1枯草芽孢桿菌對鹽堿地生物改良技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了農(nóng)用芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)的術(shù)語和定義、生產(chǎn)環(huán)境和設(shè)備要求、培養(yǎng)基、發(fā)酵工藝流程、指標檢測和儲運等內(nèi)容。本文件適用于農(nóng)用芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)，微生物肥料生產(chǎn)企業(yè)和其他相關(guān)單位參照使用。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本使用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB3095環(huán)境空氣質(zhì)量標準GB3838地表水環(huán)境質(zhì)量標準GB20287農(nóng)用微生物菌劑GB4789.28食品安全國家標準食品微生物學檢驗培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB/T41727農(nóng)用微生物菌劑功能評價技術(shù)規(guī)程NY/T1109微生物肥料生物安全通用技術(shù)準則SN/T2632微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義GB20287、GB/T41727界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1農(nóng)用芽孢桿菌Bacillusinoculantsappliedinagriculture芽孢桿菌科、芽孢桿菌屬，革蘭氏陽性菌，一種需氧菌。菌體桿狀，無莢膜，周生鞭毛，能運動?？尚纬蓛?nèi)生抗逆芽孢，生長、繁殖速度較快，菌落表面粗糙不透明，灰白色或微黃色。無致病性，并具有直接或間接改良土壤、恢復地力，維系根際微生物區(qū)系平衡，促進作物生長，調(diào)節(jié)作物抗逆，降解有毒、有害物質(zhì)等作用，應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，通過其中生命活動，增加植物養(yǎng)分的供應量或促進植物生長、改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)及農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境。3.2菌種strain2單一遺傳背景、由單菌落來源，用于微生物擴繁或菌種資源保藏的培養(yǎng)物。按照來源、擴繁體積可以分為初級菌種、一級菌種、二級菌種等。3.3溶解氧dissolvedoxygen溶解在水中的空氣中的分子態(tài)氧稱為溶解氧，水中的溶解氧的含量與空氣中氧的分壓、水的溫度都有密切關(guān)系，在發(fā)酵聚谷氨酸時所測值為溶解在發(fā)酵液中的分子態(tài)的氧被菌體消耗利用后的剩余含量。4生產(chǎn)環(huán)境和設(shè)備要求4.1生產(chǎn)環(huán)境應符合如下條件：——廠區(qū)空氣質(zhì)量達到GB3095中二類環(huán)境空氣質(zhì)量標準要求?！l(fā)酵生產(chǎn)用水應符合GB3838中III類水質(zhì)要求，其他用水應符合GB3838中IV類水質(zhì)要求?！l(fā)酵生產(chǎn)場地及發(fā)酵相關(guān)設(shè)施應符合安全、環(huán)保、消防等條件要求?！l(fā)酵生產(chǎn)場地需配置消毒滅菌設(shè)施。菌種儲藏、無菌操作設(shè)備應與生產(chǎn)場地相對隔離并定期消4.2生產(chǎn)設(shè)備采用不銹鋼發(fā)酵罐，設(shè)備體積根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模自定。主要生產(chǎn)設(shè)備有種子罐、液體發(fā)酵罐、補料罐、冷水機、配料機、空壓機、蒸汽鍋爐等。5培養(yǎng)基5.1一般要求培養(yǎng)基所使用的原材料應滿足菌液生產(chǎn)要求，具體按GB4789.28的規(guī)定執(zhí)行。對于首次使用的發(fā)酵原料應通過搖瓶或小型發(fā)酵試驗后再用于發(fā)酵生產(chǎn)。