選修3教材解讀第一章基因工程【教材解讀】1.工具酶的發(fā)現(xiàn)和基因工程的誕生①基因工程的概念：是指狹義的遺傳工程；廣義的遺傳工程泛指把一種生物的遺傳物質(zhì)（細胞核、染色體脫氧核糖核酸等）移到另一種生物的細胞中去，并使這種遺傳物質(zhì)所帶的遺傳信息在受體細胞中表達。②基因工程的核心是構(gòu)建重組DNA分子，其變異原理是基因重組。③限制性核酸內(nèi)切酶：主要是從細菌中分離純化出來的；【拓展：限制酶對細菌有保護作用，某些入侵的噬菌體可因DNA鏈被限制酶切斷而不能在細菌中繁殖，“限制”由此而得名，限制酶不能切開細菌自身的DNA，這是因為細菌DNA的腺嘌呤和胞嘧啶甲基化而受到保護的緣故】是能夠識別和切割DNA分子內(nèi)一小段特殊核苷酸序列的酶，因此具有專一性?！窘馕觯鹤R別特定的核苷酸序列和切點；切割切點處兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵】④如：以下四種限制性核酸內(nèi)切酶能識別的序列分別是GGATCC、GAATTC、AAGCTT、AGATCT，識別的切點（又稱切割位點）G和G之間、G和A之前、A和A之間、A和G之間，能在切點上兩個核苷酸之間切斷DNA，如下圖所示。⑤如果利用不同的限制性核酸內(nèi)切酶處理DNA分子，就能把DNA分子切割成許多不同的片段，限制酶的切割方式分為兩種方式：如：EcoRⅠ切割位置是交錯的，可以形成兩個粘性末端（虛線框內(nèi)的結(jié)構(gòu)），為與其他核苷酸序列互補連接奠定基礎(chǔ)；而SmaⅠ切割位置是平齊的，形成的是平末端?！咀⒁猓翰煌南拗泼缸R別不同的序列，但有時形成的粘性末端可以發(fā)生互補；如下圖：a酶識別的序列是GACGTC，切點是G和A之間；而b酶識別的序列ACGT，切點A的另一側(cè)堿基不固定；兩種限制酶形成的粘性末端的堿基可以互補】⑥D(zhuǎn)NA連接酶：將具有末端堿基互補的2個DNA片段連接在一起（形成磷酸二酯鍵），所形成的DNA分子稱為重組DNA分子。因此，DNA連接酶可以將外源基因和載體DNA連接在一起，如下圖。【注意：DNA連接酶能夠封閉DNA雙螺旋骨架上的切口而不能封閉缺口，如下圖所示】⑦載體：質(zhì)粒常作為基因的載體使用，質(zhì)粒是能夠自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，在細菌中以獨立于擬核之外的方式存在，最常用的是大腸桿菌的質(zhì)粒，這種質(zhì)粒常含有抗生素抗性基因，例如：四環(huán)素的抗性基因。其他載體有λ噬菌體、動物病毒和植物病毒。【作為載體具備的條件：①是DNA分子，這樣才能與目的基因結(jié)合到一起；②能夠自我復(fù)制；③能進入受體細胞，并在受體細胞中正常生存；④最好能表達特殊性狀的基因（即為標(biāo)記基因），便于檢測目的基因是否轉(zhuǎn)入受體細胞】2.基因工程的基本原理：是讓人們感興趣的基因（即目的基因）在宿主細胞中穩(wěn)定和高效地表達；為了實現(xiàn)這個目標(biāo)，通常要有多種工具酶、目的基因、載體和宿主細胞等基因要素。3.基因工程的基本操作步驟①獲得目的基因：即獲得我們所需要的基因；獲得目的基因通常有兩種方法：a.目的基因的序列是已知的，可以用化學(xué)方法合成目的基因或用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增目的基因；b.目的基因的核苷酸序列是未知的，我們就建立一個包括目的基因在內(nèi)的基因文庫從基因文庫中找到我們想要的目的基因?！窘庾x：例如某生物具有我們想要的性狀，也就說明該生物體內(nèi)含有控制這個性狀的基因，但又不確定是哪個基因，此時，就把該生物的所有基因收集在一起，建立基因文庫，然后從中篩選出我們想要的基因，即目的基因】②形成重組DNA分子（核心步驟）：通常是用相同的限制性核酸內(nèi)切酶分別切割目的基因和載體DNA（如質(zhì)粒），就會在目的基因和載體DNA的兩端形成相同的黏性末端，然后用DNA連接酶將目的基因和載體DNA連接在一起，形成重組DNA分子。