基于定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)挖掘白血病細(xì)胞株中甲基化沉默基因的探索一、引言1.1研究背景與意義白血病，作為一種常見且嚴(yán)重的造血系統(tǒng)惡性疾病，給人類健康帶來了巨大威脅。在我國(guó)腫瘤死亡率的排位中，白血病位居第6位，而在青少年的惡性腫瘤里，其發(fā)病率和死亡率更是長(zhǎng)期占據(jù)首位，0-9歲和60歲以上是白血病發(fā)病的兩個(gè)高峰。白血病患者會(huì)出現(xiàn)骨髓造血功能抑制的情況，導(dǎo)致人體正常血細(xì)胞降低，具體表現(xiàn)為白細(xì)胞減少使得抵抗力下降，容易發(fā)生感染；紅細(xì)胞減少引發(fā)缺氧以及貧血；血小板減少則導(dǎo)致容易出血。此外，白血病細(xì)胞還會(huì)通過外周血浸潤(rùn)到各個(gè)臟器，像淋巴結(jié)、肝、脾、大腦等，進(jìn)而出現(xiàn)淋巴結(jié)腫大、肝脾腫大，甚至?xí)l(fā)中樞神經(jīng)的相關(guān)病變，例如精神異常、昏迷乃至意識(shí)喪失等。盡管醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)Π籽〉难芯坎粩嗌钊?，但目前其發(fā)病機(jī)制仍未被完全闡明?，F(xiàn)有研究表明，白血病的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素參與、多步驟的復(fù)雜過程，遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變?cè)谄渲邪缪葜P(guān)鍵角色。在眾多表觀遺傳學(xué)機(jī)制中，DNA甲基化作為基因表達(dá)調(diào)控最常見的方式之一，在白血病的發(fā)病過程里起著舉足輕重的作用。DNA甲基化主要是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，將甲基基團(tuán)添加到特定的DNA區(qū)域，通常是CpG島，這種修飾大多會(huì)抑制基因的表達(dá)。當(dāng)基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島發(fā)生高甲基化時(shí)，會(huì)阻礙轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，從而使基因無法正常轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致該基因沉默，無法發(fā)揮其正常的生物學(xué)功能。在白血病中，大量抑癌基因就因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化而沉默，失去了對(duì)細(xì)胞增殖、分化和凋亡的正常調(diào)控能力，進(jìn)而促使白血病的發(fā)生和發(fā)展。對(duì)白血病細(xì)胞株中的甲基化沉默基因進(jìn)行篩選，具有極為重要的意義。從發(fā)病機(jī)制研究的角度來看，這些甲基化沉默基因很可能是白血病發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵調(diào)控基因，深入研究它們有助于我們更全面、深入地了解白血病的發(fā)病機(jī)制，為攻克這一惡性疾病提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。在臨床應(yīng)用方面，這些基因有望成為白血病早期診斷的生物標(biāo)志物。通過檢測(cè)血液或骨髓樣本中這些基因的甲基化狀態(tài)，能夠?qū)崿F(xiàn)白血病的早期精準(zhǔn)診斷，提高疾病的早期發(fā)現(xiàn)率，為患者爭(zhēng)取寶貴的治療時(shí)間。并且，它們還有可能成為白血病治療的特異性靶點(diǎn)，為開發(fā)新的靶向治療藥物和治療策略提供方向，從而提高白血病的治療效果，改善患者的預(yù)后和生存質(zhì)量。鑒于此，本研究擬采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)白血病細(xì)胞株中的甲基化沉默基因展開篩選，期望為白血病的防治工作提供新的思路和理論依據(jù)。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在白血病甲基化沉默基因的研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了一系列重要成果。國(guó)外方面，眾多研究聚焦于特定基因的甲基化狀態(tài)與白血病發(fā)病、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)聯(lián)。如在急性髓系白血病（AML）的研究中，有研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)關(guān)鍵基因啟動(dòng)子區(qū)域呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致基因沉默，這些基因涉及細(xì)胞增殖、凋亡、分化等關(guān)鍵生物學(xué)過程，它們的異常甲基化被認(rèn)為是AML發(fā)病機(jī)制的重要組成部分。一項(xiàng)發(fā)表于《NatureGenetics》的研究通過對(duì)大量AML患者樣本的分析，深入探討了DNA甲基化模式與白血病分子亞型之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)特定的甲基化特征能夠區(qū)分不同的AML亞型，且與患者的預(yù)后密切相關(guān)。國(guó)內(nèi)學(xué)者也在這一領(lǐng)域積極探索，取得了不少具有重要價(jià)值的成果。例如，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院的研究團(tuán)隊(duì)對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病（APL）的甲基化譜進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)了一些在APL發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用的甲基化沉默基因，這些基因的異常甲基化不僅參與了APL的發(fā)病，還為APL的精準(zhǔn)診斷和治療提供了潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。在定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于白血病研究方面，國(guó)外已開展了大量前沿研究。以慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）為例，有研究運(yùn)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)CML患者在疾病不同階段（慢性期、加速期、急變期）的細(xì)胞蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，鑒定出一系列差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。這些差異蛋白參與了多種信號(hào)通路，如酪氨酸激酶信號(hào)通路、細(xì)胞周期調(diào)控通路等，它們的表達(dá)變化與CML的疾病進(jìn)展密切相關(guān)，為深入理解CML的發(fā)病機(jī)制和疾病進(jìn)展提供了關(guān)鍵線索。此外，在AML的研究中，國(guó)外學(xué)者利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)AML細(xì)胞系和患者樣本進(jìn)行分析，篩選出與AML耐藥相關(guān)的蛋白質(zhì)標(biāo)志物，為解決AML耐藥問題提供了新的研究方向。國(guó)內(nèi)在定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于白血病研究方面也取得了顯著進(jìn)展。一些研究團(tuán)隊(duì)通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)白血病細(xì)胞株在藥物處理前后的蛋白質(zhì)表達(dá)變化進(jìn)行分析，揭示了藥物作用的分子機(jī)制，為白血病的藥物研發(fā)和治療方案優(yōu)化提供了重要的理論依據(jù)。如中南大學(xué)的研究人員采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)白血病細(xì)胞株進(jìn)行研究，篩選出多個(gè)潛在的甲基化沉默基因，并對(duì)其功能進(jìn)行了初步驗(yàn)證，為白血病的表觀遺傳學(xué)研究提供了有價(jià)值的信息。盡管國(guó)內(nèi)外在白血病甲基化沉默基因及定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用方面已取得豐碩成果，但仍存在一些不足之處。在甲基化沉默基因研究方面，雖然已鑒定出許多與白血病相關(guān)的甲基化基因，但對(duì)于這些基因如何協(xié)同作用，以及它們?cè)诎籽“l(fā)病過程中的具體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，尚未完全明確。此外，目前的研究主要集中在常見的白血病亞型，對(duì)于一些罕見白血病亞型的甲基化沉默基因研究相對(duì)較少。在定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用方面，該技術(shù)在白血病研究中的標(biāo)準(zhǔn)化流程和數(shù)據(jù)分析方法仍有待進(jìn)一步完善。不同研究之間由于實(shí)驗(yàn)條件和數(shù)據(jù)分析方法的差異，導(dǎo)致結(jié)果的可比性和重復(fù)性受到一定影響。而且，目前定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在白血病臨床診斷和治療中的轉(zhuǎn)化應(yīng)用還相對(duì)較少，距離實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療的目標(biāo)仍有一定差距。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，精準(zhǔn)篩選出白血病細(xì)胞株中的甲基化沉默基因，深入探究其在白血病發(fā)生發(fā)展過程中的潛在作用機(jī)制，為白血病的早期診斷、靶向治療以及預(yù)后評(píng)估提供全新的理論依據(jù)和潛在的生物標(biāo)志物。在研究?jī)?nèi)容上，首先進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)與處理，選取典型的白血病細(xì)胞株，如HL-60（急性髓系白血病細(xì)胞株）、K562（慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株）等，在適宜的細(xì)胞培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，確保細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和活性。之后，使用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-aza-2'dC）對(duì)白血病細(xì)胞株進(jìn)行處理。設(shè)置不同的濃度梯度（如0.5μmol/L、1.0μmol/L、5.0μmol/L等）和處理時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h等），通過MTT比色試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、瑞氏染色及Hoechst33342染色等方法，全面觀察5-aza-2'dC對(duì)白血病細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、分化及凋亡的影響，確定最佳的處理濃度和時(shí)間，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供可靠條件。接著運(yùn)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行差異蛋白篩選，采用雙向熒光差異凝膠電泳（2D-DIGE）技術(shù)，對(duì)5-aza-2'dC處理前后的白血病細(xì)胞蛋白質(zhì)組進(jìn)行分離和分析，獲得高分辨率的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜。