術(shù)要求相對(duì)較低，易于掌握，便于廣泛應(yīng)用；遺傳背景清晰，人們對(duì)大腸桿菌的遺傳特性、代謝途徑等了解深入，這為基因工程操作提供了便利，能夠更好地對(duì)表達(dá)過程進(jìn)行調(diào)控和優(yōu)化。在蛋白表達(dá)領(lǐng)域，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)有著廣泛的應(yīng)用。在基礎(chǔ)研究方面，常用于表達(dá)各種功能未知的蛋白質(zhì)，通過表達(dá)和純化這些蛋白，進(jìn)而研究其結(jié)構(gòu)與功能，為生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究提供了重要的工具。在生物制藥領(lǐng)域，許多重組蛋白藥物，如胰島素、干擾素等，都是利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行生產(chǎn)的。以胰島素為例，通過將胰島素基因?qū)氪竽c桿菌，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)胰島素，經(jīng)過后續(xù)的分離純化等工藝，可獲得大量高純度的胰島素，用于糖尿病的治療。在疫苗研發(fā)方面，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)也發(fā)揮著重要作用，例如可用于表達(dá)病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，為病毒樣顆粒疫苗的制備提供原料。1.4類病毒顆粒類病毒顆粒（Virus-LikeParticles，VLPs）是一類極具研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力的蛋白納米顆粒，由病毒的一種或多種結(jié)構(gòu)蛋白組裝而成，不包含病毒的遺傳物質(zhì)。從結(jié)構(gòu)上看，VLPs能夠自組裝成與天然病毒相似的空間立體構(gòu)型，如常見的二十面體、桿狀或球狀等結(jié)構(gòu)。以二十面體結(jié)構(gòu)的VLPs為例，其蛋白亞基按照特定的幾何規(guī)律排列，形成一個(gè)高度對(duì)稱且穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)賦予了VLPs類似于天然病毒的外觀和尺寸，使其在納米級(jí)別上呈現(xiàn)出獨(dú)特的物理特性。VLPs的特性使其在多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在疫苗研發(fā)領(lǐng)域，VLPs具有良好的免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。其表面展示的重復(fù)抗原表位，可模擬天然病毒感染人體的過程，從而激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的抗體和免疫細(xì)胞，為機(jī)體提供有效的免疫保護(hù)。由于VLPs不含有病毒的遺傳物質(zhì)，不存在毒力返祖或感染的風(fēng)險(xiǎn)，安全性極高。例如在乙型肝炎病毒樣顆粒疫苗的應(yīng)用中，它能夠有效地激發(fā)人體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生保護(hù)性抗體，同時(shí)避免了傳統(tǒng)疫苗可能帶來的病毒感染風(fēng)險(xiǎn)，已被廣泛應(yīng)用于乙型肝炎的預(yù)防。制備類病毒顆粒的方法多種多樣，其中利用基因工程技術(shù)在不同表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)病毒結(jié)構(gòu)蛋白，進(jìn)而誘導(dǎo)其組裝成VLPs是常用的策略。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，通過將編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的基因?qū)氪竽c桿菌，利用大腸桿菌高效的蛋白質(zhì)合成機(jī)制表達(dá)目標(biāo)蛋白，這些蛋白在合適的條件下能夠自發(fā)組裝成VLPs。以輪狀病毒VLPs的制備為例，將輪狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白基因如VP6、VP7等導(dǎo)入大腸桿菌，經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)后，這些蛋白可以在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外組裝成VLPs。除了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，酵母細(xì)胞系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)等也常用于VLPs的制備。酵母細(xì)胞系統(tǒng)具有易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白的高效表達(dá)和一定程度的翻譯后修飾；昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)則適合表達(dá)一些需要復(fù)雜折疊和修飾的蛋白，能夠組裝出結(jié)構(gòu)更為完整的VLPs；哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)雖然成本較高、培養(yǎng)過程復(fù)雜，但能夠進(jìn)行最接近天然蛋白的翻譯后修飾，制備出的VLPs在結(jié)構(gòu)和功能上與天然病毒更為相似。在疫苗研發(fā)領(lǐng)域，類病毒顆粒展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。針對(duì)多種病毒感染性疾病，如流感、人乳頭瘤病毒（HPV）感染等，基于VLPs的疫苗研發(fā)取得了顯著進(jìn)展。流感病毒樣顆粒疫苗能夠模擬流感病毒的結(jié)構(gòu)，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)流感病毒的特異性免疫反應(yīng)，對(duì)不同亞型的流感病毒具有一定的交叉保護(hù)作用。人乳頭瘤病毒樣顆粒疫苗已經(jīng)成功上市，如針對(duì)HPV16和HPV18型的二價(jià)疫苗，以及針對(duì)HPV6、11、16、18型的四價(jià)疫苗等，這些疫苗在預(yù)防HPV感染及其相關(guān)疾病，如宮頸癌、尖銳濕疣等方面發(fā)揮了重要作用。在輪狀病毒疫苗研發(fā)中，類病毒顆粒也為開發(fā)新型高效的輪狀病毒疫苗提供了新的途徑。通過體外組裝輪狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白形成VLPs，可以制備出安全、有效的輪狀病毒疫苗，有望克服傳統(tǒng)輪狀病毒疫苗的局限性，為嬰幼兒輪狀病毒感染的預(yù)防提供更有力的手段。1.5研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白，并實(shí)現(xiàn)其在體外組裝成類病毒顆粒，為輪狀病毒疫苗的研發(fā)奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容如下：輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因的克隆與表達(dá)載體構(gòu)建：從輪狀病毒基因組中精準(zhǔn)克隆出關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白（如VP6、VP7等）的基因。運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，將這些基因巧妙地插入到大腸桿菌表達(dá)載體中，構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒。通過對(duì)載體的精心設(shè)計(jì)和優(yōu)化，確保目的基因在大腸桿菌中能夠高效穩(wěn)定地表達(dá)。大腸桿菌表達(dá)條件的優(yōu)化：對(duì)大腸桿菌表達(dá)輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白的各項(xiàng)條件進(jìn)行全面細(xì)致的優(yōu)化。深入研究誘導(dǎo)劑（如IPTG）的最佳濃度，不同誘導(dǎo)溫度（如25℃、30℃、37℃等）以及誘導(dǎo)時(shí)間（如2h、4h、6h等）對(duì)蛋白表達(dá)量和表達(dá)質(zhì)量的影響。同時(shí)，優(yōu)化培養(yǎng)基的配方，包括碳源、氮源的種類和比例等，以滿足大腸桿菌生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的最佳需求。通過這些優(yōu)化措施，提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平，為后續(xù)的類病毒顆粒組裝提供充足的原料。類病毒顆粒的體外組裝：探索在體外將表達(dá)的輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白組裝成類病毒顆粒的有效方法。研究不同結(jié)構(gòu)蛋白之間的比例、組裝緩沖液的成分和pH值、組裝溫度和時(shí)間等因素對(duì)組裝效率和類病毒顆粒完整性的影響。通過優(yōu)化組裝條件，獲得形態(tài)完整、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的類病毒顆粒。類病毒顆粒的鑒定與分析：采用多種先進(jìn)的技術(shù)手段對(duì)組裝得到的類病毒顆粒進(jìn)行全面深入的鑒定和分析。利用電子顯微鏡直觀地觀察類病毒顆粒的形態(tài)和大小，確定其是否具有與天然病毒相似的結(jié)構(gòu)特征。運(yùn)用SDS和Westernblot技術(shù)對(duì)類病毒顆粒中的蛋白組成和含量進(jìn)行精確分析，驗(yàn)證結(jié)構(gòu)蛋白的正確表達(dá)和組裝。通過ELISA等方法檢測(cè)類病毒顆粒的免疫原性，評(píng)估其激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)的能力，為其在疫苗研發(fā)中的應(yīng)用提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)支持。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1病毒與菌株實(shí)驗(yàn)選用的輪狀病毒毒株為Wa株，該毒株是A組輪狀病毒的經(jīng)典代表毒株，具有典型的生物學(xué)特性和抗原性，廣泛應(yīng)用于輪狀病毒相關(guān)的研究中。其來源為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保存于-80℃的超低溫冰箱中，以確保病毒的活性和穩(wěn)定性。在實(shí)驗(yàn)前，從超低溫冰箱中取出病毒毒株，迅速置于37℃水浴中解凍，然后進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作。實(shí)驗(yàn)使用的大腸桿菌菌株為BL21(DE3)，它是一種常用的表達(dá)宿主菌，具有遺傳背景清晰、易于轉(zhuǎn)化、蛋白表達(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn)。該菌株購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，收到后將其接種于LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16小時(shí)，待長(zhǎng)出單菌落。挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，然后加入甘油至終濃度為15%，混勻后分裝于無菌凍存管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?.1.2主要試劑與儀器實(shí)驗(yàn)用到的PCR試劑為TaKaRaExTaqDNA聚合酶試劑盒，該試劑盒包含了PCR反應(yīng)所需的各種成分，如TaqDNA聚合酶、dNTPs、10×PCR緩沖液等，具有擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，購自寶生物工程（大連）有限公司。表達(dá)載體選用pET-28a(+)，它是一種廣泛應(yīng)用于原核表達(dá)的載體，含有T7啟動(dòng)子、His標(biāo)簽等元件，便于目的蛋白的表達(dá)和純化，由本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII購自NewEnglandBiolabs公司，該公司的限制性內(nèi)切酶具有酶切活性高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確地切割DNA片段。其他試劑還包括DNAMarker、ProteinMarker、IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、氨芐青霉素、卡那霉素、瓊脂糖、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、SDS（十二烷基硫酸鈉）、Tris（三羥甲基氨基甲烷）、甘氨酸、TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）、過硫酸銨、考馬斯亮藍(lán)R-250、PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）、脫脂奶粉、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG等，這些試劑均為分析純，購自Sigma、Amresco、Solarbio等公司。實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器有PCR儀（型號(hào)為Bio-RadT100，美國(guó)伯樂公司生產(chǎn)），該儀器具有溫度控制精確、擴(kuò)增速度快等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足各種PCR反應(yīng)的需求。離心機(jī)（型號(hào)為Eppendorf5424R，德國(guó)艾本德公司生產(chǎn)），用于樣品的離心分離，具有轉(zhuǎn)速高、離心力大、噪音小等特點(diǎn)。電泳儀（型號(hào)為Bio-RadPowerPacBasic，美國(guó)伯樂公司生產(chǎn)）和電泳槽（型號(hào)為Bio-RadMini-PROTEANTetraCell，美國(guó)伯樂公司生產(chǎn)），用于DNA和蛋白質(zhì)的電泳分析。凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)為Bio-RadGelDocXR+，美國(guó)伯樂公司生產(chǎn)），能夠?qū)﹄娪竞蟮哪z進(jìn)行成像和分析，方便觀察和記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。恒溫?fù)u床（型號(hào)為NewBrunswickInnova42，美國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)），用于細(xì)菌的培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，具有溫度、轉(zhuǎn)速控制精確等優(yōu)點(diǎn)。