ICS65.150

CCSB52

22

吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB22/T3298—2021

淡水魚腸道常見致病菌分離與純化

技術(shù)規(guī)程

Technicalcodeofpracticeonisolationandpurificationofcommonpathogenic

bacteriaofintestinalbacteriaforfreshwaterfish

2021-11-26發(fā)布2021-12-15實(shí)施

吉林省市場監(jiān)督管理廳發(fā)布

DB22/T3298—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件中的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。

本文件由吉林省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。

本文件起草主要單位：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)、通化師范學(xué)院、吉林省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站。

本文件主要起草人：張東鳴、陳玉珂、王秋舉、郭志欣、藺麗麗、劉洪健、趙云龍、吳振超。

I

DB22/T3298—2021

淡水魚腸道常見致病菌分離與純化技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了淡水魚腸道常見致病菌分離與純化的實(shí)驗(yàn)器具、試劑和培養(yǎng)基、準(zhǔn)備工作、分離純化

和記錄等。

本文件適用于淡水魚腸道常見致病菌的分離與純化。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB4789.28食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求

SN/T2632—2010微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

腸道致病菌intestinalpathogenicbacteria

存在于魚類腸道中可以導(dǎo)致魚類發(fā)生疾病的細(xì)菌。

注：淡水魚腸道中常見的致病菌有：金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas

hydrophila）、大腸桿菌（Escherichiacoli）、維氏氣單胞菌（Aeromonasveronii）、愛德華氏菌（Edwardsiella）

和溫和氣單胞菌（Aeromonassobria）等。

4實(shí)驗(yàn)器具

超凈工作臺(tái)、顯微鏡（10倍×100倍）、解剖鏡、離心機(jī)（RCF10000×g～30000×g）、

高壓蒸汽滅菌鍋（滅菌壓力0kg/cm2～3kg/cm2）、醫(yī)用冰箱（4℃～80℃）、電子分析天平（相

對精度1/1000）、生化培養(yǎng)箱（具備制冷功能）、pH計(jì)、勻漿器、恒溫振蕩器（往復(fù)式）、移液器（100

mL和1000mL）、漩渦混勻器（圓周震動(dòng)）、酒精燈、金屬接種環(huán)、玻璃涂布棒、無菌培養(yǎng)皿（直徑90

mm）、玻璃試管（25mL）。

5試劑和培養(yǎng)基

試劑

試劑為75%乙醇，0.7%生理鹽水，試劑均為分析純。

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DB22/T3298—2021

培養(yǎng)基

固體和液體培養(yǎng)基按表1執(zhí)行。瓊脂僅在制作LB固體培養(yǎng)基時(shí)添加，培養(yǎng)基質(zhì)量要求符合GB

4789.28的規(guī)定。

表1LB培養(yǎng)基

序號成分用量

1胰蛋白胨10.0g

2酵母提取物5.0g

3氯化鈉10.0g

4瓊脂15.0g

5蒸餾水1000mL

6準(zhǔn)備工作

器具消毒

將剪刀、鑷子、解剖刀、培養(yǎng)皿、玻璃試管和錐形瓶等器具采用高壓蒸汽滅菌鍋高壓（121℃）滅

菌20min。

制備平板

6.2.1培養(yǎng)基滅菌

將LB培養(yǎng)基置于錐形瓶中經(jīng)高壓蒸汽滅菌(121℃滅菌20min)后放置于提前滅菌的無菌操作

臺(tái)中，待培養(yǎng)基溫度不燙手且未凝固時(shí)開始倒制平板。

6.2.2倒制平板

6.2.2.1一只手拿錐形瓶，靠近酒精燈火焰，另一只手拔出棉塞；使錐形瓶瓶口迅速通過火焰，此步

驟重復(fù)2次～3次。

6.2.2.2將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，輕輕倒入厚度為3mm～5mmLB培養(yǎng)基，將培養(yǎng)