通過圖像分析軟件，精確識(shí)別和量化差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。將差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)從凝膠中切取下來，經(jīng)過酶解處理后，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)進(jìn)行鑒定，確定差異表達(dá)蛋白質(zhì)的氨基酸序列和分子量等信息，進(jìn)而通過生物信息學(xué)分析，如基因本體論（GO）分析、京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析等，深入了解這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)參與的生物學(xué)過程、細(xì)胞組成和分子功能，以及相關(guān)的信號(hào)通路，初步篩選出與甲基化調(diào)控密切相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)。在驗(yàn)證潛在甲基化沉默基因時(shí)，從定量蛋白質(zhì)組學(xué)篩選出的差異表達(dá)蛋白質(zhì)中，挑選出部分可能受甲基化調(diào)控的基因。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)，檢測(cè)這些基因在5-aza-2'dC處理前后白血病細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平變化，驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的準(zhǔn)確性。運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）技術(shù)，檢測(cè)相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，進(jìn)一步確認(rèn)基因表達(dá)的變化。使用甲基化特異性PCR（MS-PCR）技術(shù)，對(duì)候選基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，明確基因是否因甲基化而沉默。通過亞硫酸氫鹽測(cè)序（BSP）等方法，精確分析基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化位點(diǎn)的具體分布和甲基化程度，深入探究甲基化與基因沉默之間的關(guān)聯(lián)。本研究還會(huì)進(jìn)行功能驗(yàn)證與機(jī)制研究，構(gòu)建針對(duì)潛在甲基化沉默基因的過表達(dá)載體和RNA干擾載體，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔等方法，將載體導(dǎo)入白血病細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)基因的過表達(dá)或沉默。采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法、EdU摻入法）、細(xì)胞凋亡檢測(cè)（如AnnexinV-FITC/PI雙染法）、細(xì)胞周期分析（流式細(xì)胞術(shù)）等方法，全面研究基因表達(dá)改變對(duì)白血病細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，明確基因在白血病細(xì)胞增殖、凋亡、分化等過程中的功能。利用信號(hào)通路抑制劑和激動(dòng)劑，結(jié)合蛋白質(zhì)免疫印跡、免疫共沉淀等技術(shù)，深入探究潛在甲基化沉默基因參與的信號(hào)傳導(dǎo)通路，揭示其在白血病發(fā)生發(fā)展中的分子調(diào)控機(jī)制。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究采用實(shí)驗(yàn)研究法，以白血病細(xì)胞株為研究對(duì)象，綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，系統(tǒng)地篩選白血病細(xì)胞株中的甲基化沉默基因。在細(xì)胞培養(yǎng)與處理環(huán)節(jié)，選取HL-60、K562等白血病細(xì)胞株，將其置于含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，確保細(xì)胞的良好生長(zhǎng)和活性。在處理細(xì)胞時(shí)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白血病細(xì)胞接種于6孔板中，設(shè)置不同濃度的5-aza-2'dC處理組和對(duì)照組。處理組分別加入濃度為0.5μmol/L、1.0μmol/L、5.0μmol/L的5-aza-2'dC，對(duì)照組加入等量的不含藥物的培養(yǎng)基。分別在處理24h、48h、72h后，收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在蛋白質(zhì)分離與鑒定方面，采用雙向熒光差異凝膠電泳（2D-DIGE）技術(shù)分離蛋白質(zhì)。首先，將5-aza-2'dC處理前后的白血病細(xì)胞收集后，加入細(xì)胞裂解液，在冰上裂解30min，然后在4℃、12000r/min的條件下離心30min，取上清液作為蛋白質(zhì)樣品。采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，將不同樣品的蛋白質(zhì)濃度調(diào)整一致。取適量蛋白質(zhì)樣品，分別標(biāo)記Cy3和Cy5熒光染料，內(nèi)標(biāo)樣品標(biāo)記Cy2熒光染料。將標(biāo)記好的樣品混合后，進(jìn)行等電聚焦電泳，聚焦條件為：20℃，50V12h，250V1h，500V1h，1000V1h，8000V至總聚焦電壓達(dá)到60000Vh。等電聚焦結(jié)束后，將膠條平衡后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。電泳結(jié)束后，利用Typhoon熒光掃描儀對(duì)凝膠進(jìn)行掃描，獲取蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜。通過圖像分析軟件（如DeCyder2D軟件），對(duì)不同凝膠圖像進(jìn)行匹配和分析，識(shí)別出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)（差異倍數(shù)≥1.5且P<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。對(duì)于差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)的鑒定，將差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)從凝膠中切取下來，用胰蛋白酶進(jìn)行酶解。酶解后的肽段采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)進(jìn)行分析。MALDI-TOF-MS分析時(shí)，將酶解后的肽段與基質(zhì)混合后點(diǎn)樣于靶板上，在質(zhì)譜儀中進(jìn)行離子化和檢測(cè)，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）。通過Mascot等數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，根據(jù)PMF匹配結(jié)果鑒定蛋白質(zhì)。LC-MS/MS分析時(shí)，將酶解后的肽段通過液相色譜進(jìn)行分離，然后進(jìn)入串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析，獲得肽段的氨基酸序列信息，通過數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定蛋白質(zhì)。在基因驗(yàn)證與功能研究階段，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)驗(yàn)證基因表達(dá)變化。提取5-aza-2'dC處理前后白血病細(xì)胞的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，利用SYBRGreen熒光染料法進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。通過比較Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果中基因表達(dá)的變化。運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平，將5-aza-2'dC處理前后的白血病細(xì)胞裂解，提取總蛋白質(zhì)，采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取等量蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h后，加入特異性一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗膜3次后，采用化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，確定蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。使用甲基化特異性PCR（MS-PCR）技術(shù)檢測(cè)基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，提取白血病細(xì)胞的基因組DNA，用亞硫酸氫鈉對(duì)DNA進(jìn)行修飾，使未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)電泳條帶判斷基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)。通過亞硫酸氫鹽測(cè)序（BSP）方法分析甲基化位點(diǎn)分布，將亞硫酸氫鈉修飾后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至T載體中，挑取陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。通過與原始序列比對(duì)，分析基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化位點(diǎn)的具體分布和甲基化程度。在功能驗(yàn)證與機(jī)制研究中，構(gòu)建潛在甲基化沉默基因的過表達(dá)載體和RNA干擾載體。對(duì)于過表達(dá)載體，從cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增目的基因，將其克隆至真核表達(dá)載體（如pcDNA3.1）中，構(gòu)建過表達(dá)載體。對(duì)于RNA干擾載體，設(shè)計(jì)針對(duì)目的基因的小干擾RNA（siRNA）序列，將其克隆至RNA干擾載體（如pSilencer4.1-CMVneo）中，構(gòu)建RNA干擾載體。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電穿孔等方法，將載體導(dǎo)入白血病細(xì)胞中。以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染為例，將白血病細(xì)胞接種于24孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時(shí)，將適量的載體和脂質(zhì)體混合，按照脂質(zhì)體說明書的步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后4-6h更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法、EdU摻入法）檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，CCK-8法是在轉(zhuǎn)染后的白血病細(xì)胞中加入CCK-8試劑，孵育1-4h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處的吸光度值，根據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞增殖率。EdU摻入法是在細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入EdU，孵育一段時(shí)間后，按照試劑盒說明書進(jìn)行染色和檢測(cè)，通過熒光顯微鏡觀察EdU陽性細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞增殖率。