③將重組DNA分子導(dǎo)入受體細胞：用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑿纬傻闹亟MDNA分子轉(zhuǎn)移到合適的受體細胞中。常用的受體細胞有大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌和動植物細胞等。如用質(zhì)粒作載體，宿主細胞應(yīng)選擇大腸桿菌，用氯化鈣處理大腸桿菌，增加大腸桿菌細胞壁的通透性（稱為感受態(tài)細胞），使含有目的基因的重組質(zhì)粒進入大腸桿菌宿主細胞?！就卣梗喝缡荏w細胞是動物細胞，常用顯微注射法導(dǎo)入受體細胞；如受體細胞是植物細胞，常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入受體細胞。如果以病毒為載體，采用病毒侵染動植物細胞的方法】【例：用CaCl2處理細菌，會改變其某些生理狀態(tài)。取CaCl2處理過的農(nóng)桿菌與重組質(zhì)粒在離心管內(nèi)進行混合等操作，使重組質(zhì)粒進入農(nóng)桿菌，完成轉(zhuǎn)化實驗。在離心管中加入液體培養(yǎng)基，置于搖床慢速培養(yǎng)一段時間，其目的是使

CaCl2

處理過的農(nóng)桿菌恢復(fù)細胞的正常狀態(tài)，從而表達卡那霉素抗性基因，并大量增殖】④篩選含有目的基因的受體細胞：并不是所有細胞都接納了重組DNA分子，因此需要篩選含有目的基因的受體細胞。例如，質(zhì)粒上有抗生素如四環(huán)素的抗性基因（用作標(biāo)記基因），所以含有這種重組質(zhì)粒的受體細胞就能夠在有四環(huán)素的培養(yǎng)基中生長，而沒有接納重組質(zhì)粒的細胞在這種培養(yǎng)基中不能生長。這樣就能篩選出含有重組DNA分子的受體細胞。經(jīng)過培養(yǎng)，目的基因能和質(zhì)粒一起在宿主細胞內(nèi)大量擴增。⑤目的基因的表達：目的基因在宿主細胞中表達，能產(chǎn)生人們需要的功能物質(zhì)，如轉(zhuǎn)入了人胰島素原基因的大腸桿菌，可以合成人胰島素原，經(jīng)進一步的加工后可獲得具有生物活性的胰島素?！咀⒁猓捍竽c桿菌細胞內(nèi)不存在高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，不能得到具有生物活性的胰島素】第二章克隆技術(shù)1.克?。壕褪侵笩o性繁殖系；克隆技術(shù)：是指從眾多的基因或細胞群體中通過無性繁殖和選擇獲得目的基因或特定類型細胞的操作技術(shù)。2.胚胎細胞克隆不屬于嚴(yán)格意義上的動物個體克??；3.克隆的基本條件：①具有包含物種完整基因組的細胞核的活細胞；②能有效調(diào)控細胞核發(fā)育的細胞質(zhì)物質(zhì)（如去核卵的細胞質(zhì)）；③完成胚胎發(fā)育的必要的環(huán)境條件。4.植物的克隆①植物克隆技術(shù)基礎(chǔ)是植物組織培養(yǎng)；植物克隆技術(shù)的理論基礎(chǔ)是植物細胞全能性；②植物細胞全能性體現(xiàn)：植物體的每個活細胞，即使是已經(jīng)高度成熟和分化的細胞，都保持了恢復(fù)到分生狀態(tài)的能力，都具有遺傳上的全能性。需要指出的是，由于不同種類植物或同種植物的不同基因型個體之間遺傳性的差異，細胞的全能性的表達程度大不相同?！救苄员容^：受精卵＞早期胚胎細胞＞生殖細胞＞體細胞；植物細胞＞動物細胞】③植物組織培養(yǎng)：植物組織培養(yǎng)就是在無菌和人工控制的條件下，將離體的植物器官、組織、細胞培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)其產(chǎn)生愈傷組織、生芽，最終形成完整的植株?！