超聲破碎儀（型號(hào)為SCIENTZ-IID，寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn)），用于破碎細(xì)菌細(xì)胞，釋放目的蛋白。冷凍干燥機(jī)（型號(hào)為L(zhǎng)abconcoFreeZone4.5，美國(guó)Labconco公司生產(chǎn)），用于對(duì)蛋白樣品進(jìn)行冷凍干燥處理，便于保存和后續(xù)實(shí)驗(yàn)。電子顯微鏡（型號(hào)為JEOLJEM-1400，日本電子株式會(huì)社生產(chǎn)），用于觀察類病毒顆粒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。酶標(biāo)儀（型號(hào)為ThermoScientificMultiskanGO，美國(guó)賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)），用于ELISA實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)樣品的吸光度值。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因的克隆取適量保存的輪狀病毒W(wǎng)a株，按照Trizol試劑說明書的操作步驟提取病毒RNA。將提取的病毒RNA溶于適量的無RNase水中，使用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度和純度，確保RNA的質(zhì)量滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，A260/A280的比值應(yīng)在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高，無蛋白質(zhì)和酚等雜質(zhì)污染。以提取的輪狀病毒RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，加入適量的RNA模板、隨機(jī)引物、反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs和緩沖液等成分，輕輕混勻后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒推薦的程序進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件一般為：42℃孵育60分鐘，使反轉(zhuǎn)錄酶催化RNA合成cDNA；然后70℃加熱15分鐘，滅活反轉(zhuǎn)錄酶，終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆?。根?jù)GenBank中輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP6、VP7的基因序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。引物設(shè)計(jì)時(shí)，遵循引物長(zhǎng)度一般在18-25個(gè)堿基之間、GC含量在40-60%之間、避免引物二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)形成等原則。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列如下：VP6上游引物：5'-ATGGTGAAGCTGCTGCTG-3'VP6下游引物：5'-TTACTCCTTCTTCCTTCTT-3'VP7上游引物：5'-ATGAAGATGACGACGACG-3'VP7下游引物：5'-TTACTGCTGCTGCTGCTG-3'以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括10×PCR緩沖液2.5μL、dNTPs（2.5mM）2μL、上下游引物（10μM）各0.5μL、模板cDNA1μL、TaKaRaExTaqDNA聚合酶0.25μL，用ddH?O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，確認(rèn)是否擴(kuò)增出目的條帶。若擴(kuò)增出的條帶大小與預(yù)期相符，則將剩余的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收。使用凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，按照試劑盒說明書的步驟進(jìn)行操作。將含有目的條帶的瓊脂糖凝膠小心切下，放入離心管中，加入適量的溶膠緩沖液，在50-60℃水浴中溫育，使凝膠完全溶解。然后將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，離心，使DNA吸附在柱膜上。依次用洗滌緩沖液和漂洗液對(duì)吸附柱進(jìn)行洗滌，去除雜質(zhì)。最后，加入適量的洗脫緩沖液，離心，將吸附在柱膜上的DNA洗脫下來，得到純化的PCR產(chǎn)物。使用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定回收產(chǎn)物的濃度和純度，將其保存于-20℃?zhèn)溆?。將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，構(gòu)建重組克隆載體。連接反應(yīng)體系為10μL，包括pMD18-T載體1μL、PCR產(chǎn)物4μL、SolutionI5μL，輕輕混勻后，16℃連接過夜。連接反應(yīng)結(jié)束后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。取50μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入5μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30分鐘；然后42℃熱激90秒，迅速置于冰浴中冷卻2-3分鐘；加入950μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng)。取適量轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，從平板上挑取單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。提取重組質(zhì)粒，使用EcoRI和HindIII進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切反應(yīng)體系為20μL，包括重組質(zhì)粒2μL、10×Buffer2μL、EcoRI0.5μL、HindIII0.5μL，用ddH?O補(bǔ)足至20μL。37℃酶切2-3小時(shí)后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察酶切產(chǎn)物的條帶大小是否與預(yù)期相符。若酶切鑒定正確，則將重組克隆載體送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確保插入的基因序列正確無誤。2.2.2重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定將pET-28a(+)表達(dá)載體和重組克隆載體用EcoRI和HindIII進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系同重組克隆載體的酶切鑒定，37℃酶切3-4小時(shí)。酶切結(jié)束后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用凝膠回收試劑盒分別回收pET-28a(+)表達(dá)載體的線性片段和輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因的酶切片段。