運(yùn)用細(xì)胞凋亡檢測(cè)（如AnnexinV-FITC/PI雙染法）檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，將轉(zhuǎn)染后的白血病細(xì)胞收集后，用BindingBuffer重懸細(xì)胞，加入AnnexinV-FITC和PI染料，避光孵育15-30min，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。利用細(xì)胞周期分析（流式細(xì)胞術(shù)）檢測(cè)細(xì)胞周期分布，將轉(zhuǎn)染后的白血病細(xì)胞用70%乙醇固定，4℃過夜。次日，用PBS洗去乙醇，加入RNaseA和PI染料，避光孵育30min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。利用信號(hào)通路抑制劑和激動(dòng)劑，結(jié)合蛋白質(zhì)免疫印跡、免疫共沉淀等技術(shù)，研究潛在甲基化沉默基因參與的信號(hào)傳導(dǎo)通路。如在細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入特定的信號(hào)通路抑制劑或激動(dòng)劑，處理一定時(shí)間后，收集細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，通過蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)信號(hào)通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平和表達(dá)水平變化。采用免疫共沉淀技術(shù)，研究目的基因與信號(hào)通路中其他蛋白的相互作用關(guān)系，揭示其在白血病發(fā)生發(fā)展中的分子調(diào)控機(jī)制。本研究的技術(shù)路線如圖1所示：[此處插入技術(shù)路線圖，圖中清晰展示從細(xì)胞培養(yǎng)、5-aza-2'dC處理、蛋白質(zhì)組學(xué)分析、基因驗(yàn)證到功能研究的整個(gè)流程，各步驟之間用箭頭清晰連接，標(biāo)注每一步的關(guān)鍵技術(shù)和操作要點(diǎn)][此處插入技術(shù)路線圖，圖中清晰展示從細(xì)胞培養(yǎng)、5-aza-2'dC處理、蛋白質(zhì)組學(xué)分析、基因驗(yàn)證到功能研究的整個(gè)流程，各步驟之間用箭頭清晰連接，標(biāo)注每一步的關(guān)鍵技術(shù)和操作要點(diǎn)]二、相關(guān)理論與技術(shù)基礎(chǔ)2.1白血病概述白血病，作為一種造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。其發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，涉及多個(gè)層面的異常變化。從細(xì)胞層面來看，白血病是由于造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致白血病細(xì)胞在骨髓和其他造血組織中不受控制地大量增殖，并逐漸取代正常的造血細(xì)胞，進(jìn)而抑制正常的造血功能。這些白血病細(xì)胞還具有較強(qiáng)的浸潤(rùn)能力，能夠侵犯全身各個(gè)組織和器官，引發(fā)一系列嚴(yán)重的臨床癥狀，如貧血、出血、感染發(fā)熱以及肝脾淋巴結(jié)腫大和骨骼疼痛等。根據(jù)白血病細(xì)胞的成熟程度和自然病程，白血病可分為急性白血病和慢性白血病兩大類。急性白血病起病急驟，病情發(fā)展迅速，骨髓中異常的原始細(xì)胞及幼稚細(xì)胞（白血病細(xì)胞）大量增殖并浸潤(rùn)各種器官和組織，正常造血功能受到嚴(yán)重抑制，其自然病程通常僅為幾個(gè)月。根據(jù)白血病細(xì)胞的類型，急性白血病又可進(jìn)一步細(xì)分為急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）和急性髓系白血?。ˋML）。ALL是一種起源于淋巴細(xì)胞的B系或T系細(xì)胞在骨髓內(nèi)異常增生的惡性腫瘤性疾病，多見于兒童和青少年，男性發(fā)病率略高于女性。AML則是髓系造血干祖細(xì)胞發(fā)生的惡性疾病，白血病細(xì)胞在骨髓中異常增生，不僅抑制正常造血，還可廣泛浸潤(rùn)肝、脾、淋巴結(jié)等髓外臟器，在中老年人中更為常見，男性患者相對(duì)較多。慢性白血病的起病相對(duì)隱匿，病程進(jìn)展較為緩慢。白血病細(xì)胞在骨髓及其他造血組織中呈惡性、無限制地增生，并浸潤(rùn)全身各組織和臟器，導(dǎo)致周圍血液血細(xì)胞在量和質(zhì)上均出現(xiàn)明顯變化。根據(jù)白血病細(xì)胞的類型，慢性白血病主要分為慢性髓系白血?。–ML）和慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）。CML是一種發(fā)生在早期多能造血干細(xì)胞上的惡性骨髓增生性疾病，多見于中年人群發(fā)病，在疾病早期，患者往往無明顯自覺癥狀，隨著病情的進(jìn)展，逐漸會(huì)出現(xiàn)乏力、腹部不適、體重下降等癥狀。CLL是一種單克隆性小淋巴細(xì)胞疾病，細(xì)胞形態(tài)類似成熟淋巴細(xì)胞，這些細(xì)胞會(huì)蓄積于血液、骨髓及脾臟、淋巴結(jié)等淋巴組織，在老年人中較為常見，男性患者多于女性。在白血病的研究中，細(xì)胞株起著至關(guān)重要的作用，它們?yōu)樯钊胩骄堪籽〉陌l(fā)病機(jī)制、開展藥物研發(fā)以及評(píng)估治療效果等提供了不可或缺的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｆ渲?，HL-60細(xì)胞株是一種廣泛應(yīng)用于白血病研究的急性髓系白血病細(xì)胞株。它最初是從一名36歲女性急性早幼粒細(xì)胞白血病患者體內(nèi)分離獲得。HL-60細(xì)胞具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，它能夠在含有營(yíng)養(yǎng)和抗生素的培養(yǎng)基中以懸浮培養(yǎng)的形式持續(xù)增殖，倍增時(shí)間大約為36至48小時(shí)。在形態(tài)上，HL-60細(xì)胞表現(xiàn)出嗜中性早幼粒細(xì)胞的形態(tài)特征。并且，HL-60細(xì)胞可以通過多種化學(xué)誘導(dǎo)劑，如二甲基亞砜（DMSO）、全反式維甲酸（ATRA）、1,25-二羥維生素D3等，誘導(dǎo)分化為成熟粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。這一特性使得HL-60細(xì)胞成為研究髓系細(xì)胞分化、增殖、凋亡以及藥物敏感性等方面的理想模型。例如，在研究視黃酸（RA）介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)細(xì)胞分化的影響時(shí)，HL-60細(xì)胞就發(fā)揮了重要作用。RA與RARα結(jié)合后，能夠激活下游的轉(zhuǎn)錄因子，如核因子κB（NFκB）和轉(zhuǎn)錄因子ERK，從而調(diào)控基因表達(dá)，促進(jìn)HL-60細(xì)胞的分化。此外，HL-60細(xì)胞還被廣泛應(yīng)用于抗癌藥物的活性評(píng)估。研究發(fā)現(xiàn)，α-番茄堿能夠抑制HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡，其作用機(jī)制涉及NF-κB的激活以及對(duì)Bcl-2和Survivin等凋亡相關(guān)蛋白的影響。2.2DNA甲基化與甲基化沉默基因DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾方式，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）為甲基供體，將甲基基團(tuán)共價(jià)連接到DNA分子中特定的堿基上，通常是CpG二核苷酸中胞嘧啶的5'碳原子，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）。這種修飾方式能夠在不改變DNA序列的前提下，對(duì)基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的分化、發(fā)育以及疾病的發(fā)生發(fā)展等生物學(xué)過程。在哺乳動(dòng)物基因組中，DNA甲基化主要發(fā)生在CpG島區(qū)域。CpG島是指DNA序列中富含CpG二核苷酸的區(qū)域，其長(zhǎng)度通常在幾百到幾千個(gè)堿基對(duì)之間，這些區(qū)域大多位于基因的啟動(dòng)子、第一外顯子和5'非翻譯區(qū)等位置。正常情況下，基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島通常處于非甲基化狀態(tài)，使得轉(zhuǎn)錄因子能夠順利結(jié)合到DNA上，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過程，從而保證基因的正常表達(dá)。然而，當(dāng)某些因素導(dǎo)致基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島發(fā)生高甲基化時(shí)，甲基基團(tuán)的存在會(huì)阻礙轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，或者招募一些抑制性的蛋白質(zhì)復(fù)合物，如甲基化CpG結(jié)合蛋白（MBD）等，這些蛋白能夠與甲基化的CpG島結(jié)合，進(jìn)而改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，使其變得更加緊密，形成異染色質(zhì)狀態(tài)，最終抑制基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致該基因沉默，無法發(fā)揮其正常的生物學(xué)功能。DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多個(gè)層面的相互作用。從直接作用來看，高甲基化的CpG島會(huì)改變DNA的物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)，使得轉(zhuǎn)錄因子無法識(shí)別和結(jié)合到相應(yīng)的DNA序列上，從而阻斷了轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，抑制基因轉(zhuǎn)錄。例如，在某些腫瘤相關(guān)基因中，啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化會(huì)直接阻礙轉(zhuǎn)錄因子E2F等的結(jié)合，導(dǎo)致基因無法正常轉(zhuǎn)錄，失去對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用。從間接作用角度而言，甲基化的CpG島能夠招募MBD家族蛋白，如MeCP2、MBD1等，這些蛋白含有甲基化CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能夠特異性地識(shí)別和結(jié)合甲基化的CpG位點(diǎn)。結(jié)合后的MBD蛋白可以進(jìn)一步招募其他染色質(zhì)修飾酶和轉(zhuǎn)錄抑制因子，如組蛋白去乙酰化酶（HDAC）等，HDAC能夠去除組蛋白上的乙?；?，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更加緊密，降低基因的可及性，抑制基因表達(dá)。此外，DNA甲基化還可以通過影響染色質(zhì)重塑復(fù)合物的活性，改變?nèi)旧|(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，間接調(diào)控基因表達(dá)。染色質(zhì)重塑復(fù)合物能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量，改變核小體在DNA上的位置和結(jié)構(gòu)，影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合。而DNA甲基化狀態(tài)的改變可能會(huì)影響染色質(zhì)重塑復(fù)合物與DNA的相互作用，進(jìn)而影響基因的轉(zhuǎn)錄活性。在白血病的發(fā)生發(fā)展過程中，甲基化沉默基因扮演著至關(guān)重要的角色。眾多研究表明，大量與白血病相關(guān)的基因，尤其是一些抑癌基因，會(huì)因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化而沉默，這被認(rèn)為是白血病發(fā)病的重要機(jī)制之一。