竟腆w培養(yǎng)基有利于誘導(dǎo)愈傷組織，而液體培養(yǎng)基有利于細胞和胚狀體增殖】④植物組織培養(yǎng)（愈傷組織培養(yǎng)法）過程：a.配制含有適當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)和植物生長調(diào)節(jié)劑的含0.7%—1%瓊脂的培養(yǎng)基，倒在滅菌試管中凝固成半固體；b.從消毒的根、莖或葉上切取一些小組織塊；c.將組織塊放在半固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得愈傷組織（創(chuàng)傷組織）；d.以適當(dāng)配比的營養(yǎng)物質(zhì)和生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)愈傷組織，直到再生出新植株?！罡畹闹仓晗嗨?，在創(chuàng)傷表面形成一種由相對沒有分化的活的薄壁細胞團組成的愈傷組織【該過程稱為脫分化，即已經(jīng)高度分化的植物細胞，經(jīng)過誘導(dǎo)重新恢復(fù)了分裂能力，產(chǎn)生愈傷組織的過程】，通過調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)和生長調(diào)節(jié)劑的適當(dāng)配比，可以從這種愈傷組織誘導(dǎo)出芽和根的頂端分生組織【該過程稱為再分化】，并可由此再生出新的植株。⑤培養(yǎng)基的成分：水、無機鹽、碳源（如蔗糖或甘露醇）、含N物質(zhì)（如氨基酸、維生素）、瓊脂（0.7%—1%，起支持作用）、植物生長調(diào)節(jié)劑（細胞分裂素、生長素）。⑥植物細胞培養(yǎng)（液體懸浮培養(yǎng)法）過程：將含有愈傷組織培養(yǎng)物的試管放在搖床上，通過液體懸浮培養(yǎng)可以分散成單細胞，這種單細胞細胞質(zhì)豐富、液泡小而細胞核大，這是胚性細胞的特征，在適宜的培養(yǎng)基中，這種單細胞可發(fā)育成胚狀體，胚狀體繼續(xù)發(fā)育，可以形成植株?！灸康模菏峭ㄟ^大規(guī)模的細胞培養(yǎng)以獲得人類所需的細胞次級代謝產(chǎn)物】【解析：處于適當(dāng)?shù)囊后w培養(yǎng)條件的單個植物細胞，經(jīng)過培養(yǎng)基中成分的誘導(dǎo)，可發(fā)生類似受精卵經(jīng)過卵裂、分化、器官發(fā)生和形態(tài)建成而發(fā)育成胚的過程，即從單細胞依次到細胞團、球形胚、心形胚和胚狀體，最后再生出完整的植株；有些植物可以在愈傷組織的基礎(chǔ)上直接發(fā)育出花器官】⑦植物原生質(zhì)體的獲得方法：在0.5～0.6mol/L的甘露醇溶液環(huán)境（較高滲透壓）下用纖維素酶和果膠酶混合液處理根尖、葉片、愈傷組織或懸浮培養(yǎng)細胞，將細胞壁消化除去，獲得球形的原生質(zhì)體（細胞中有代謝活性的原生質(zhì)部分，包括質(zhì)膜、細胞質(zhì)和細胞核）。⑧如何實現(xiàn)器官發(fā)生和形態(tài)建成：主要通過平衡的植物激素配比進行調(diào)控；誘導(dǎo)芽的分化：細胞分裂素＞生長素；誘導(dǎo)根的分化：生長素（吲哚乙酸）＞細胞分裂素⑨植物細胞工程：培養(yǎng)植物細胞（包括原生質(zhì)體），借助基因工程方法，將外源遺傳物質(zhì)（DNA）導(dǎo)入受體細胞（包括原生質(zhì)體受體）中，或通過細胞融合、顯微注射等將不同來源的遺傳物質(zhì)重新組合，再通過對這些轉(zhuǎn)基因細胞或重組細胞進行培養(yǎng)，獲得具有特定性狀的新植株?！窘馕觯褐匦陆M合的3種方法：基因工程、細胞融合、顯微注射】⑩長期培養(yǎng)中，培養(yǎng)物的胚胎發(fā)生和器官形成能力下降的可能原因：a.染色體畸變、細胞核變異或非整倍體產(chǎn)生等，而且其結(jié)果是不可逆的；b.