演講人：日期:病理檢查常用技術(shù)解析CATALOGUE目錄01組織學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)02常規(guī)染色方法03免疫組化技術(shù)應(yīng)用04分子病理學(xué)檢測05細胞學(xué)檢查技術(shù)06高級與新興技術(shù)01組織學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)樣本采集與固定標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化取材操作溫度與pH控制固定液選擇與時效需遵循無菌原則，使用鋒利器械切取病變組織，避免擠壓或牽拉導(dǎo)致人為假象。典型樣本尺寸為1.5×1.5×0.3cm，特殊組織（如神經(jīng)）需調(diào)整厚度至0.1cm。常規(guī)采用10%中性緩沖福爾馬林，固定液體積應(yīng)為組織體積的10倍。實體器官固定時間需12-24小時，空腔器官需灌注固定，固定不足會導(dǎo)致自溶，過度固定則影響抗原性。固定環(huán)境應(yīng)保持4℃低溫以降低酶活性，pH值嚴(yán)格維持在7.2-7.4之間。針對特殊檢測（如電鏡）需采用戊二醛-多聚甲醛混合固定液，并控制滲透壓在300-310mOsm。梯度脫水程序依次經(jīng)過70%、80%、95%和100%乙醇脫水，每級停留時間根據(jù)組織類型調(diào)整（如肝組織2小時/級，脂肪組織需延長至4小時）。二甲苯透明階段需監(jiān)控組織透明度變化，通常需要3次更換溶劑。組織處理與包埋流程浸蠟與包埋優(yōu)化石蠟熔點選擇56-58℃，采用真空滲透裝置提高蠟液滲透率。包埋時需注意組織定向（如腸管需縱切包埋），包埋模具預(yù)冷至-20℃可減少結(jié)晶偽影。特殊組織需添加蜂蠟調(diào)節(jié)硬度。質(zhì)量控制節(jié)點脫水終點檢測可采用折光儀（乙醇濃度＞99.5%），蠟塊硬度測試需達到邵氏D60標(biāo)準(zhǔn)。每批處理需設(shè)置對照組織監(jiān)測處理效果。使用恒溫冷臺（-10℃）維持蠟塊硬度，切片厚度常規(guī)3-5μm（骨髓活檢需2μm）。采用一次性刀片，每切50片需更換刀口位置，刀角調(diào)整至5°可減少震顫條紋。切片制備與質(zhì)量控制精密切片技術(shù)水浴溫度控制在45±1℃，含0.1%明膠的載玻片可提高附著力。梯度烘烤程序（60℃30分鐘→80℃15分鐘）能有效避免脫片，特殊染色需采用多聚賴氨酸包被玻片。裱片與烘片規(guī)范每批次染色需設(shè)置陽性對照和陰性對照，HE染色核質(zhì)比標(biāo)準(zhǔn)為蘇木精染色時間5-8分鐘（室溫22℃）。采用數(shù)字化掃描系統(tǒng)進行色度分析，要求胞核OD值≥0.8，胞質(zhì)OD值≤0.3。染色質(zhì)控體系02常規(guī)染色方法HE染色原理與應(yīng)用蘇木精與伊紅的協(xié)同作用蘇木精作為堿性染料與細胞核內(nèi)帶負電的DNA和RNA結(jié)合，呈現(xiàn)藍紫色；伊紅作為酸性染料與細胞質(zhì)及胞外基質(zhì)中帶正電的蛋白質(zhì)（如膠原纖維）結(jié)合，呈現(xiàn)粉紅色。兩者結(jié)合可清晰區(qū)分細胞核與胞質(zhì)結(jié)構(gòu)。組織學(xué)診斷的核心技術(shù)廣泛應(yīng)用于病理活檢、手術(shù)標(biāo)本及教學(xué)切片中，如腫瘤良惡性鑒別、炎癥分級和器官組織結(jié)構(gòu)觀察，是病理診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。