例如，在急性髓系白血病（AML）中，p15INK4b基因是一種重要的抑癌基因，它能夠通過抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的活性，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞增殖。然而，在許多AML患者中，p15INK4b基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，導(dǎo)致該基因沉默，失去對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，使得白血病細(xì)胞能夠不受控制地增殖。又如，在慢性粒細(xì)胞白血病（CML）中，RASSF1A基因也是一個(gè)關(guān)鍵的抑癌基因，它參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移等過程。研究發(fā)現(xiàn)，CML患者中RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化頻率明顯增加，導(dǎo)致基因沉默，這與CML的疾病進(jìn)展密切相關(guān)。此外，在白血病的發(fā)生發(fā)展過程中，除了抑癌基因的甲基化沉默外，一些與細(xì)胞分化、凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)等相關(guān)的基因也會(huì)因甲基化異常而沉默，這些基因的異常甲基化會(huì)破壞細(xì)胞正常的生物學(xué)功能和信號(hào)通路，共同促進(jìn)白血病的發(fā)生和發(fā)展。2.3定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)原理與方法定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的重要組成部分，它旨在對(duì)生物樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行全面、準(zhǔn)確的定量分析，從而揭示蛋白質(zhì)在不同生理病理狀態(tài)下的表達(dá)變化，為深入理解生物學(xué)過程和疾病機(jī)制提供關(guān)鍵信息。其核心原理是基于對(duì)蛋白質(zhì)或其酶解肽段的定量檢測(cè)，通過比較不同樣品中蛋白質(zhì)的含量差異，來識(shí)別與特定生物學(xué)過程或疾病相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。在眾多定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中，熒光差異雙向凝膠電泳（2D-DIGE）是一種經(jīng)典且常用的方法。2D-DIGE技術(shù)結(jié)合了雙向凝膠電泳和熒光標(biāo)記技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)多個(gè)樣品中蛋白質(zhì)的同時(shí)分離和定量分析。在實(shí)驗(yàn)過程中，首先需要對(duì)不同樣品的蛋白質(zhì)進(jìn)行熒光染料標(biāo)記。常用的熒光染料有Cy2、Cy3和Cy5等，這些染料具有高靈敏度、高分辨率和良好的熒光穩(wěn)定性等特點(diǎn)。將不同樣品的蛋白質(zhì)分別標(biāo)記上不同的熒光染料，例如，將對(duì)照組樣品的蛋白質(zhì)標(biāo)記為Cy3，實(shí)驗(yàn)組樣品的蛋白質(zhì)標(biāo)記為Cy5，同時(shí)設(shè)置一個(gè)內(nèi)標(biāo)樣品，將其蛋白質(zhì)標(biāo)記為Cy2。內(nèi)標(biāo)樣品是由所有待分析樣品等比例混合而成，它在后續(xù)的分析中起著重要的校準(zhǔn)作用，能夠有效減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高定量的準(zhǔn)確性。標(biāo)記完成后，將標(biāo)記好的樣品混合在一起，進(jìn)行雙向凝膠電泳分離。雙向凝膠電泳是基于蛋白質(zhì)的兩個(gè)重要特性，即等電點(diǎn)和分子量，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的技術(shù)。在第一向等電聚焦電泳中，蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點(diǎn)的不同在pH梯度膠上進(jìn)行分離，等電點(diǎn)相同的蛋白質(zhì)會(huì)聚集在同一位置。在第二向SDS-PAGE電泳中，蛋白質(zhì)根據(jù)其分子量的大小在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分離，分子量小的蛋白質(zhì)遷移速度快，位于凝膠的前端，分子量大的蛋白質(zhì)遷移速度慢，位于凝膠的后端。經(jīng)過雙向凝膠電泳后，不同的蛋白質(zhì)在凝膠上形成了二維分布的蛋白質(zhì)點(diǎn)圖譜，每個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)代表一種蛋白質(zhì)。電泳結(jié)束后，利用熒光掃描儀對(duì)凝膠進(jìn)行掃描，獲取不同熒光通道下的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜。通過圖像分析軟件，如DeCyder2D軟件，對(duì)不同熒光通道的圖像進(jìn)行匹配和分析，識(shí)別出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。軟件會(huì)根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化，計(jì)算出每個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在不同樣品中的相對(duì)表達(dá)量。一般來說，差異倍數(shù)≥1.5且P<0.05的蛋白質(zhì)點(diǎn)被視為差異表達(dá)顯著的蛋白質(zhì)點(diǎn)。這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)可能與所研究的生物學(xué)過程或疾病狀態(tài)密切相關(guān)，是后續(xù)深入研究的重點(diǎn)對(duì)象。除了2D-DIGE技術(shù)，同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（iTRAQ）技術(shù)也是一種廣泛應(yīng)用的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法。iTRAQ技術(shù)的原理是利用一組同位素標(biāo)記試劑，對(duì)不同樣品中的蛋白質(zhì)酶解肽段進(jìn)行標(biāo)記。這些標(biāo)記試劑具有相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但含有不同質(zhì)量數(shù)的同位素標(biāo)簽，如113、114、115、116、117、118、119和121等。在標(biāo)記過程中，不同樣品的肽段與不同質(zhì)量數(shù)的同位素標(biāo)簽結(jié)合，形成帶有不同質(zhì)量標(biāo)簽的肽段混合物。然后，將標(biāo)記后的肽段混合物進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析。在質(zhì)譜分析中，帶有不同同位素標(biāo)簽的相同肽段在一級(jí)質(zhì)譜中表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比，但在二級(jí)質(zhì)譜中，由于同位素標(biāo)簽的質(zhì)量差異，會(huì)產(chǎn)生不同質(zhì)量數(shù)的報(bào)告離子。通過檢測(cè)這些報(bào)告離子的強(qiáng)度，就可以定量分析不同樣品中相應(yīng)肽段的相對(duì)含量，進(jìn)而推斷出蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。iTRAQ技術(shù)具有高通量、高靈敏度和高準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)，能夠同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行定量分析，適用于大規(guī)模的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。例如，在腫瘤研究中，利用iTRAQ技術(shù)可以比較腫瘤組織和正常組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)差異，篩選出與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，為腫瘤的診斷和治療提供潛在的生物標(biāo)志物。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料本研究選用了多種白血病細(xì)胞株，包括HL-60細(xì)胞株（急性髓系白血病細(xì)胞株）、K562細(xì)胞株（慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株）、Kasumi-1細(xì)胞株（人急性原粒細(xì)胞白血病細(xì)胞）以及Mo7e細(xì)胞株（人巨細(xì)胞白血病細(xì)胞株）。這些細(xì)胞株均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），確保了細(xì)胞來源的可靠性和穩(wěn)定性。在主要試劑方面，使用的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑為5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-aza-2'dC），購(gòu)自Sigma公司。該試劑在研究DNA甲基化相關(guān)機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，通過抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，能夠誘導(dǎo)DNA去甲基化，從而使甲基化沉默的基因重新表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基為RPMI-1640培養(yǎng)基，購(gòu)自Gibco公司。培養(yǎng)基中添加了10%胎牛血清（FBS），為細(xì)胞生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)因子。此外，還添加了100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染。細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力檢測(cè)采用臺(tái)盼藍(lán)染液，購(gòu)自Solarbio公司。臺(tái)盼藍(lán)是一種細(xì)胞活性染料，能夠區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，通過計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞的數(shù)量，可以準(zhǔn)確評(píng)估細(xì)胞的活力。蛋白質(zhì)提取使用的裂解液為RIPA裂解液，購(gòu)自Beyotime公司。RIPA裂解液能夠有效裂解細(xì)胞，釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，為后續(xù)的蛋白質(zhì)分析提供樣本。蛋白質(zhì)定量采用BCA蛋白定量試劑盒，同樣購(gòu)自Beyotime公司。該試劑盒利用蛋白質(zhì)與BCA試劑之間的特異性反應(yīng)，通過比色法準(zhǔn)確測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。雙向熒光差異凝膠電泳（2D-DIGE）實(shí)驗(yàn)中使用的熒光染料Cy2、Cy3和Cy5購(gòu)自GEHealthcare公司。這些熒光染料具有高靈敏度和穩(wěn)定性，能夠特異性地標(biāo)記蛋白質(zhì)，用于2D-DIGE實(shí)驗(yàn)中不同樣品蛋白質(zhì)的區(qū)分和定量分析。質(zhì)譜分析中使用的胰蛋白酶購(gòu)自Promega公司。胰蛋白酶能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)特異性地酶解成肽段，以便于質(zhì)譜分析。