細胞或組織中激素平衡被打破，或細胞外源生長物質(zhì)的敏感性發(fā)生改變；c.隨著時間推移，由于其他各種原因產(chǎn)生了缺乏成胚性的細胞系。⑾應(yīng)用：在培養(yǎng)基中加入不同濃度的NaCl或病原體的毒蛋白，誘發(fā)和篩選了抗鹽或抗病突變體；在培養(yǎng)基中加入不同濃度的賴氨酸類似物，能夠篩選出抗賴氨酸類似物的突變體。5.細胞克?、賱游锟寺〉募夹g(shù)基礎(chǔ)是動物細胞和組織培養(yǎng)；②動物細胞培養(yǎng)：將動物體內(nèi)的一部分組織取出，經(jīng)過機械消化或胰酶消化，使其分散成單個細胞；然后，在人工控制的培養(yǎng)條件下，使這些細胞得以生存，并保持生長、分裂（繁殖）乃至接觸抑制和有規(guī)律的衰老、死亡等生命活動?！窘佑|抑制：是將\t"/item/%E6%8E%A5%E8%A7%A6%E6%8A%91%E5%88%B6/_blank"多細胞生物的細胞進行體外培養(yǎng)時，分散貼壁生長的細胞一旦相互匯合接觸，即停止移動和生長的現(xiàn)象。細胞增殖到一定程度，也就是互相挨在一起的時候，\t"/item/%E6%8E%A5%E8%A7%A6%E6%8A%91%E5%88%B6/_blank"糖蛋白識別了這種信息，就會使細胞停止繁殖】【貼壁生長：在細胞培養(yǎng)時貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始\t"/item/%E8%B4%B4%E5%A3%81%E5%9F%B9%E5%85%BB/_blank"有絲分裂，并很快進入\t"/item/%E8%B4%B4%E5%A3%81%E5%9F%B9%E5%85%BB/_blank"對數(shù)生長期，一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細胞單層】③動物組織培養(yǎng)：動物組織在體外及人工條件下維持生活狀態(tài)或生長特性。動物組織培養(yǎng)過程中可以伴隨著分化。④綜合細胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)的含義和規(guī)律，兩者在一定程度上可看作是同義語，因此可將它們統(tǒng)稱為組織培養(yǎng)（組培），用以代表各種生物體結(jié)構(gòu)成分的體外培養(yǎng)。⑤原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)：從機體取出組織或細胞后立即進行培養(yǎng)（即原代培養(yǎng)），當(dāng)細胞從移植物中生長遷移出來，形成生長暈并增大以后，接著進行傳代培養(yǎng)（即將原代培養(yǎng)細胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個培養(yǎng)瓶）。【生長暈：是指組織塊接種進行細胞培養(yǎng)5～6天后，在顯微鏡下觀察，可見到有細胞從組織塊周邊生長，呈放射狀排列】⑥懸浮培養(yǎng)法：取動物組織塊（動物胚胎或幼齡動物的器官或組織）→剪碎→用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個細胞→制成細胞懸液→轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶（卡氏瓶）中進行原代培養(yǎng)→貼滿瓶壁的細胞重新用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個細胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)。⑦細胞系、細胞株a.細胞系：指可連續(xù)傳代的細胞。如果不進行分離培養(yǎng)，到一定時期培養(yǎng)的細胞就會因細胞密度過大和代謝消耗引起營養(yǎng)枯竭，不能正常生長，這就是必須傳代的原因。