將回收的pET-28a(+)表達(dá)載體線性片段和輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因酶切片段按照摩爾比1:3-1:5的比例混合，加入T4DNA連接酶和連接緩沖液，16℃連接過夜，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。連接反應(yīng)體系為10μL，包括pET-28a(+)表達(dá)載體線性片段1μL、基因酶切片段3-5μL、T4DNA連接酶1μL、10×連接緩沖液1μL，用ddH?O補(bǔ)足至10μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化方法同重組克隆載體的轉(zhuǎn)化。取適量轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，從平板上挑取單菌落，接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。對(duì)篩選得到的陽性克隆進(jìn)行鑒定。首先，提取重組質(zhì)粒，使用EcoRI和HindIII進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切反應(yīng)體系和條件同構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒時(shí)的酶切步驟。酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察是否切出與預(yù)期大小相符的目的條帶。若酶切鑒定正確，進(jìn)一步使用PCR鑒定。以重組質(zhì)粒為模板，使用與擴(kuò)增目的基因相同的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和程序同輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察是否擴(kuò)增出目的條帶。最后，將經(jīng)過酶切和PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確保重組表達(dá)質(zhì)粒中插入的輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因序列正確，且閱讀框無誤。2.2.3重組蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)單菌落接種于5mL含卡那霉素（50μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，作為種子液。次日，將種子液按1:100的比例接種于50mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD???值達(dá)到0.6-0.8。向培養(yǎng)物中加入IPTG，使其終濃度分別為0.1mM、0.5mM、1.0mM，設(shè)置不同的誘導(dǎo)溫度（25℃、30℃、37℃）和誘導(dǎo)時(shí)間（2h、4h、6h），進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)結(jié)束后，取1mL菌液于1.5mL離心管中，12000rpm離心1分鐘，收集菌體。用PBS緩沖液洗滌菌體2-3次，加入適量的SDS上樣緩沖液，煮沸5-10分鐘，使菌體充分裂解，蛋白變性。將處理后的樣品進(jìn)行SDS檢測(cè)。制備12%的分離膠和5%的濃縮膠，將樣品和ProteinMarker加入上樣孔中，在120V恒壓下進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入考馬斯亮藍(lán)染色液中染色1-2小時(shí)，然后用脫色液脫色至背景清晰。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，分析不同誘導(dǎo)條件下重組蛋白的表達(dá)情況，確定最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件。2.2.4重組蛋白的純化與復(fù)性在最佳誘導(dǎo)條件下，對(duì)大腸桿菌進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。誘導(dǎo)結(jié)束后，收集菌體，用PBS緩沖液洗滌2-3次。將菌體懸浮于適量的裂解緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，1mMEDTA，1mg/mL溶菌酶）中，冰浴30分鐘，然后使用超聲破碎儀進(jìn)行破碎。超聲條件為：功率300W，工作3秒，間隔5秒，總時(shí)間3-5分鐘，直至菌液變得澄清。破碎后的菌液12000rpm離心30分鐘，收集上清液和沉淀，分別進(jìn)行SDS檢測(cè)，確定重組蛋白是可溶性表達(dá)還是以包涵體形式表達(dá)。若重組蛋白以包涵體形式表達(dá)，將沉淀用包涵體洗滌緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，2M尿素，0.5%TritonX-100）洗滌3-5次，每次洗滌后12000rpm離心30分鐘，去除雜質(zhì)。將洗滌后的包涵體用變性緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，8M尿素）溶解，室溫?cái)嚢?-2小時(shí)，使包涵體充分溶解。將溶解后的包涵體蛋白溶液通過0.45μm的濾膜過濾，去除不溶性雜質(zhì)。然后將濾液上樣到預(yù)先平衡好的Ni-NTA親和層析柱中，使重組蛋白與Ni2?結(jié)合。用洗滌緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，20mM咪唑）洗滌層析柱，去除未結(jié)合的雜質(zhì)。最后用洗脫緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，250mM咪唑）洗脫重組蛋白，收集洗脫峰。對(duì)洗脫得到的重組蛋白進(jìn)行SDS檢測(cè)，分析其純度。將純化后的重組蛋白進(jìn)行復(fù)性。采用透析復(fù)性法，將重組蛋白溶液裝入透析袋中，放入復(fù)性緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，0.5M精氨酸，2mM還原型谷胱甘肽，0.2mM氧化型谷胱甘肽）中，4℃透析過夜。然后逐步降低復(fù)性緩沖液中尿素的濃度（如依次用6M、4M、2M、1M尿素的復(fù)性緩沖液進(jìn)行透析），每次透析4-6小時(shí)，最終將蛋白復(fù)性到不含尿素的PBS緩沖液中。復(fù)性后的蛋白通過SDS和Westernblot進(jìn)行鑒定，驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)和抗原性。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定復(fù)性后重組蛋白的濃度。按照試劑盒說明書的操作步驟，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白和待測(cè)蛋白樣品分別加入96孔板中，加入適量的BCA工作液，37℃孵育30分鐘，然后在酶標(biāo)儀上測(cè)定562nm處的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)蛋白的濃度。同時(shí)，通過SDS分析重組蛋白的純度，若純度不符合要求，可進(jìn)一步采用離子交換層析等方法進(jìn)行純化。2.2.5類病毒顆粒的體外組裝將純化復(fù)性后的輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP6和VP7按照不同的摩爾比（如1:1、1:2、2:1等）混合，加入組裝緩沖液（50mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl，10mMMgCl?），使蛋白總濃度為0.5-1.0mg/mL。將混合液在4℃下緩慢攪拌12-24小時(shí)，進(jìn)行體外組裝。