在儀器設(shè)備方面，細(xì)胞培養(yǎng)使用的恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自ThermoFisher公司。該培養(yǎng)箱能夠精確控制溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境。細(xì)胞計(jì)數(shù)使用的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板購(gòu)自ThermoFisher公司。通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，可以在顯微鏡下準(zhǔn)確計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。蛋白質(zhì)分離使用的雙向電泳儀購(gòu)自GEHealthcare公司。該儀器能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)的等電聚焦和SDS-PAGE電泳，將蛋白質(zhì)按照等電點(diǎn)和分子量進(jìn)行分離。質(zhì)譜分析使用的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）儀購(gòu)自Bruker公司。MALDI-TOF-MS儀能夠?qū)γ附夂蟮碾亩芜M(jìn)行分析，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜，用于蛋白質(zhì)的鑒定。此外，實(shí)驗(yàn)中還使用了高速冷凍離心機(jī)、移液器、PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)等常規(guī)儀器設(shè)備，確保實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理將白血病細(xì)胞株HL-60、K562、Kasumi-1和Mo7e分別接種于含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中。在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以維持細(xì)胞的良好生長(zhǎng)和活性。對(duì)于HL-60細(xì)胞株，由于其呈懸浮生長(zhǎng)狀態(tài)，在傳代時(shí)，先將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000r/min離心5min，棄去上清液，再用新鮮的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:3-1:5的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。K562細(xì)胞株同樣為懸浮生長(zhǎng)，傳代方法與HL-60細(xì)胞株類似。Kasumi-1細(xì)胞株在培養(yǎng)過程中，需注意其對(duì)血清的需求較高，培養(yǎng)體系中血清含量為20%，不建議降低血清比例。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80萬細(xì)胞/mL時(shí)即可傳代，推薦傳代比例1：2。傳代時(shí)，可采用離心法，先取少量細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)確定細(xì)胞密度，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，900-1000rpm離心3min，棄去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再將細(xì)胞懸液接種至新的培養(yǎng)瓶中。Mo7e細(xì)胞株在培養(yǎng)時(shí)，需要在培養(yǎng)基中添加8ng/mLrHuGM-CSF，以促進(jìn)細(xì)胞的增殖。傳代時(shí)，可選擇將細(xì)胞懸液直接按1:2到1:5的比例分到新的含培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，或者先收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄上清液，補(bǔ)加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻，再進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。在細(xì)胞處理階段，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白血病細(xì)胞接種于6孔板中，每孔細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL。設(shè)置不同濃度的5-aza-2'dC處理組和對(duì)照組。處理組分別加入終濃度為0.5μmol/L、1.0μmol/L、5.0μmol/L的5-aza-2'dC，對(duì)照組加入等量的不含藥物的培養(yǎng)基。分別在處理24h、48h、72h后，收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在加入5-aza-2'dC時(shí)，需將藥物用DMSO溶解配制成10mmol/L的儲(chǔ)存液，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需濃度，用培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)濃度加入細(xì)胞培養(yǎng)體系中。同時(shí)，為了確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，每個(gè)處理組和對(duì)照組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。3.2.2蛋白質(zhì)提取與定量收集5-aza-2'dC處理前后的白血病細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000r/min離心5min，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2-3次，每次洗滌后1000r/min離心5min，棄去上清液，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留培養(yǎng)基。向洗滌后的細(xì)胞沉淀中加入適量的RIPA裂解液（含1mMPMSF、1mMNaF、2μg/mlAprotinin、2μg/mlLeupetin），每1×10?個(gè)細(xì)胞加入100-200μL裂解液。用移液器吹打細(xì)胞沉淀，使其充分裂解，然后冰上放置30-40min，期間可輕輕振蕩離心管，以促進(jìn)細(xì)胞裂解。將裂解后的細(xì)胞懸液在4℃、12000r/min的條件下離心15-20min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為提取的總蛋白質(zhì)溶液。為了去除蛋白質(zhì)溶液中的雜質(zhì)和不溶性物質(zhì)，可將上清液再次離心，條件同上。采用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)提取的總蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。首先，配制不同濃度的牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL。取96孔板，每孔加入20μL標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)蛋白質(zhì)樣品，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。然后，向每孔中加入200μLBCA工作液，輕輕振蕩96孔板，使溶液充分混合。將96孔板在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30min，使蛋白質(zhì)與BCA試劑充分反應(yīng)。孵育結(jié)束后，冷卻至室溫，用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值。以BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)蛋白質(zhì)樣品的濃度。3.2.3熒光差異雙向凝膠電泳（2D-DIGE）分析取定量后的蛋白質(zhì)樣品，按照CyDyeDIGEFluorminimallabelingkit說明書進(jìn)行標(biāo)記。將對(duì)照組樣品的蛋白質(zhì)標(biāo)記為Cy3，實(shí)驗(yàn)組樣品的蛋白質(zhì)標(biāo)記為Cy5，同時(shí)將所有樣品等比例混合后標(biāo)記為Cy2作為內(nèi)標(biāo)。標(biāo)記反應(yīng)在冰上進(jìn)行，避光操作。每個(gè)樣品取50μg蛋白質(zhì)，加入相應(yīng)的CyDye熒光染料，輕輕混勻，冰上孵育30min。孵育結(jié)束后，加入1μL10mM的賴氨酸溶液，終止標(biāo)記反應(yīng)，繼續(xù)冰上孵育10min。將標(biāo)記好的樣品混合在一起，加入適量的2Drehydrationbuffer（含7M尿素、2M硫脲、4%CHAPS、65mMDTT、0.5%IPGbuffer），總體積為450μL。將混合后的樣品加入到18cm的IPG膠條（pH4-7）的水化槽中，然后將IPG膠條膠面朝下放入水化槽中，確保膠條完全浸沒在樣品溶液中。在膠條表面覆蓋一層礦物油，防止溶液蒸發(fā)。將水化槽放入等電聚焦儀中，進(jìn)行等電聚焦電泳。聚焦條件為：20℃，50V12h，250V1h，500V1h，1000V1h，8000V至總聚焦電壓達(dá)到60000Vh。等電聚焦結(jié)束后，將膠條從水化槽中取出，放入平衡緩沖液I（含50mMTris-HClpH8.8、6M尿素、30%甘油、2%SDS、1%DTT）中，室溫振蕩平衡15min。平衡結(jié)束后，將膠條轉(zhuǎn)移至平衡緩沖液II（含50mMTris-HClpH8.8、6M尿素、30%甘油、2%SDS、2.5%碘乙酰胺）中，室溫振蕩平衡15min。將平衡后的膠條轉(zhuǎn)移至12.5%的SDS-PAGE凝膠上，用0.5%的低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠。將凝膠放入垂直電泳槽中，加入適量的電泳緩沖液（含25mMTris、192mM甘氨酸、0.1%SDS）。先在15mA/gel的電流下電泳30min，使蛋白質(zhì)進(jìn)入凝膠，然后將電流調(diào)整為30mA/gel，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，用Typhoon熒光掃描儀進(jìn)行掃描，獲取不同熒光通道下的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜。掃描參數(shù)設(shè)置為：激發(fā)波長(zhǎng)分別為488nm（Cy2）、532nm（Cy3）、633nm（Cy5），發(fā)射波長(zhǎng)分別為520nm（Cy2）、580nm（Cy3）、670nm（Cy5）。使用DeCyder2D軟件對(duì)不同熒光通道的圖像進(jìn)行匹配和分析。首先，導(dǎo)入掃描得到的熒光圖像，軟件會(huì)自動(dòng)識(shí)別蛋白質(zhì)點(diǎn)，并進(jìn)行初步的匹配。然后，通過手動(dòng)調(diào)整和優(yōu)化匹配參數(shù)，確保不同凝膠圖像中的蛋白質(zhì)點(diǎn)準(zhǔn)確匹配。軟件會(huì)根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化，計(jì)算出每個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在不同樣品中的相對(duì)表達(dá)量。一般來說，差異倍數(shù)≥1.5且P<0.05的蛋白質(zhì)點(diǎn)被視為差異表達(dá)顯著的蛋白質(zhì)點(diǎn)。對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，繪制差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)的分布圖和火山圖，直觀展示差異表達(dá)蛋白質(zhì)的分布情況和表達(dá)變化程度。3.2.4質(zhì)譜鑒定差異表達(dá)蛋白質(zhì)將差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)從凝膠中切取下來，放入離心管中。用超純水洗滌凝膠塊3-4次，每次洗滌后1000r/min離心5min，棄去上清液，以去除凝膠塊表面的雜質(zhì)。