原代培養(yǎng)物在首次傳代時就成為細胞系，能連續(xù)培養(yǎng)下去的細胞系稱為連續(xù)細胞系，不能連續(xù)培養(yǎng)下去的細胞系稱為有限細胞系。二倍體細胞通常為有限細胞系，連續(xù)細胞系被認(rèn)為是發(fā)生了轉(zhuǎn)化了的細胞系，大多數(shù)具有異倍體核型。有的連續(xù)細胞系是惡性細胞系，具有異體致瘤性；有的連續(xù)細胞系獲得了不死性，但保留接觸抑制現(xiàn)象，不致癌?！井愺w致瘤性解析：惡性腫瘤之所以很難完全清除易復(fù)發(fā)，一個重要原因是腫瘤細胞來源于自身細胞，不能被自身免疫系統(tǒng)識別清除，而異體醫(yī)源性種植（如器官移植）來源于異體細胞，很難不被自身免疫系統(tǒng)識別清除，所以來自異體的腫瘤細胞一般不會導(dǎo)致腫瘤，但有少數(shù)腫瘤細胞移植后可使異體導(dǎo)致腫瘤，即異體致瘤性】?！井惐扼w核型解析：某種生物完整的一套染色體稱為該種生物的一個染色體組；具有不成套染色體組的細胞或個體稱為異倍體，異倍體具有的核型即為異倍體核型，類似非整體變異】b.細胞株：通過一定的選擇或純化方法，從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)的細胞系。細胞株一般具有恒定的染色體組型、同功酶類型、病毒敏感性和生化特性等?？蓚鞔螖?shù)有限的細胞株稱為有限細胞株，可連續(xù)多次傳代的細胞株稱為連續(xù)細胞株。⑧克隆培養(yǎng)法：把一個單細胞從群體中分離出來單獨培養(yǎng)，使之繁衍成一個新的細胞群體的技術(shù)，叫克隆培養(yǎng)法或細胞克隆。未經(jīng)克隆化的細胞系具有異質(zhì)性【遺傳物質(zhì)及性狀的差異】，經(jīng)過克隆以后的細胞的后裔細胞群，來源于一個共同的祖細胞，所以稱為純系（克隆）。細胞克隆的遺傳性狀均一，表現(xiàn)的性狀相似，便于研究。a.細胞克隆的最基本要求：保證所建成的克隆來源于單個細胞。b.適合于克隆的細胞：對培養(yǎng)環(huán)境有較大適應(yīng)范圍和具有較強獨立生存能力的細胞；原代培養(yǎng)細胞和有限細胞系克隆起來有實際困難；相反，無限細胞系、轉(zhuǎn)化細胞系或腫瘤細胞系等比較容易克隆，單細胞與群體細胞相比，群體細胞更容易克隆。c.提高細胞克隆形成率的措施：選擇適宜的培養(yǎng)基、添加血清（胎牛血清）、以滋養(yǎng)細胞（如經(jīng)射線照射本身失去增殖能力的小鼠成纖維細胞）支持生長、激素（胰島素等）刺激、使用CO2培養(yǎng)箱調(diào)節(jié)PH等?！境衫w維細胞，也稱為纖維母細胞，是疏松結(jié)締組織的主要細胞成分，這種細胞具有合成和分泌蛋白質(zhì)的功能，如合成和分泌膠原纖維、\t"/item/%E6%88%90%E7%BA%A4%E7%BB%B4%E7%BB%86%E8%83%9E/_blank"彈性纖維、網(wǎng)狀纖維及有機基質(zhì)，對其他細胞起了支持生長的作用】d.細胞克隆的主要用途之一：從普通細胞系中分離出缺乏特殊基因的突變細胞系。例如：研究缺少某種特殊蛋白的細胞，根據(jù)該細胞所缺失的功能，即可發(fā)現(xiàn)正常細胞中這種蛋白的功能。6.細胞融合與細胞雜交①.細胞工程是細胞水平上的生物工程，其主要的技術(shù)手段是細胞培養(yǎng)和細胞融合。②.細胞融合：是指兩個或多個不同的細胞融合成一個細胞的現(xiàn)象。植物細胞的原生質(zhì)體可以相互融合，動物細胞在一定的物質(zhì)（如滅活的仙臺病毒、聚乙二醇等）介導(dǎo)下可以相互融合。電融合技術(shù)是在低壓交流電場中擊穿質(zhì)膜脂雙層，導(dǎo)致胞質(zhì)融通，是效率很高的新型細胞融合技術(shù)。③.