標(biāo)準(zhǔn)化操作流程包括脫蠟、水化、蘇木精染色、分化、返藍、伊紅染色、脫水及封固等步驟，需嚴(yán)格控制染色時間（蘇木精5-10分鐘，伊紅1-3分鐘）以保證一致性。局限性及改進方向?qū)δ承┨厥獬煞郑ㄈ琊ひ?、脂質(zhì)）染色效果不佳，需結(jié)合特殊染色或免疫組化技術(shù)補充診斷。特殊染色技術(shù)解析剛果紅染色特異性標(biāo)記淀粉樣蛋白，偏振光下呈現(xiàn)蘋果綠色雙折射，是診斷淀粉樣變性的關(guān)鍵方法。PAS染色（過碘酸雪夫反應(yīng)）檢測糖原、黏液和基底膜，糖原呈紫紅色，用于糖尿病腎小球病變或真菌感染診斷。Masson三色染色區(qū)分膠原纖維（藍色）、肌纖維（紅色）和胞核（黑褐色），常用于心肌病、纖維化疾病的研究。網(wǎng)狀纖維染色（如Gomori法）通過銀浸染技術(shù)顯示網(wǎng)狀纖維分布，用于肝硬化、腫瘤間質(zhì)浸潤評估，纖維呈黑色，背景為黃色。01020304優(yōu)質(zhì)HE切片需核質(zhì)界限分明，細胞核呈深藍紫色，胞質(zhì)為均勻粉紅色，無染料沉淀或過染。細胞核與胞質(zhì)對比度染色效果評估標(biāo)準(zhǔn)切片應(yīng)無皺褶、刀痕或氣泡，腺體、血管等微結(jié)構(gòu)層次清晰，避免脫片或染色不均。組織結(jié)構(gòu)完整性如PAS染色中糖原需定位準(zhǔn)確，無背景非特異性著色；剛果紅染色需排除假陽性干擾。特殊染色的特異性染色結(jié)果需符合臨床診斷需求，如腫瘤分級時核分裂象應(yīng)清晰可辨，否則需重新優(yōu)化染色條件。病理診斷適用性03免疫組化技術(shù)應(yīng)用抗體選擇與優(yōu)化策略需通過Westernblot、免疫熒光等交叉驗證抗體的靶標(biāo)結(jié)合能力，排除非特異性結(jié)合干擾，確?？贵w僅識別目標(biāo)抗原表位?？贵w特異性驗證通過預(yù)實驗確定最佳稀釋比例（如1:100至1:1000范圍），平衡信號強度與背景噪音，避免過度稀釋導(dǎo)致假陰性或高濃度引發(fā)假陽性。確保一抗宿主種屬與樣本種屬不同（如兔抗人抗體檢測小鼠組織需用抗兔二抗），避免內(nèi)源性免疫球蛋白干擾。抗體濃度梯度測試多克隆抗體可識別多個抗原表位，敏感性高但特異性較低；單克隆抗體特異性強但可能因表位遮蔽導(dǎo)致漏檢，需根據(jù)靶標(biāo)特性選擇。多克隆與單克隆抗體權(quán)衡01020403種屬匹配性考量采用4%中性緩沖甲醛固定24小時內(nèi)完成，避免過度固定導(dǎo)致抗原遮蔽；石蠟包埋切片厚度控制在3-5μm，保證抗原暴露一致性。根據(jù)靶蛋白特性選擇熱修復(fù)（pH6.0檸檬酸緩沖液高壓）或酶消化（胰蛋白酶/胃蛋白酶），恢復(fù)因固定掩蔽的抗原表位。使用5%BSA或正常血清封閉非特異性位點30分鐘；一抗4℃過夜孵育優(yōu)于室溫1小時，提高結(jié)合穩(wěn)定性；二抗避光孵育避免熒光淬滅。同一實驗采用相同試劑批次，設(shè)立陽性/陰性對照（如已知表達組織與空白對照），監(jiān)控實驗重復(fù)性。實驗操作標(biāo)準(zhǔn)化組織固定與處理規(guī)范抗原修復(fù)方法優(yōu)化封閉與孵育條件控制批次間質(zhì)量控制結(jié)果判讀與常見問題特異性信號評估陽性信號應(yīng)定位在預(yù)期亞細胞結(jié)構(gòu)（如膜蛋白呈膜分布，核蛋白集中于核內(nèi)），排除胞質(zhì)彌漫著色等非特異性染色。背景干擾處理高背景可能因封閉不充分或抗體濃度過高，可增加封閉時間或調(diào)整抗體稀釋度；內(nèi)源性過氧化物酶活性需用3%H?O?