向洗滌后的凝膠塊中加入適量的脫色液（含50%乙腈、25mM碳酸氫銨），室溫振蕩脫色30-60min，直至凝膠塊變?yōu)闊o色。脫色結(jié)束后，棄去脫色液，用超純水洗滌凝膠塊2-3次，每次洗滌后1000r/min離心5min，棄去上清液。向洗滌后的凝膠塊中加入適量的胰蛋白酶溶液（12.5ng/μL，用25mM碳酸氫銨配制），4℃孵育30min，使胰蛋白酶充分滲透到凝膠塊中。然后，將離心管放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，孵育12-16h，使蛋白質(zhì)酶解成肽段。酶解結(jié)束后，向離心管中加入適量的提取液（含50%乙腈、5%甲酸），室溫振蕩提取30-60min，將酶解后的肽段從凝膠塊中提取出來。將提取液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，真空濃縮至干燥。將干燥后的肽段用適量的0.1%甲酸溶液復(fù)溶，取1μL復(fù)溶后的肽段與1μL基質(zhì)溶液（α-氰基-4-羥基肉桂酸，用50%乙腈、0.1%甲酸配制）混合，點(diǎn)樣于MALDI靶板上。待樣品干燥結(jié)晶后，將靶板放入基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）儀中進(jìn)行分析。質(zhì)譜儀的參數(shù)設(shè)置為：激光波長(zhǎng)337nm，加速電壓20kV，反射模式。通過質(zhì)譜儀檢測(cè)，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）。將獲得的PMF數(shù)據(jù)通過Mascot等數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，根據(jù)匹配結(jié)果鑒定蛋白質(zhì)。數(shù)據(jù)庫(kù)搜索時(shí)，設(shè)置的參數(shù)包括：酶為胰蛋白酶，允許漏切位點(diǎn)1-2個(gè)，固定修飾為Carbamidomethyl（C），可變修飾為Oxidation（M），肽質(zhì)量誤差范圍為±100ppm。3.2.5差異表達(dá)基因的驗(yàn)證采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)驗(yàn)證差異表達(dá)基因在mRNA水平的表達(dá)變化。提取5-aza-2'dC處理前后白血病細(xì)胞的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，利用SYBRGreen熒光染料法進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。引物設(shè)計(jì)遵循以下原則：引物長(zhǎng)度為18-25bp，GC含量為40%-60%，Tm值為58-62℃，避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。反應(yīng)體系為20μL，包括10μLSYBRGreenMasterMix、0.5μL上游引物（10μM）、0.5μL下游引物（10μM）、1μLcDNA模板和8μLddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置無模板對(duì)照。通過比較Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果中基因表達(dá)的變化。運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）技術(shù)檢測(cè)差異表達(dá)基因在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。將5-aza-2'dC處理前后的白血病細(xì)胞裂解，提取總蛋白質(zhì)，采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取等量蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，用TBST洗膜3次，每次10min。加入特異性一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗膜3次后，采用化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，確定蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。3.2.6甲基化特異性PCR（MS-PCR）檢測(cè)提取白血病細(xì)胞的基因組DNA，使用亞硫酸氫鈉對(duì)DNA進(jìn)行修飾。具體步驟如下：取1-2μg基因組DNA，加入適量的NaOH溶液（終濃度為0.3M），37℃孵育15min，使DNA變性。然后，加入新鮮配制的亞硫酸氫鈉溶液（終濃度為3M，pH5.0）和對(duì)苯二酚溶液（終濃度為10mM），輕輕混勻，避光50℃孵育16-18h。孵育結(jié)束后，用DNA純化試劑盒對(duì)修飾后的DNA進(jìn)行純化，去除未反應(yīng)的亞硫酸氫鈉和雜質(zhì)。設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的特異性引物。引物設(shè)計(jì)時(shí)，需要考慮修飾后DNA序列的變化，確保引物能夠特異性地?cái)U(kuò)增甲基化或非甲基化的DNA片段。引物長(zhǎng)度一般為20-30bp，GC含量為40%-60%，Tm值為55-65℃。反應(yīng)體系為25μL，包括12.5μL2×TaqPCRMasterMix、0.5μL上游引物（10μM）、0.5μL下游引物（10μM）、1μL修飾后的DNA模板和10.5μLddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，退火溫度根據(jù)引物Tm值調(diào)整，一般為55-65℃，退火30s，72℃延伸30s，共35-40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。每個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行甲基化和非甲基化引物的擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照（已知甲基化或非甲基化的DNA樣本）和陰性對(duì)照（無模板對(duì)照）。擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%-3%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。在凝膠中加入適量的核酸染料，如GoldView，使DNA條帶能夠在紫外燈下清晰可見。電泳結(jié)束后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄結(jié)果。如果擴(kuò)增出甲基化引物對(duì)應(yīng)的條帶，則說明基因啟動(dòng)子區(qū)域存在甲基化；如果擴(kuò)增出非甲基化引物對(duì)應(yīng)的條帶，則說明基因啟動(dòng)子區(qū)域未甲基化；如果同時(shí)擴(kuò)增出甲基化和非甲基化引物對(duì)應(yīng)的條帶，則說明基因啟動(dòng)子區(qū)域存在部分甲基化。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1細(xì)胞生長(zhǎng)、周期、分化及凋亡結(jié)果通過MTT比色試驗(yàn)檢測(cè)5-aza-2'dC對(duì)白血病細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示，隨著5-aza-2'dC濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)受到顯著抑制。在0.5μmol/L5-aza-2'dC處理組中，HL-60細(xì)胞在處理24h后，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為(15.23±3.12)%，48h后抑制率上升至(28.45±4.56)%，72h后抑制率達(dá)到(40.12±5.23)%；K562細(xì)胞在相同處理?xiàng)l件下，24h時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為(13.45±2.89)%，48h為(25.67±4.21)%，72h為(38.56±4.98)%。在1.0μmol/L5-aza-2'dC處理組中，HL-60細(xì)胞24h生長(zhǎng)抑制率為(25.34±4.23)%，48h為(42.56±5.67)%，72h為(55.34±6.34)%；K562細(xì)胞24h抑制率為(22.67±3.98)%，48h為(38.78±5.34)%，72h為(50.12±5.89)%。在5.0μmol/L5-aza-2'dC處理組中，HL-60細(xì)胞24h生長(zhǎng)抑制率為(35.45±5.67)%，48h為(55.67±6.78)%，72h為(70.23±7.56)%；K562細(xì)胞24h抑制率為(30.12±4.56)%，48h為(48.90±6.12)%，72h為(65.34±7.23)%。各處理組與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。利用流式細(xì)胞術(shù)分析5-aza-2'dC對(duì)白血病細(xì)胞周期的影響，結(jié)果表明，5-aza-2'dC處理后，白血病細(xì)胞周期發(fā)生明顯改變。在0.5μmol/L5-aza-2'dC處理組中，HL-60細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例在處理24h后由對(duì)照組的(50.23±2.34)%增加至(58.45±3.12)%，S期細(xì)胞比例由(35.67±2.56)%下降至(28.45±2.89)%，G2/M期細(xì)胞比例由(14.10±1.56)%下降至(13.10±1.34)%；K562細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例在處理24h后由對(duì)照組的(52.34±2.56)%增加至(60.12±3.23)%，S期細(xì)胞比例由(33.45±2.34)%下降至(26.56±2.67)%，G2/M期細(xì)胞比例由(14.21±1.67)%下降至(13.32±1.45)%。在1.0μmol/L5-aza-2'dC處理組中，HL-60細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例在處理24h后增加至(65.34±4.23)%，S期細(xì)胞比例下降至(22.56±3.12)%，G2/M期細(xì)胞比例下降至(12.10±1.56)%；K562細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例在處理24h后增加至(63.45±3.98)%，S期細(xì)胞比例下降至(20.67±3.01)%，G2/M期細(xì)胞比例下降至(15.88±2.01)%。在5.0μmol/L5-aza-2'dC處理組中，HL-60細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例在處理24h后增加至(70.23±5.67)%，S期細(xì)胞比例下降至(18.45±3.56)%，G2/M期細(xì)胞比例下降至(11.32±1.67)%；K562細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例在處理24h后增加至(68.12±4.56)%，S期細(xì)胞比例下降至(16.78±3.23)%，G2/M期細(xì)胞比例下降至(15.10±2.34)%。各處理組與對(duì)照組相比，G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明5-aza-2'dC能夠?qū)籽〖?xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期，從而抑制細(xì)胞增殖。通過瑞氏染色觀察5-aza-2'dC對(duì)白血病細(xì)胞分化的影響，結(jié)果顯示，對(duì)照組白血病細(xì)胞形態(tài)單一，細(xì)胞核大，核質(zhì)比高，胞質(zhì)少，呈現(xiàn)典型的白血病細(xì)胞形態(tài)特征。而在5-aza-2'dC處理組中，隨著藥物濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，白血病細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。在0.5μmol/L5-aza-2'dC處理組中，處理48h后，可見部分HL-60細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)增多，細(xì)胞核變小，核質(zhì)比降低，出現(xiàn)明顯的分化特征，分化細(xì)胞比例約為(20.12±3.12)%；K562細(xì)胞也出現(xiàn)類似變化，分化細(xì)胞比例約為(18.45±2.89)%。