皿上蓋半掩放置。

6.2.2.3整個(gè)倒制平板過程均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。

6.2.3平板冷卻

待培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基溫度降至室溫后，蓋上蓋子，備用。

7分離純化

流程圖

2

DB22/T3298—2021

分離和純化步驟見圖1。

取樣（見7.2）

制備懸液（見7.3）

接種（見7.4）

培養(yǎng)（見7.5）

純化（見7.6）

檢驗(yàn)純度（見7.7）

保種（見7.8）

記錄（見8）

圖1分離與純化步驟

取樣

選取具有典型癥狀的瀕死病魚作為分離腸道致病菌的對象。用75%的酒精棉球?qū)︳~體體表消毒

后，打開腹腔，再用75%酒精棉球擦拭腸管外壁，將整個(gè)腸道取出，分離前腸、中腸和后腸，備用。

制備懸液

7.3.1用約2倍腸道內(nèi)容物體積的無菌生理鹽水將腸道內(nèi)容物沖入無菌離心管中，制成細(xì)菌懸液。

7.3.2將7.3.1的細(xì)菌懸液在無菌條件下涂布在LB培養(yǎng)基上28℃～37℃培養(yǎng)24h，觀察菌

落的生長情況。

7.3.3根據(jù)7.3.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在無菌條件下采用無菌的生理鹽水將7.3.1的細(xì)菌懸液稀釋成不同

倍數(shù)的稀釋菌液。建議稀釋倍數(shù)為：10-3、10-4和10-5。

接種

分別取7.3.3的稀釋菌液0.1mL，在酒精燈外焰附近采用滅菌的涂布棒將菌液均勻涂布在LB

培養(yǎng)基上，至液體全部被培養(yǎng)基吸收,每個(gè)濃度的菌液做3個(gè)重復(fù)。

3

DB22/T3298—2021

培養(yǎng)

在培養(yǎng)皿上蓋表面標(biāo)注樣品名稱、日期和采樣地等信息。置于恒溫培養(yǎng)箱中28℃～37℃倒

置培養(yǎng)24h。

純化

7.6.1劃線分離

在無菌條件下，采用接種環(huán)挑取同一培養(yǎng)皿中不同顏色和不同形態(tài)的單個(gè)菌落在無菌LB培養(yǎng)基

表面進(jìn)行連續(xù)劃線分離。在培養(yǎng)皿上蓋表面做好標(biāo)注，置于恒溫培養(yǎng)箱中28℃～37℃培養(yǎng)24h。

7.6.2純化時(shí)機(jī)

重復(fù)7.6.1操作2～3次。待培養(yǎng)基上均勻的長出顏色和形態(tài)相同的單個(gè)菌落時(shí)便可以進(jìn)行細(xì)

菌的純化培養(yǎng)。

7.6.3純化培養(yǎng)

采用無菌的接種環(huán)將挑取的單個(gè)菌落接種于裝有無菌的LB液體培養(yǎng)基試管中，在試管上標(biāo)注樣

品名稱、日期和采樣地等信息，然后將試管置于恒溫振蕩器中，在溫度28℃～37℃，轉(zhuǎn)速每分鐘

120轉(zhuǎn)的條件下，培養(yǎng)16h～18h。

檢驗(yàn)純度

培養(yǎng)結(jié)束后按照7.4和7.5的方法再進(jìn)行分離培養(yǎng)，若新平板中長出不同顏色或不同形態(tài)的菌

落，則需繼續(xù)純化，直至平板上長出相同的單一菌落。

保種

按照SN/T2632—2010中附錄D規(guī)定執(zhí)行。

8記錄

記錄內(nèi)容

記錄內(nèi)容詳見表2。

表2細(xì)菌分離與純化記錄

例次品種魚體特征取樣地點(diǎn)取樣時(shí)間取樣部位菌液濃度獲得菌株數(shù)量

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