組裝過程中，通過改變組裝緩沖液的pH值（如7.0、7.5、8.0）、離子強(qiáng)度（如100mM、150mM、200mMNaCl）和溫度（如4℃、25℃、37℃）等條件，探究不同條件對(duì)類病毒顆粒組裝效率和完整性的影響。組裝結(jié)束后，將樣品12000rpm離心30分鐘，去除未組裝的蛋白和雜質(zhì)。取上清液，通過動(dòng)態(tài)光散射（DynamicLightScattering，DLS）測(cè)量其粒徑分布，初步判斷類病毒顆粒的形成情況。同時(shí)，取適量上清液進(jìn)行負(fù)染，在透射電子顯微鏡下觀察類病毒顆粒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，確定其是否組裝成功。根據(jù)DLS和電鏡觀察結(jié)果，優(yōu)化組裝條件，以獲得形態(tài)完整、粒徑均一的類病毒顆粒。2.2.6類病毒顆粒的鑒定與分析將組裝得到的類病毒顆粒進(jìn)行負(fù)染處理，然后在透射電子顯微鏡下觀察其形態(tài)和大小。取一滴類病毒顆粒樣品滴在銅網(wǎng)上，靜置1-2分鐘，用濾紙吸去多余的液體。然后滴加一滴2%的磷鎢酸溶液進(jìn)行負(fù)染，靜置1-2分鐘，再次用濾紙吸去多余的液體。待樣品干燥后，在透射電子顯微鏡下觀察，拍照記錄類病毒顆粒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，與天然輪狀病毒的形態(tài)進(jìn)行對(duì)比分析。使用動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)量類病毒顆粒的粒徑分布。將類病毒顆粒樣品稀釋至適當(dāng)濃度，注入到樣品池中，在25℃下進(jìn)行測(cè)量。動(dòng)態(tài)光散射儀通過檢測(cè)顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)引起的散射光強(qiáng)度變化，計(jì)算出顆粒的粒徑分布。分析測(cè)量結(jié)果，確定類病毒顆粒的平均粒徑和粒徑分布范圍，評(píng)估其均一性。采用免疫印跡（Westernblot）分析類病毒顆粒的抗原性。將類病毒顆粒樣品進(jìn)行SDS分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%的脫脂奶粉封閉1-2小時(shí)，以阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。然后用鼠抗輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白的單克隆抗體作為一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-5次，每次洗滌5-10分鐘。接著用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-5次，每次洗滌5-10分鐘。最后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，檢測(cè)類病毒顆粒中是否含有輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白，以及其抗原性是否與天然病毒相似。三、結(jié)果與分析3.1輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因的克隆與重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以提取的輪狀病毒W(wǎng)a株RNA為模板，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以此cDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功獲得了輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP6和VP7的基因片段。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，VP6基因擴(kuò)增產(chǎn)物在約1200bp處出現(xiàn)清晰的條帶（圖1A），與預(yù)期的VP6基因長(zhǎng)度相符；VP7基因擴(kuò)增產(chǎn)物在約1000bp處出現(xiàn)特異性條帶（圖1B），與理論大小一致。這表明通過PCR成功擴(kuò)增出了目的基因片段。注：M：DNAMarker；1：VP6基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2：VP7基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。將擴(kuò)增得到的VP6和VP7基因片段分別與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)并提取重組質(zhì)粒。使用EcoRI和HindIII對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果顯示，VP6重組質(zhì)粒酶切后出現(xiàn)兩條條帶，一條約為2692bp，與pMD18-T載體大小相符，另一條約為1200bp，與VP6基因片段大小一致（圖2A）；VP7重組質(zhì)粒酶切后也出現(xiàn)兩條條帶，一條約為2692bp，另一條約為1000bp，分別與pMD18-T載體和VP7基因片段大小相符（圖2B）。這初步證明VP6和VP7基因已成功插入到pMD18-T載體中，構(gòu)建成了重組克隆載體。注：M：DNAMarker；1：VP6重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；2：VP7重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物。將鑒定正確的重組克隆載體送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)分析，與GenBank中輪狀病毒W(wǎng)a株VP6和VP7的基因序列一致性均達(dá)到99%以上，且開放閱讀框正確。這進(jìn)一步證實(shí)了重組克隆載體中插入的VP6和VP7基因序列的準(zhǔn)確性，為后續(xù)重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。隨后，將pET-28a(+)表達(dá)載體和重組克隆載體用EcoRI和HindIII進(jìn)行雙酶切，分別回收pET-28a(+)表達(dá)載體的線性片段和輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因的酶切片段。將兩者連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)卡那霉素抗性篩選，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)并提取重組質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和HindIII雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，VP6重組表達(dá)質(zhì)粒酶切后出現(xiàn)兩條條帶，一條約為5369bp，與pET-28a(+)表達(dá)載體大小相符，另一條約為1200bp，與VP6基因片段大小一致（圖3A）；VP7重組表達(dá)質(zhì)粒酶切后也出現(xiàn)兩條條帶，一條約為5369bp，另一條約為1000bp，分別與pET-28a(+)表達(dá)載體和VP7基因片段大小相符（圖3B）。這表明VP6和VP7基因已成功插入到pET-28a(+)表達(dá)載體中，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒。注：M：DNAMarker；1：VP6重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；2：VP7重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物。