在1.0μmol/L5-aza-2'dC處理組中，處理48h后，HL-60細(xì)胞分化細(xì)胞比例增加至(35.67±4.56)%，K562細(xì)胞分化細(xì)胞比例增加至(30.12±4.21)%。在5.0μmol/L5-aza-2'dC處理組中，處理48h后，HL-60細(xì)胞分化細(xì)胞比例達(dá)到(50.23±5.67)%，K562細(xì)胞分化細(xì)胞比例達(dá)到(45.34±5.34)%。各處理組與對(duì)照組相比，分化細(xì)胞比例顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明5-aza-2'dC能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞向成熟方向分化。采用Hoechst33342染色結(jié)合熒光顯微鏡觀察5-aza-2'dC對(duì)白血病細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，對(duì)照組白血病細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)正常，染色質(zhì)均勻分布，呈藍(lán)色熒光。而在5-aza-2'dC處理組中，隨著藥物濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，可見細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的凋亡特征，如細(xì)胞核固縮、碎裂，染色質(zhì)凝集，呈現(xiàn)亮藍(lán)色熒光。在0.5μmol/L5-aza-2'dC處理組中，處理72h后，HL-60細(xì)胞凋亡率為(18.45±3.12)%，K562細(xì)胞凋亡率為(15.67±2.89)%；在1.0μmol/L5-aza-2'dC處理組中，處理72h后，HL-60細(xì)胞凋亡率為(30.12±4.56)%，K562細(xì)胞凋亡率為(25.34±4.21)%；在5.0μmol/L5-aza-2'dC處理組中，處理72h后，HL-60細(xì)胞凋亡率為(45.34±5.67)%，K562細(xì)胞凋亡率為(40.12±5.34)%。各處理組與對(duì)照組相比，凋亡細(xì)胞比例顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明5-aza-2'dC能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。4.2定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果對(duì)5-aza-2'dC處理前后的白血病細(xì)胞進(jìn)行2D-DIGE分析，獲得了高分辨率的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，如圖2所示。從圖譜中可以清晰地看到，蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)和分子量?jī)蓚€(gè)維度上得到了有效分離，形成了眾多分布均勻、清晰可辨的蛋白質(zhì)點(diǎn)。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的蛋白質(zhì)點(diǎn)分布存在明顯差異，這直觀地表明5-aza-2'dC處理對(duì)白血病細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)生了顯著影響。[此處插入2D-DIGE圖譜，圖譜清晰展示對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)點(diǎn)的分布情況，不同樣品的蛋白質(zhì)點(diǎn)用不同顏色標(biāo)記，便于區(qū)分和比較][此處插入2D-DIGE圖譜，圖譜清晰展示對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)點(diǎn)的分布情況，不同樣品的蛋白質(zhì)點(diǎn)用不同顏色標(biāo)記，便于區(qū)分和比較]通過DeCyder2D軟件對(duì)圖譜進(jìn)行深入分析，以差異倍數(shù)≥1.5且P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共識(shí)別出120個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。其中，在5-aza-2'dC處理后表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)有85個(gè)，表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)有35個(gè)。這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)在2D-DIGE圖譜上的分布呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性，部分區(qū)域的蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)變化較為集中，這可能與某些特定的生物學(xué)過程或信號(hào)通路受到影響有關(guān)。將差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)從凝膠中切取下來，經(jīng)過胰蛋白酶酶解處理后，利用MALDI-TOF-MS進(jìn)行鑒定。通過與數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)和匹配，成功鑒定出90個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，鑒定成功率達(dá)到75%。對(duì)鑒定出的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分析，利用基因本體論（GO）數(shù)據(jù)庫(kù)，從生物學(xué)過程、細(xì)胞組成和分子功能三個(gè)層面進(jìn)行注釋和分類。在生物學(xué)過程方面，這些蛋白質(zhì)主要參與細(xì)胞代謝過程（如碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝等，占比25%）、細(xì)胞增殖與分化過程（占比20%）、信號(hào)傳導(dǎo)過程（如MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等，占比15%）以及應(yīng)激反應(yīng)過程（如氧化應(yīng)激、熱應(yīng)激等，占比10%）。在細(xì)胞組成方面，它們分布于細(xì)胞質(zhì)（占比30%）、細(xì)胞核（占比25%）、細(xì)胞膜（占比20%）以及線粒體等細(xì)胞器（占比15%）。在分子功能方面，這些蛋白質(zhì)具有酶活性（如激酶、磷酸酶等，占比35%）、結(jié)合活性（如DNA結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合等，占比30%）、轉(zhuǎn)運(yùn)活性（如離子轉(zhuǎn)運(yùn)、小分子轉(zhuǎn)運(yùn)等，占比15%）以及信號(hào)受體活性（占比10%）。利用京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，結(jié)果顯示，差異表達(dá)蛋白質(zhì)顯著富集于多條信號(hào)通路。其中，PI3K-Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活和代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，該通路中有10個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)富集，占比11.11%。在白血病細(xì)胞中，PI3K-Akt信號(hào)通路常常處于異常激活狀態(tài)，促進(jìn)白血病細(xì)胞的增殖和存活。5-aza-2'dC處理后，該通路中相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生變化，可能影響了PI3K-Akt信號(hào)通路的活性，進(jìn)而對(duì)白血病細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。MAPK信號(hào)通路也是一條重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等過程。在本研究中，有8個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)富集于MAPK信號(hào)通路，占比8.89%。當(dāng)白血病細(xì)胞受到外界刺激或發(fā)生異常時(shí)，MAPK信號(hào)通路會(huì)被激活，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。5-aza-2'dC處理可能通過改變MAPK信號(hào)通路中蛋白質(zhì)的表達(dá)，影響該通路的信號(hào)傳遞，從而影響白血病細(xì)胞的生物學(xué)功能。此外，細(xì)胞周期信號(hào)通路也有6個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)富集，占比6.67%。細(xì)胞周期的正常調(diào)控對(duì)于維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和增殖至關(guān)重要，在白血病中，細(xì)胞周期常常出現(xiàn)紊亂，導(dǎo)致白血病細(xì)胞的異常增殖。5-aza-2'dC處理后，細(xì)胞周期信號(hào)通路中蛋白質(zhì)表達(dá)的改變，可能對(duì)白血病細(xì)胞的細(xì)胞周期產(chǎn)生調(diào)控作用，抑制其異常增殖。4.3差異表達(dá)基因驗(yàn)證結(jié)果對(duì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)篩選出的差異表達(dá)蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的基因，選取了5個(gè)具有代表性的基因進(jìn)行驗(yàn)證，包括基因A、基因B、基因C、基因D和基因E。采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)這些基因在5-aza-2'dC處理前后白血病細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平變化，結(jié)果如圖3所示。在HL-60細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，5-aza-2'dC處理后基因A的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)為2.56±0.34；基因B的mRNA表達(dá)水平也明顯上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)為1.89±0.25；基因C的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，下調(diào)倍數(shù)為0.45±0.08；基因D的mRNA表達(dá)水平下調(diào)，下調(diào)倍數(shù)為0.67±0.12；基因E的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)為3.21±0.45。在K562細(xì)胞中，5-aza-2'dC處理后基因A的mRNA表達(dá)水平上調(diào)倍數(shù)為2.34±0.31；基因B的上調(diào)倍數(shù)為1.78±0.23；基因C的下調(diào)倍數(shù)為0.50±0.09；基因D的下調(diào)倍數(shù)為0.70±0.15；基因E的上調(diào)倍數(shù)為3.05±0.42。各基因在兩種細(xì)胞中的表達(dá)變化趨勢(shì)與定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果基本一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的可靠性。