基因型不同的細胞間的融合稱為細胞雜交，由于細胞雜交中染色體容易丟失，利用雜交細胞檢測特定染色體丟失與特定基因產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）減少的對應(yīng)關(guān)系可以進行基因定位【例如人—鼠雜交細胞，由于1號染色體丟失導(dǎo)致尿苷單磷酸激酶活性喪失，可知該基因在1號染色體上】。④.雜交瘤技術(shù)和單克隆抗體制備過程⑤.雜交瘤技術(shù)解決了抗血清的異質(zhì)性問題，利用仙臺病毒使經(jīng)羊細胞免疫的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合，經(jīng)篩選獲得了針對羊紅細胞的單克隆抗體?！酒⒓毎簭墓w獲取的\t"/item/%E8%84%BE%E7%BB%86%E8%83%9E/_blank"脾臟，通過機械的方法或其他方法將脾組織搗碎制成游離的脾細胞保存于等滲\t"/item/%E8%84%BE%E7%BB%86%E8%83%9E/_blank"鹽水中即形成脾細胞懸液，其中含有大量的淋巴細胞和巨噬細胞，\t"/item/%E8%84%BE%E7%BB%86%E8%83%9E/_blank"脾臟是機體細胞免疫和\t"/item/%E8%84%BE%E8%84%8F/_blank"體液免疫的中心】⑥.雜交瘤技術(shù)制備單抗的基本方法：a.用外界抗原刺激動物（如小鼠），使其發(fā)生免疫反應(yīng)，使B淋巴細胞產(chǎn)生抗體；b.利用仙臺病毒或聚乙二醇等作介導(dǎo)，使經(jīng)免疫的動物的B淋巴細胞（或脾細胞）與可以無限傳代的骨髓瘤細胞融合；c.經(jīng)過篩選、克隆培養(yǎng)，獲得來自單一細胞的既能產(chǎn)生特異抗體、又能無限增殖的雜交瘤細胞克隆。⑦a.單克隆抗體的制備運用動物細胞培養(yǎng)和動物細胞融合技術(shù)；b.兩次篩選的目的：第一次篩選是在細胞融合后選出雜交瘤細胞；第二次篩選是對雜交瘤細胞進行培養(yǎng)后選出能產(chǎn)生特定抗體的細胞群，繼續(xù)培養(yǎng)；c.雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的優(yōu)點：可以從特異抗原成分比例極少的抗原混合物中獲得單抗。特異性強，靈敏度高；7.動物的克隆繁殖①受精卵的第一次卵裂所得到的2個分裂球，每一個都可以發(fā)育為完整個體，所以第一次卵裂后全能性沒有喪失，隨著胚胎發(fā)育的繼續(xù)，有的細胞不再具有發(fā)育為完整個體的能力，只具有分化出多種組織細胞的潛能，這樣的細胞叫多能細胞，例如：多能造血干細胞；有的細胞只能分化為一種細胞，如單能造血干細胞；另外，低等動物細胞的全能性一般比較容易體現(xiàn)；癌細胞仍能逆轉(zhuǎn)為正常細胞；無論是分化還是癌化，變化的都是表現(xiàn)型，基因組成的完整性可以保留。②動物難以克隆的根本原因：細胞分化使得細胞發(fā)生了基因的差異表達，有的基因開放，有的基因關(guān)閉；動物的體細胞均已發(fā)生了分化，基因組中的基因的活動很不完全，不能像受精卵那樣發(fā)揮細胞的全能性，以此為起點進行動物克隆，難度很大。③哺乳動物的卵細胞體積小，核移植需要借助精密的顯微操作儀和高效率的細胞融合法。④體細胞克隆成功證明了：高度分化細胞經(jīng)過一定技術(shù)處理，也可以回復(fù)到類似受精卵時期的功能；在胚胎和個體發(fā)育中，細胞質(zhì)具有調(diào)控細胞核（包括異源的細胞核）發(fā)育的作用。⑤克隆羊成功的部分原因：重組卵細胞最初分裂時雖然復(fù)制了DNA，但基因的轉(zhuǎn)錄并未開始；同時，供體核DNA開始丟失來源于乳腺細胞的調(diào)節(jié)蛋白，而正是這些調(diào)節(jié)蛋白最初阻止了核基因的表達；在重組卵細胞開始第三次分裂時，原乳腺細胞的調(diào)節(jié)蛋白便全部被卵細胞質(zhì)中的蛋白因子替換了，因此核DNA被重新編排，胚細胞開始表達自己的基因，進而調(diào)控在代孕母子宮中的進一步發(fā)育。