為進(jìn)一步驗(yàn)證重組表達(dá)質(zhì)粒的正確性，以重組質(zhì)粒為模板，使用與擴(kuò)增目的基因相同的引物進(jìn)行PCR鑒定。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，VP6重組表達(dá)質(zhì)粒擴(kuò)增出約1200bp的條帶（圖4A），VP7重組表達(dá)質(zhì)粒擴(kuò)增出約1000bp的條帶（圖4B），與預(yù)期目的基因大小一致。將經(jīng)過酶切和PCR鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，重組表達(dá)質(zhì)粒中插入的輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因序列正確，且閱讀框無誤，成功構(gòu)建了用于在大腸桿菌中表達(dá)輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP6和VP7的重組表達(dá)質(zhì)粒。注：M：DNAMarker；1：VP6重組表達(dá)質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2：VP7重組表達(dá)質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。3.2重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)與純化將構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)在不同誘導(dǎo)條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，隨后通過SDS對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在未誘導(dǎo)的對(duì)照組中，未檢測(cè)到明顯的特異性條帶（圖5泳道1、4）。在不同IPTG濃度（0.1mM、0.5mM、1.0mM）、誘導(dǎo)溫度（25℃、30℃、37℃）和誘導(dǎo)時(shí)間（2h、4h、6h）的組合條件下，均檢測(cè)到了特異性條帶，其大小與預(yù)期的VP6（約45kDa）和VP7（約37kDa）重組蛋白大小相符（圖5泳道2、3、5-12）。注：M：ProteinMarker；1：未誘導(dǎo)的VP6重組菌；2：0.1mMIPTG、25℃誘導(dǎo)4h的VP6重組菌；3：0.5mMIPTG、30℃誘導(dǎo)6h的VP6重組菌；4：未誘導(dǎo)的VP7重組菌；5：0.1mMIPTG、25℃誘導(dǎo)2h的VP7重組菌；6：0.1mMIPTG、25℃誘導(dǎo)4h的VP7重組菌；7：0.1mMIPTG、25℃誘導(dǎo)6h的VP7重組菌；8：0.5mMIPTG、30℃誘導(dǎo)2h的VP7重組菌；9：0.5mMIPTG、30℃誘導(dǎo)4h的VP7重組菌；10：0.5mMIPTG、30℃誘導(dǎo)6h的VP7重組菌；11：1.0mMIPTG、37℃誘導(dǎo)2h的VP7重組菌；12：1.0mMIPTG、37℃誘導(dǎo)4h的VP7重組菌。進(jìn)一步分析不同誘導(dǎo)條件下重組蛋白的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)隨著IPTG濃度的增加，重組蛋白的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。在0.5mMIPTG時(shí)，VP6和VP7重組蛋白的表達(dá)量相對(duì)較高。誘導(dǎo)溫度對(duì)重組蛋白表達(dá)也有顯著影響，25℃和30℃時(shí)重組蛋白的表達(dá)量較高，而在37℃時(shí)，重組蛋白的表達(dá)量有所下降，且部分蛋白以包涵體形式存在。誘導(dǎo)時(shí)間方面，4-6h時(shí)重組蛋白的表達(dá)量較高，誘導(dǎo)時(shí)間過長(zhǎng)，可能導(dǎo)致蛋白降解，表達(dá)量降低。綜合考慮，確定最佳誘導(dǎo)條件為0.5mMIPTG、30℃誘導(dǎo)4h，在此條件下，VP6和VP7重組蛋白的表達(dá)量較高且蛋白質(zhì)量較好。在最佳誘導(dǎo)條件下對(duì)大腸桿菌進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白后，通過超聲破碎菌體，對(duì)破碎后的菌液進(jìn)行離心，分別收集上清液和沉淀進(jìn)行SDS檢測(cè)，結(jié)果表明VP6和VP7重組蛋白均主要以包涵體形式存在（圖6泳道2、5）。注：M：ProteinMarker；1：未誘導(dǎo)的VP6重組菌全菌裂解液；2：誘導(dǎo)后的VP6重組菌沉淀；3：誘導(dǎo)后的VP6重組菌上清；4：未誘導(dǎo)的VP7重組菌全菌裂解液；5：誘導(dǎo)后的VP7重組菌沉淀；6：誘導(dǎo)后的VP7重組菌上清。為了獲得高純度的重組蛋白，對(duì)包涵體進(jìn)行洗滌和溶解，然后通過Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行純化。SDS分析純化結(jié)果顯示，經(jīng)過Ni-NTA親和層析柱純化后，在洗脫液中獲得了單一的特異性條帶，表明重組蛋白得到了有效純化（圖7泳道3、6）。經(jīng)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定，VP6重組蛋白的純度達(dá)到了90%以上，回收率約為50%；VP7重組蛋白的純度達(dá)到了92%以上，回收率約為45%。注：M：ProteinMarker；1：誘導(dǎo)后的VP6重組菌沉淀；2：Ni-NTA親和層析柱洗滌液；3：VP6重組蛋白洗脫液；4：誘導(dǎo)后的VP7重組菌沉淀；5：Ni-NTA親和層析柱洗滌液；6：VP7重組蛋白洗脫液。在表達(dá)和純化過程中，也遇到了一些問題。在誘導(dǎo)表達(dá)初期，發(fā)現(xiàn)重組蛋白的表達(dá)量較低，通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件，如調(diào)整IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間等，有效提高了重組蛋白的表達(dá)量。在包涵體洗滌過程中，發(fā)現(xiàn)部分雜質(zhì)難以去除，通過增加洗滌次數(shù)和優(yōu)化洗滌緩沖液的配方，有效降低了雜質(zhì)含量。在蛋白復(fù)性過程中，嘗試了多種復(fù)性方法，如透析復(fù)性、稀釋復(fù)性等，最終確定透析復(fù)性法效果較好，但復(fù)性過程中仍存在部分蛋白聚集的問題，后續(xù)可進(jìn)一步優(yōu)化復(fù)性條件，如調(diào)整復(fù)性緩沖液的成分、添加蛋白保護(hù)劑等，以提高復(fù)性效率和蛋白質(zhì)量。3.3類病毒顆粒的體外組裝與鑒定在完成輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP6和VP7的表達(dá)與純化后，將兩者按照不同摩爾比混合，并在特定組裝緩沖液中進(jìn)行體外組裝。通過動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測(cè)量組裝產(chǎn)物的粒徑分布，結(jié)果顯示在VP6和VP7摩爾比為1:1，組裝緩沖液pH值為7.5，離子強(qiáng)度為150mMNaCl，4℃組裝12小時(shí)的條件下，得到的組裝產(chǎn)物粒徑較為均一，平均粒徑約為70-80nm，與天然輪狀病毒的粒徑大小相近（圖8A）。進(jìn)一步對(duì)該條件下組裝得到的產(chǎn)物進(jìn)行透射電子顯微鏡觀察，結(jié)果清晰地顯示出類病毒顆粒呈球形，具有類似天然輪狀病毒的典型結(jié)構(gòu)，表面可見規(guī)則排列的蛋白亞基，呈現(xiàn)出車輪狀外觀（圖8B）。