阻斷15分鐘。假陰性排查檢查抗原修復(fù)是否充分（如高壓時間不足）、一抗失效（通過陽性對照驗證）或樣本處理不當(dāng)（如固定過度導(dǎo)致抗原降解）。定量分析標(biāo)準(zhǔn)化采用H-score或Allred評分系統(tǒng)，綜合染色強度（0-3+）與陽性細胞百分比（0-100%），減少主觀判讀偏差。04分子病理學(xué)檢測PCR技術(shù)原理與類型PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）通過高溫變性（95℃）使DNA雙鏈解離為單鏈，低溫退火（50-65℃）使引物與模板特異性結(jié)合，中溫延伸（72℃）由DNA聚合酶合成新鏈，循環(huán)30-40次后可擴增目標(biāo)DNA片段數(shù)百萬倍。用于基因克隆、病原體檢測等基礎(chǔ)擴增，依賴電泳分析結(jié)果，靈敏度高但僅能定性。通過熒光信號實時監(jiān)測擴增過程，可精確定量初始模板量，廣泛應(yīng)用于病毒載量檢測（如HIV、HPV）和基因表達分析。將反應(yīng)體系分割為微滴，通過統(tǒng)計陽性微滴數(shù)實現(xiàn)絕對定量，適用于低頻突變檢測（如腫瘤ctDNA分析）和拷貝數(shù)變異研究?；驹沓Ｒ?guī)PCR實時熒光定量PCR（qPCR）數(shù)字PCR（dPCR）FISH與CGH技術(shù)應(yīng)用比較基因組雜交（CGH）通過對比腫瘤與正常DNA的雜交信號強度差異，全基因組篩查拷貝數(shù)變異，在實體瘤（如神經(jīng)母細胞瘤）和血液系統(tǒng)惡性腫瘤中揭示染色體失衡。03高分辨率CGH（aCGH）結(jié)合微陣列技術(shù)將檢測分辨率提升至kb級，可識別微小缺失/重復(fù)（如22q11.2微缺失綜合征），優(yōu)于傳統(tǒng)核型分析。0201熒光原位雜交（FISH）利用熒光標(biāo)記的核酸探針與樣本DNA/RNA雜交，可在細胞或組織原位定位特定基因序列，用于HER2基因擴增檢測（乳腺癌分型）和染色體易位診斷（如BCR-ABL融合基因）。新一代測序方法解析02

03

單細胞測序01

全基因組測序（WGS）在單個細胞水平解析基因組、轉(zhuǎn)錄組或表觀組異質(zhì)性，揭示腫瘤微環(huán)境細胞亞群特征及耐藥機制，推動精準(zhǔn)治療策略開發(fā)。靶向測序（Panel測序）針對特定基因集（如癌癥相關(guān)基因）進行深度測序，性價比高，適用于臨床伴隨診斷（如肺癌EGFR突變檢測）。對個體全部DNA序列進行測定，可發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)、非編碼區(qū)及結(jié)構(gòu)變異，用于罕見病診斷和腫瘤驅(qū)動突變挖掘，但數(shù)據(jù)量大、成本較高。05細胞學(xué)檢查技術(shù)通過細針穿刺病變部位獲取細胞樣本，適用于淺表淋巴結(jié)、甲狀腺、乳腺等部位，操作需注意穿刺角度與深度以避免損傷血管或神經(jīng)。細針穿刺抽吸技術(shù)（FNA）脫落細胞采集法灌洗液收集技術(shù)利用自然脫落或機械刮取的細胞（如宮頸刮片、痰液、尿液），需確保樣本新鮮且避免污染，采集后立即固定以保持細胞形態(tài)完整性。通過生理鹽水灌洗腔道（如支氣管肺泡灌洗）獲取細胞，需控制灌洗壓力與液體量，避免細胞溶解或過度稀釋影響檢測靈敏度。細胞樣本采集技巧涂片制備與染色流程快速染色法（Diff-Quik）薄層液基細胞學(xué)技術(shù)（TCT）采用蘇木精、伊紅等染料分層染色，突出細胞核與胞質(zhì)對比度，適用于宮頸癌篩查，需嚴(yán)格控制染色時間以避免過染或褪色。