因此，羅斯林研究所的科研人員采用電脈沖細胞融合技術(shù)，選擇分裂3次時的細胞進行移植。第三章胚胎工程1.動物有胚胎發(fā)育是指受精卵發(fā)育成幼體的過程；2.成熟的精卵融合成為受精卵的過程稱為受精；受精大體包括精卵識別、精子附著于卵膜、精卵質(zhì)膜融合等過程。同種動物精子、卵細胞表面有特異性相互識別的蛋白，這是同種動物精卵才能結(jié)合的原因之一。3.胚胎發(fā)育的過程：受精卵→卵裂球（包括包括2細胞期、4細胞期、8細胞、16細胞期、32細胞期）→囊胚期→原腸胚期→幼體；4.卵裂期：受精卵不斷進行細胞分裂即卵裂，卵裂產(chǎn)生的細胞團稱卵裂球，隨著卵裂球細胞數(shù)目的增加，細胞逐漸變小，當(dāng)卵裂球含2-8個細胞時，其中的每一個細胞都具有全能性，即均可以發(fā)育成一個完整的個體。5.囊胚：又稱為胚泡，是中空的細胞團，囊胚外表為一層扁平細胞，稱滋養(yǎng)層，可發(fā)育成胚胎的附屬結(jié)構(gòu)或胚外結(jié)構(gòu)如胚盤。囊胚內(nèi)部的細胞團不斷增殖分化，將發(fā)育成完整的胚胎；內(nèi)細胞團的細胞為胚胎干細胞，是一種未分化的細胞（二倍體核型），具有發(fā)育全能性，能分化出成體動物的所有組織和器官。6.原腸胚：有外、中、內(nèi)三個胚層，具有原腸腔。原腸胚的內(nèi)、中、外三個胚層逐漸分化形成各種器官原基。胚胎工程胚胎工程通常指各種胚胎操作技術(shù)。胚胎工程的研究對象主要限定于高等脊椎動物，特別是哺乳動物。研究的重點內(nèi)容有：體外受精、胚胎體外培養(yǎng)、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干細胞培養(yǎng)等。2.體外受精和胚胎體外培養(yǎng)：①體外受精就是采集雌性動物的卵細胞和雄性動物的精子，使其在試管中受精。②培養(yǎng)過程：a.將成熟的精子放入培養(yǎng)液中培養(yǎng)，使精子達到獲能【 注意：獲得具有完成受精的能力】狀態(tài)，這樣才能穿入到卵細胞內(nèi)部；b.采集卵母細胞的和培養(yǎng)：首先從卵巢中獲得未成熟的卵母細胞，最常用的方法是卵巢經(jīng)超數(shù)排卵處理【用促性腺激素處理卵巢】后，使其超聲監(jiān)視器確定卵泡的位置，插入穿刺針吸取卵泡液，取出卵母細胞，在體外經(jīng)人工培養(yǎng)，促進其成熟；c.獲能的精子和培養(yǎng)成熟的卵細胞在體外合適的環(huán)境下共同培養(yǎng)，完成受精；d.胚胎的體外培養(yǎng)：受精后形成的受精卵需經(jīng)早期發(fā)育培養(yǎng)，才能完成植入或著床，通常移植的最適宜時期是發(fā)育到8細胞以上的胚胎，如早期囊胚；e.經(jīng)分娩產(chǎn)仔就得到“試管動物”。③由于胚胎不同發(fā)育時期生理代謝的需求不同，進行胚胎體外培養(yǎng)時，必須配置含有一系列含有不同成分的培養(yǎng)液，用以培養(yǎng)不同發(fā)育時期的胚胎；目前尚無從受精卵到新生兒的全體外培養(yǎng)技術(shù)，所以，胚胎移植為胚胎工程中獲得后代的唯一方法。3.胚胎移植的基本過程：一頭母畜（供體）發(fā)情排卵并經(jīng)配種后，在一定時間內(nèi)從其生殖器官中（輸卵管和子宮角）取出早期胚胎，然后把它們分別移植到另外一頭與供體同時發(fā)情排卵、但未經(jīng)配種的母畜（受體）的相應(yīng)部位（輸卵管或子宮角），這個來自供體的胚胎能夠在受體的子宮著床、并繼續(xù)生長發(fā)育，最后產(chǎn)下供體的后代。4.胚胎分割①是指借助顯微操作技術(shù)將早期胚胎（囊胚之前）切割成幾等份（如2等份、4等份等），再移植到代孕母子宮發(fā)育，產(chǎn)生同卵多仔后代的技術(shù)。胚胎分割可成倍增加胚胎數(shù)量，是一種快速繁殖良種畜的方法。