這表明在該優(yōu)化條件下，成功實(shí)現(xiàn)了輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白的體外組裝，形成了形態(tài)完整、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的類病毒顆粒。注：A：動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量的類病毒顆粒粒徑分布；B：透射電子顯微鏡下的類病毒顆粒照片（標(biāo)尺=100nm）。為了深入探究組裝條件對(duì)類病毒顆粒特性的影響，研究了不同蛋白濃度、pH值和離子強(qiáng)度等條件下的組裝情況。在蛋白濃度方面，當(dāng)?shù)鞍卓倽舛鹊陀?.5mg/mL時(shí)，組裝效率較低，難以形成完整的類病毒顆粒，DLS檢測(cè)顯示粒徑分布較寬且平均粒徑偏大，電鏡下可見較多未組裝的蛋白聚集物；當(dāng)?shù)鞍卓倽舛雀哂?.0mg/mL時(shí)，雖然組裝效率有所提高，但類病毒顆粒的穩(wěn)定性下降，在儲(chǔ)存過程中容易發(fā)生聚集和沉淀。在pH值方面，當(dāng)pH值為7.0時(shí)，組裝得到的類病毒顆粒結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定，電鏡下可見部分顆粒出現(xiàn)變形和破損；當(dāng)pH值為8.0時(shí)，VP6和VP7蛋白的溶解性下降，影響組裝效率，DLS檢測(cè)顯示粒徑分布不均勻，存在大量較大粒徑的聚集體。在離子強(qiáng)度方面，當(dāng)NaCl濃度為100mM時(shí)，組裝效率較低，類病毒顆粒的完整性較差，電鏡下可見顆粒表面結(jié)構(gòu)不規(guī)整；當(dāng)NaCl濃度為200mM時(shí)，過高的離子強(qiáng)度導(dǎo)致蛋白之間的相互作用發(fā)生改變，不利于類病毒顆粒的組裝，DLS檢測(cè)顯示平均粒徑明顯增大，且粒徑分布極不均勻。采用免疫印跡（Westernblot）分析對(duì)組裝得到的類病毒顆粒進(jìn)行抗原性檢測(cè)。結(jié)果表明，類病毒顆粒能夠與鼠抗輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白的單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，在約45kDa（VP6）和37kDa（VP7）處出現(xiàn)明顯的條帶（圖9），與預(yù)期的蛋白分子量相符。這進(jìn)一步證實(shí)了組裝得到的類病毒顆粒中含有輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白，且其抗原性與天然病毒相似，為其在輪狀病毒疫苗研發(fā)中的應(yīng)用提供了有力的證據(jù)。注：M：ProteinMarker；1：類病毒顆粒樣品。四、討論4.1大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)中的應(yīng)用本研究成功利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP6和VP7，為輪狀病毒類病毒顆粒的體外組裝提供了關(guān)鍵原料。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)中展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。其表達(dá)量高，在優(yōu)化后的誘導(dǎo)條件下，VP6和VP7重組蛋白的表達(dá)量可達(dá)總細(xì)胞蛋白的較高比例，這使得在大規(guī)模生產(chǎn)中能夠高效獲得大量目標(biāo)蛋白。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成本低，LB培養(yǎng)基價(jià)格低廉，且培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，易于大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，可有效降低生產(chǎn)成本。同時(shí)，該系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和技術(shù)要求相對(duì)較低，便于廣泛應(yīng)用。此外，大腸桿菌遺傳背景清晰，人們對(duì)其基因調(diào)控、代謝途徑等有深入了解，這為表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化和調(diào)控提供了便利。然而，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白時(shí)也存在一些不足。在本研究中，VP6和VP7重組蛋白主要以包涵體形式存在，這可能是由于外源蛋白在大腸桿菌中大量表達(dá)時(shí)，折疊過程受到干擾，導(dǎo)致蛋白錯(cuò)誤折疊并聚集形成包涵體。包涵體的形成不僅增加了蛋白純化和復(fù)性的難度，還可能影響蛋白的活性和功能。包涵體的處理過程較為復(fù)雜，需要經(jīng)過洗滌、溶解、復(fù)性等多個(gè)步驟，且復(fù)性效率往往較低，部分蛋白在復(fù)性過程中會(huì)發(fā)生聚集和沉淀，導(dǎo)致蛋白回收率降低。為提高輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)和可溶性，可采取多種策略。在密碼子優(yōu)化方面，由于不同物種對(duì)密碼子的使用偏好存在差異，輪狀病毒的密碼子使用可能與大腸桿菌不同，這可能導(dǎo)致翻譯過程受阻，影響蛋白表達(dá)。因此，可對(duì)輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，使其符合大腸桿菌的密碼子偏好，提高翻譯效率。通過生物信息學(xué)分析，將輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因中大腸桿菌使用頻率較低的密碼子替換為高頻密碼子，可顯著提高蛋白表達(dá)水平。共表達(dá)伴侶蛋白也是一種有效的策略。伴侶蛋白能夠幫助新生肽鏈正確折疊，防止其錯(cuò)誤折疊和聚集。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，可共表達(dá)GroEL/ES、DnaK/DnaJ/GrpE等伴侶蛋白，以促進(jìn)輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白的正確折疊，提高其可溶性。研究表明，當(dāng)共表達(dá)GroEL/ES伴侶蛋白時(shí)，某些外源蛋白的可溶性得到了顯著提高。還可通過降低誘導(dǎo)溫度，減緩蛋白合成速度，使蛋白有更充足的時(shí)間進(jìn)行正確折疊，減少包涵體的形成。在本研究中，當(dāng)誘導(dǎo)溫度從37℃降低到25℃或30℃時(shí)，重組蛋白的可溶性有所提高。此外，優(yōu)化培養(yǎng)基成分，如添加適量的氨基酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也可能改善蛋白的表達(dá)和可溶性。4.2影響類病毒顆粒體外組裝的因素在類病毒顆粒的體外組裝過程中，多種因素對(duì)組裝效率和顆粒穩(wěn)定性有著顯著影響。蛋白濃度是關(guān)鍵因素之一，當(dāng)?shù)鞍卓倽舛鹊陀?.5mg/mL時(shí)，由于參與組裝的蛋白分子數(shù)量不足，分子間有效碰撞和相互作用的概率較低，導(dǎo)致組裝效率低下，難以形成完整的類病毒顆粒。動(dòng)態(tài)光散射（DLS）檢測(cè)顯示粒徑分布較寬且平均粒徑偏大，這是因?yàn)樯倭康鞍追肿与S機(jī)聚集，無法形成規(guī)則的類病毒顆粒結(jié)構(gòu)，電鏡下可見較多未組裝的蛋白聚集物。