樣本經(jīng)離心處理后均勻分散于保存液，通過自動化設(shè)備制成單層細胞涂片，顯著減少血液或黏液干擾，提高診斷準(zhǔn)確性。通過甲醇固定后直接滴加嗜酸性及嗜堿性染料，適用于術(shù)中快速病理評估，但細胞細節(jié)分辨率低于巴氏染色。123巴氏染色（Papstain）形態(tài)學(xué)診斷要點核質(zhì)比異常分析惡性腫瘤細胞常表現(xiàn)為核質(zhì)比增高，核染色質(zhì)粗糙且分布不均，需結(jié)合核仁大小及數(shù)量綜合判斷惡性程度。細胞排列模式觀察良性病變細胞多呈規(guī)則單層排列，而癌變細胞可呈現(xiàn)三維簇狀、腺樣或散在分布，侵襲性強的腫瘤常見單個細胞浸潤現(xiàn)象。背景成分評估炎癥或壞死背景中的中性粒細胞、淋巴細胞數(shù)量可輔助判斷感染或免疫狀態(tài)，纖維蛋白滲出提示組織修復(fù)或慢性炎癥可能。06高級與新興技術(shù)數(shù)字病理學(xué)平臺介紹集成化醫(yī)療信息管理數(shù)字病理學(xué)平臺通過整合高分辨率掃描設(shè)備與云端存儲技術(shù)，實現(xiàn)病理切片的全數(shù)字化管理，支持多終端調(diào)閱、批注及三維重構(gòu)，顯著提升病理科工作效率和診斷標(biāo)準(zhǔn)化水平?？绲赜蜻h程會診功能基于5G網(wǎng)絡(luò)和加密傳輸協(xié)議，平臺可實時傳輸4K級病理圖像至全球?qū)＜叶?，解決基層醫(yī)院病理醫(yī)師短缺問題，尤其適用于罕見病鑒別和術(shù)中冰凍切片快速診斷場景。教學(xué)科研一體化應(yīng)用平臺內(nèi)置AI標(biāo)注系統(tǒng)和病例數(shù)據(jù)庫，支持病理教學(xué)中的虛擬顯微鏡訓(xùn)練，同時為臨床研究提供大規(guī)模病例數(shù)據(jù)挖掘和分子病理學(xué)關(guān)聯(lián)分析功能。質(zhì)控與標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)通過自動圖像校準(zhǔn)、染色一致性評估等模塊，確保不同機構(gòu)間診斷結(jié)果的可比性，符合國際CAP認證要求的數(shù)字化質(zhì)控體系。血液病精準(zhǔn)分型診斷利用多色熒光標(biāo)記技術(shù)（如10色以上panel），可同時檢測白血病細胞表面30余種抗原表達，實現(xiàn)AML/MDS等疾病的微小殘留病灶（MRD）監(jiān)測，靈敏度達0.01%。干細胞研究應(yīng)用結(jié)合側(cè)向散射光（SSC）和熒光染料Hoechst33342，可分離SP（sidepopulation）干細胞群體，用于造血干細胞移植前的細胞純度鑒定。免疫微環(huán)境分析通過胞內(nèi)因子染色（ICS）和增殖標(biāo)志物檢測，量化腫瘤浸潤淋巴細胞亞群比例，為免疫檢查點抑制劑療效預(yù)測提供CD8+PD-1+/CD4+FOXP3+等關(guān)鍵參數(shù)。微生物快速檢測采用核酸熒光標(biāo)記和特定抗體偶聯(lián)，實現(xiàn)血流感染中細菌/真菌的快速鑒定及藥敏試驗，較傳統(tǒng)培養(yǎng)法縮短檢測時間72小時以上。流式細胞術(shù)應(yīng)用場景人工智能輔助分析全切片圖像（WSI）智能篩查基于深度學(xué)習(xí)的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（CNN）算法，可自動識別宮頸液基細胞學(xué)中的HSIL以上病變，敏感度達98.7%，大幅降低初篩