②胚胎分割基本過程：將發(fā)育良好的胚胎移入含培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中；在顯微鏡下用切割針或切割刀分割胚胎，或用酶處理等方法將卵裂球中的細胞分開；分割的胚胎或細胞直接移植給受體，或在體外培養(yǎng)到囊胚階段再移植到受體內(nèi)，著床發(fā)育產(chǎn)仔。5.胚胎干細胞：當(dāng)受精卵分裂發(fā)育成早期胚胎（囊胚）時，內(nèi)細胞團的細胞為胚胎干細胞（簡稱ES細胞），是一種未分化的細胞，具有發(fā)育全能性和二倍體核型。①培養(yǎng)關(guān)鍵：需要一種能促進胚胎干細胞的生長，但抑制其分化的培養(yǎng)體系。②培養(yǎng)過程：在培養(yǎng)胚胎干細胞時，首先要在培養(yǎng)皿底部制備一層細胞，稱為飼養(yǎng)層【一般是胚胎成纖維細胞，因為胚胎成纖維細胞可以分泌一些能抑制細胞分化的物質(zhì)，滿足促進干細胞生長的同時抑制分化的條件】，然后將干細胞接種在飼養(yǎng)層上；把胚胎放在培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，直到內(nèi)細胞團突出飼養(yǎng)層外，然后用酶消化或機械剝離內(nèi)細胞團，再把它用酶消化成單個細胞，置于新鮮培養(yǎng)液中培養(yǎng)。6.胚胎干細胞核移植：①是指將胚胎干細胞核移植到去核的卵細胞中，經(jīng)過胚激活、胚胎培養(yǎng)、胚胎移植后直接由受體完成克隆動物（并非嚴(yán)格意義上的克?。┑募夹g(shù)。②胚胎干細胞核移植需要的技術(shù)流程：細胞核移植→胚胎體外培養(yǎng)→胚胎移植。③胚胎干細胞可以進行基因敲除，獲得基因敲除動物，如用基因敲除手段可以獲得適合人體移植的豬器官，減弱或消除排斥反應(yīng)；人體的胚胎干細胞可以轉(zhuǎn)變?yōu)槿梭w的任何一種細胞和組織，利用這一特性可以培育用于移植的細胞、組織或器官。第五章生態(tài)工程1.生態(tài)工程原理：整體、協(xié)調(diào)、循環(huán)、再生；生態(tài)工程學(xué)的研究對象：社會——經(jīng)濟——自然復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)；2.生態(tài)工程主要類型：①物質(zhì)循環(huán)利用的生態(tài)工程：城市生活垃圾進行減量化、無害化、資源化處理，如將生活垃圾中有機部分、人畜的糞便等轉(zhuǎn)化為優(yōu)質(zhì)生態(tài)復(fù)合肥；農(nóng)村地區(qū)發(fā)展養(yǎng)殖業(yè)，將農(nóng)作物秸桿“過腹還田”，利用禽畜糞便與作物秸桿培養(yǎng)食用菌后再培養(yǎng)蚯蚓，蚓糞殘渣再作為肥料，既減少或避免了田間燒草給環(huán)境帶來的污染，又增加了產(chǎn)值。②節(jié)水和廢水處理與應(yīng)用的生態(tài)工程：干旱和半干旱地區(qū)開展雨水和地表水的收集，在廣大農(nóng)業(yè)區(qū)域?qū)嵤┕?jié)水灌溉技術(shù)，城市、工業(yè)節(jié)水系統(tǒng)的開發(fā)等屬于節(jié)水性質(zhì)的生態(tài)工程；糖廠用廢棄的糖蜜制酒精，造紙廠利用廢液回收鈣粉、木質(zhì)素等物質(zhì)，屠宰場利用廢血提取生產(chǎn)凝血酶、血紅蛋白等，這些都是工業(yè)廢水、生活污水等實施減量、回收、再生、再循環(huán)的措施，屬于廢水處理和利用生態(tài)工程。③山區(qū)小流域綜合治理與開發(fā)的生態(tài)工程：在治理恢復(fù)小流域生態(tài)環(huán)境的基礎(chǔ)上，可持續(xù)利用小流域自然資源，將治坡、治溝、修梯田與發(fā)展草業(yè)、牧業(yè)、林業(yè)結(jié)合起來。④清潔及可再生能源系統(tǒng)組合利用的生態(tài)工程：a.農(nóng)作物秸桿、