而當(dāng)?shù)鞍卓倽舛雀哂?.0mg/mL時(shí)，過高的蛋白濃度使蛋白分子間相互作用過于復(fù)雜，容易形成非特異性聚集，雖然組裝效率有所提高，但類病毒顆粒的穩(wěn)定性下降，在儲(chǔ)存過程中容易發(fā)生聚集和沉淀。過高的蛋白濃度可能導(dǎo)致蛋白分子的折疊和組裝過程受到干擾，無法形成穩(wěn)定的類病毒顆粒結(jié)構(gòu)。pH值對(duì)類病毒顆粒組裝也至關(guān)重要。當(dāng)pH值為7.0時(shí)，組裝得到的類病毒顆粒結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定，電鏡下可見部分顆粒出現(xiàn)變形和破損。這可能是因?yàn)樵谠損H值下，蛋白分子的電荷分布發(fā)生改變，影響了蛋白之間的相互作用，導(dǎo)致類病毒顆粒的結(jié)構(gòu)完整性受到破壞。當(dāng)pH值為8.0時(shí)，VP6和VP7蛋白的溶解性下降，部分蛋白可能會(huì)發(fā)生沉淀，影響組裝效率。DLS檢測(cè)顯示粒徑分布不均勻，存在大量較大粒徑的聚集體，這是由于蛋白溶解性降低，導(dǎo)致組裝過程中形成的顆粒大小不一，且容易聚集。離子強(qiáng)度同樣對(duì)組裝產(chǎn)生重要影響。當(dāng)NaCl濃度為100mM時(shí)，離子強(qiáng)度較低，蛋白分子間的靜電相互作用較強(qiáng)，不利于蛋白分子的有序排列和組裝，導(dǎo)致組裝效率較低，類病毒顆粒的完整性較差，電鏡下可見顆粒表面結(jié)構(gòu)不規(guī)整。當(dāng)NaCl濃度為200mM時(shí)，過高的離子強(qiáng)度會(huì)屏蔽蛋白分子表面的電荷，改變蛋白之間的相互作用，不利于類病毒顆粒的組裝。DLS檢測(cè)顯示平均粒徑明顯增大，且粒徑分布極不均勻，這是因?yàn)檫^高的離子強(qiáng)度使蛋白分子間的相互作用發(fā)生異常，形成的類病毒顆粒大小和形狀不規(guī)則，容易聚集。溫度對(duì)類病毒顆粒的組裝也有一定影響。在較低溫度（如4℃）下，分子熱運(yùn)動(dòng)減緩，蛋白分子有更充足的時(shí)間進(jìn)行有序排列和組裝，有利于形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的類病毒顆粒。而在較高溫度（如37℃）下，分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，蛋白分子的相互作用變得不穩(wěn)定，可能導(dǎo)致組裝過程中出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊和聚集，影響類病毒顆粒的質(zhì)量和穩(wěn)定性。在本研究中，4℃組裝12小時(shí)的條件下，得到的類病毒顆粒粒徑較為均一，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，而在37℃組裝時(shí)，類病毒顆粒的質(zhì)量明顯下降。為了優(yōu)化類病毒顆粒的體外組裝條件，提高組裝效率和顆粒穩(wěn)定性，可采取一系列措施。在蛋白濃度方面，應(yīng)根據(jù)不同的輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白，通過實(shí)驗(yàn)精確確定最佳的蛋白總濃度，確保蛋白分子既能充分參與組裝，又不會(huì)因濃度過高或過低影響組裝效果。在pH值方面，可進(jìn)一步研究不同pH值對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和相互作用的影響，尋找最適合組裝的pH值范圍，并在組裝過程中嚴(yán)格控制pH值的穩(wěn)定性。對(duì)于離子強(qiáng)度，可嘗試不同種類和濃度的離子組合，優(yōu)化組裝緩沖液的離子組成，以獲得最佳的組裝效果。在溫度方面，可探索不同溫度下的組裝動(dòng)力學(xué)，確定最適宜的組裝溫度和時(shí)間。還可以通過添加一些輔助物質(zhì)，如分子伴侶、抗氧化劑等，幫助蛋白正確折疊和組裝，提高類病毒顆粒的質(zhì)量和穩(wěn)定性。4.3類病毒顆粒作為輪狀病毒疫苗的潛力類病毒顆粒（VLPs）作為輪狀病毒疫苗展現(xiàn)出了巨大的潛力，在免疫原性、安全性和穩(wěn)定性等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。從免疫原性角度來看，VLPs具有高度的免疫原性，能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。其結(jié)構(gòu)與天然輪狀病毒相似，表面展示的重復(fù)抗原表位可以模擬天然病毒感染人體的過程，從而激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將輪狀病毒VLPs免疫小鼠后，小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了高水平的特異性抗體，包括IgG和IgA等。這些抗體能夠識(shí)別和結(jié)合輪狀病毒，中和病毒的活性，阻止病毒感染宿主細(xì)胞。VLPs還能夠激活細(xì)胞免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL），這些CTL可以特異性地殺傷被輪狀病毒感染的細(xì)胞，從而清除病毒感染。在安全性方面，VLPs不含病毒的遺傳物質(zhì)，不存在毒力返祖或感染的風(fēng)險(xiǎn)，這是其相較于傳統(tǒng)減毒活疫苗的重要優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)減毒活疫苗雖然能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)，但存在一定的安全隱患，如可能發(fā)生毒力返祖，導(dǎo)致疫苗接種者感染疾病。而VLPs由于不含有病毒的遺傳物質(zhì)，不會(huì)在體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和傳播，大大降低了疫苗接種的風(fēng)險(xiǎn)。在臨床試驗(yàn)中，使用VLPs疫苗的受試者未出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，表明其安全性較高。穩(wěn)定性也是VLPs作為輪狀病毒疫苗的一大優(yōu)勢(shì)。VLPs具有較為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，在不同的環(huán)境條件下，如溫度、pH值等變化時(shí)，仍能保持其完整性和抗原性。在常溫下保存一段時(shí)間后，VLPs的形態(tài)和免疫原性沒有明顯變化，這使得其在疫苗的儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中具有更好的適應(yīng)性，能夠降低對(duì)冷鏈的依賴，提高疫苗的可及性。與其他疫苗形式相比，類病毒顆粒疫苗具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。與傳統(tǒng)的減毒活疫苗相比，VLPs疫苗不存在毒力返祖的風(fēng)險(xiǎn)，安全性更高；與滅活疫苗相比，VLPs疫苗的免疫原性更強(qiáng)，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生更有效的免疫反應(yīng)。VLPs疫苗也存在一些不足之處。其制備過程相對(duì)復(fù)雜，需要經(jīng)過基因工程表達(dá)、蛋白純化和體外組裝等多個(gè)步驟，生產(chǎn)成本較高。目前VLPs疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)還不夠成熟，產(chǎn)量有限，難以滿足市場(chǎng)的需求。展望未來，類病毒顆粒作為輪狀病毒疫苗仍有許多研究方向值得深入探索。臨床試驗(yàn)驗(yàn)證免疫效果是關(guān)鍵一步，需要開展大規(guī)模、多中心的臨床試驗(yàn)，進(jìn)一步評(píng)估VLPs疫苗在人體中的免疫原性、安全性和有效性。通過臨床試驗(yàn)，確定最佳的疫苗接種劑量