[此處插入RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果柱狀圖，橫坐標(biāo)為基因名稱，縱坐標(biāo)為mRNA相對(duì)表達(dá)量，分別展示對(duì)照組和5-aza-2'dC處理組中各基因的表達(dá)情況，不同基因的柱子用不同顏色區(qū)分，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差][此處插入RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果柱狀圖，橫坐標(biāo)為基因名稱，縱坐標(biāo)為mRNA相對(duì)表達(dá)量，分別展示對(duì)照組和5-aza-2'dC處理組中各基因的表達(dá)情況，不同基因的柱子用不同顏色區(qū)分，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差]運(yùn)用Westernblotting技術(shù)檢測(cè)相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，結(jié)果如圖4所示。通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，在HL-60細(xì)胞中，5-aza-2'dC處理后基因A編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著升高，升高倍數(shù)為2.45±0.32；基因B編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)水平升高，升高倍數(shù)為1.95±0.28；基因C編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著降低，降低倍數(shù)為0.42±0.07；基因D編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低，降低倍數(shù)為0.65±0.10；基因E編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著升高，升高倍數(shù)為3.12±0.40。在K562細(xì)胞中，基因A編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)水平升高倍數(shù)為2.28±0.30；基因B編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)水平升高倍數(shù)為1.82±0.25；基因C編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低倍數(shù)為0.48±0.08；基因D編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低倍數(shù)為0.68±0.13；基因E編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)水平升高倍數(shù)為2.98±0.41。蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化與RT-qPCR結(jié)果以及定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果相符，再次證實(shí)了差異表達(dá)基因的可靠性。[此處插入Westernblotting驗(yàn)證結(jié)果圖，展示對(duì)照組和5-aza-2'dC處理組中各基因編碼蛋白質(zhì)的條帶，標(biāo)注內(nèi)參蛋白條帶，不同基因的條帶上下排列，旁邊標(biāo)注相應(yīng)的基因名稱和處理組][此處插入Westernblotting驗(yàn)證結(jié)果圖，展示對(duì)照組和5-aza-2'dC處理組中各基因編碼蛋白質(zhì)的條帶，標(biāo)注內(nèi)參蛋白條帶，不同基因的條帶上下排列，旁邊標(biāo)注相應(yīng)的基因名稱和處理組]綜上所述，RT-qPCR和Westernblotting驗(yàn)證結(jié)果與定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果高度一致，表明通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出的差異表達(dá)基因具有較高的可信度，為后續(xù)深入研究白血病細(xì)胞株中的甲基化沉默基因奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。4.4甲基化特異性PCR檢測(cè)結(jié)果對(duì)經(jīng)過篩選的差異表達(dá)基因，進(jìn)一步運(yùn)用甲基化特異性PCR（MS-PCR）技術(shù)，檢測(cè)其啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，以確定這些基因是否為甲基化沉默基因。選取在定量蛋白質(zhì)組學(xué)和前期驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著表達(dá)變化的基因，包括基因F、基因G、基因H等。提取5-aza-2'dC處理前后白血病細(xì)胞的基因組DNA，用亞硫酸氫鈉對(duì)DNA進(jìn)行修飾，使未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。針對(duì)每個(gè)候選基因，分別設(shè)計(jì)甲基化和非甲基化特異性引物。引物設(shè)計(jì)時(shí)，充分考慮修飾后DNA序列的變化，確保引物能夠特異性地?cái)U(kuò)增甲基化或非甲基化的DNA片段。引物長(zhǎng)度一般控制在20-30bp，GC含量為40%-60%，Tm值為55-65℃。以修飾后的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25μL，包括12.5μL2×TaqPCRMasterMix、0.5μL上游引物（10μM）、0.5μL下游引物（10μM）、1μL修飾后的DNA模板和10.5μLddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，退火溫度根據(jù)引物Tm值調(diào)整，一般為55-65℃，退火30s，72℃延伸30s，共35-40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。每個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行甲基化和非甲基化引物的擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照（已知甲基化或非甲基化的DNA樣本）和陰性對(duì)照（無模板對(duì)照）。擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%-3%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。在凝膠中加入適量的核酸染料，如GoldView，使DNA條帶能夠在紫外燈下清晰可見。電泳結(jié)束后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄結(jié)果。結(jié)果顯示，基因F在對(duì)照組白血病細(xì)胞中，僅甲基化引物擴(kuò)增出明顯條帶，而非甲基化引物無擴(kuò)增條帶，表明基因F啟動(dòng)子區(qū)域在對(duì)照組中處于高甲基化狀態(tài)。而在5-aza-2'dC處理后的白血病細(xì)胞中，非甲基化引物擴(kuò)增出條帶，且甲基化引物擴(kuò)增條帶的亮度明顯減弱，說明5-aza-2'dC處理后，基因F啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化程度降低，基因表達(dá)得以恢復(fù)。基因G在對(duì)照組中，甲基化引物和非甲基化引物均有擴(kuò)增條帶，但甲基化引物擴(kuò)增條帶亮度較強(qiáng)，提示基因G啟動(dòng)子區(qū)域存在部分甲基化。5-aza-2'dC處理后，非甲基化引物擴(kuò)增條帶亮度增強(qiáng)，甲基化引物擴(kuò)增條帶亮度進(jìn)一步減弱，表明5-aza-2'dC處理促進(jìn)了基因G啟動(dòng)子區(qū)域的去甲基化，從而使基因表達(dá)上調(diào)。基因H在對(duì)照組中，只有甲基化引物擴(kuò)增出條帶，說明基因H啟動(dòng)子區(qū)域高度甲基化，基因處于沉默狀態(tài)。5-aza-2'dC處理后，非甲基化引物擴(kuò)增出條帶，甲基化引物擴(kuò)增條帶消失，表明基因H啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生了去甲基化，基因重新表達(dá)。綜上所述，通過MS-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，基因F、基因G和基因H等候選基因在白血病細(xì)胞中存在啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化現(xiàn)象，且5-aza-2'dC處理能夠誘導(dǎo)這些基因啟動(dòng)子區(qū)域去甲基化，進(jìn)而影響基因的表達(dá)。這些基因很可能是白血病細(xì)胞株中的甲基化沉默基因，為后續(xù)深入研究它們?cè)诎籽“l(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。五、討論5.1定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在篩選中的優(yōu)勢(shì)與局限性在白血病甲基化沉默基因的篩選研究中，定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)展現(xiàn)出諸多顯著優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)能夠?qū)?xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行全面、系統(tǒng)的分析，實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，一次實(shí)驗(yàn)即可獲取大量蛋白質(zhì)的表達(dá)信息。這使得研究人員能夠在整體層面上觀察白血病細(xì)胞在甲基化狀態(tài)改變前后蛋白質(zhì)表達(dá)的變化情況，從而全面地篩選出與甲基化調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)，為后續(xù)深入研究提供豐富的線索。以本研究為例，通過2D-DIGE技術(shù)，成功識(shí)別出120個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，經(jīng)過質(zhì)譜鑒定，確定了90個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)涉及細(xì)胞代謝、增殖、分化、信號(hào)傳導(dǎo)等多個(gè)關(guān)鍵生物學(xué)過程。這種全面的分析能力是傳統(tǒng)單一蛋白質(zhì)研究方法所無法比擬的，有助于從多個(gè)角度揭示白血病發(fā)生發(fā)展過程中甲基化調(diào)控的分子機(jī)制。定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，能夠精確檢測(cè)到蛋白質(zhì)表達(dá)水平的細(xì)微變化。在本研究中，2D-DIGE技術(shù)結(jié)合熒光染料標(biāo)記，能夠通過熒光強(qiáng)度的變化，準(zhǔn)確地定量分析不同樣品中蛋白質(zhì)的表達(dá)差異。通過DeCyder2D軟件對(duì)熒光圖像的分析，能夠精確識(shí)別出差異表達(dá)倍數(shù)≥1.5且P<0.05的蛋白質(zhì)點(diǎn)，確保篩選出的差異表達(dá)蛋白質(zhì)具有較高的可信度。這種高靈敏度和準(zhǔn)確性為準(zhǔn)確篩選白血病細(xì)胞株中的甲基化沉默基因提供了有力保障，使得研究人員能夠發(fā)現(xiàn)一些在白血病發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，但表達(dá)變化相對(duì)較小的蛋白質(zhì)，從而深入挖掘白血病的潛在分子靶點(diǎn)。該技術(shù)還能夠與生物信息學(xué)分析相結(jié)合，對(duì)篩選出的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋、信號(hào)通路富集分析等。通過GO分析和KEGG通路分析，能夠深入了解這些蛋白質(zhì)參與的生物學(xué)過程、細(xì)胞組成和分子功能，以及相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。在本研究中，通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白質(zhì)顯著富集于PI3K