5.2種子培養(yǎng)基農(nóng)用芽孢桿菌的初級菌種及一級菌種使用的種子培養(yǎng)基中應含有易被菌種吸收利用的碳氮源，營養(yǎng)豐富。種子培養(yǎng)基見附錄A中的表A.1。5.3發(fā)酵培養(yǎng)基5.3.1發(fā)酵培養(yǎng)基原料主要包括淀粉、淀粉糖、蔗糖、葡萄糖、糖蜜、甘油等為主要碳源，豆粕粉、蛋白胨、酵母提取物、硫酸銨為氮源，適量的金屬鹽離子，碳酸鈣等pH緩沖劑等。5.3.2高含菌量發(fā)酵培養(yǎng)基配方需要以發(fā)酵菌量為目標，通過單因子實驗、正交實驗和響應面實驗等實驗優(yōu)化培養(yǎng)基的原料和用量。5.3.3高活性代謝物發(fā)酵培養(yǎng)基配方需要以代謝產(chǎn)物合成量為目標，通過單因子實驗、正交實驗和響應面實驗等實驗優(yōu)化培養(yǎng)基的原料和用量。5.4固體培養(yǎng)基用于農(nóng)用芽孢菌種分離、鑒定及活菌計數(shù)使用。固體培養(yǎng)基見附錄A中的表A.2。6發(fā)酵工藝流程6.1發(fā)酵生產(chǎn)流程孢芽桿菌發(fā)酵生產(chǎn)流程見圖1。圖1芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)流程圖6.2菌種要求農(nóng)用芽孢桿菌菌種應符合GB20287、GB/T41727和NY/T1109的要求。菌種保藏應按照SN/T2632的要求。6.3滅菌方法種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、菌種培養(yǎng)器材、發(fā)酵罐等均需采用高壓濕熱滅菌，滅菌條4件為115℃~121℃,0.1MPa～0.15MPa，滅菌20min～30min。滅菌后無菌操作取培養(yǎng)基染色鏡檢，無微生物說明滅菌徹底。6.4接種方法在超凈工作臺內(nèi)，采用接種針經(jīng)火焰滅菌,待冷卻后沾取少量初級菌種，轉(zhuǎn)接至裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，完成一級菌種的接種。一級菌種培養(yǎng)好后，轉(zhuǎn)移到無菌接種鋼瓶中，以接種鋼瓶與發(fā)酵罐連接進行接種，或者發(fā)酵罐接種口處需有火焰保護，將菌種三角瓶口在火焰保護下直接接種，保證無菌操作。接種時候發(fā)酵罐應調(diào)節(jié)進排氣閥，保持罐內(nèi)正壓。6.5發(fā)酵工藝參數(shù)6.5.1發(fā)酵工藝參數(shù)一般要求設(shè)置如下:a）發(fā)酵罐裝液量為60%～80%;b）發(fā)酵溫度為28℃~35℃;c）初始攪拌轉(zhuǎn)速為250rpm～300rpm;d）接種量為裝液量的2%～5%;e）初始pH值7.2～7.5，發(fā)酵過程中通過添加氨水或鹽酸維持pH值;f）發(fā)酵過程中根據(jù)發(fā)酵液體積和發(fā)酵過程的溶氧量，每分鐘0.3～1.0個發(fā)酵液體積向培養(yǎng)基中連續(xù)補充無菌空氣。h）發(fā)酵周期為18h～48h，當芽孢桿菌活菌數(shù)達到1.2x1010cfu/mL時結(jié)束發(fā)酵；發(fā)酵過程中可流加有機硅類消泡劑，也可在配置培養(yǎng)基時提前加入，具體根據(jù)發(fā)酵過程泡沫和設(shè)備性能決定。6.5.2高含菌量發(fā)酵工藝參數(shù)需要以發(fā)酵菌量為目標，通過單因子實驗、正交實驗和響應面實驗等實驗優(yōu)化發(fā)酵工藝中的裝液量、發(fā)酵溫度、攪拌速度、通氣量等發(fā)酵工藝參數(shù)。6.5.3高活性代謝物發(fā)酵培養(yǎng)基配方需要以代謝產(chǎn)物合成量為目標，通過單因子實驗、正交實驗和響應面實驗等實驗優(yōu)化培養(yǎng)基的原料和用量。6.6發(fā)酵液處理發(fā)酵后菌液按照GB20287的要求制作液體微生物菌劑，或噴霧干燥后按照GB20287的要求制作粉劑和顆粒劑微生物菌劑。7指標檢測7.1抽檢檢測每批次產(chǎn)品隨機抽樣檢測，抽樣率不低于10%，檢測指標包括感官、有效活菌數(shù)、雜菌率等，檢驗合格后方可出廠使用。7.2感官檢測通過目測、鼻嗅方式對枯草芽孢桿菌發(fā)酵液進行檢測。發(fā)酵結(jié)束后菌液為黃色或黃褐色的懸濁液有明顯發(fā)酵氣味，存放過程中可能會出現(xiàn)沉淀。每批次產(chǎn)品會因培養(yǎng)基原料不同，在顏色和氣味上略有差7.3有效活菌數(shù)測定由農(nóng)用芽孢桿菌發(fā)酵制作的發(fā)酵液、液體微生物菌劑、微生物菌劑粉劑、微生物菌劑顆粒劑中農(nóng)用芽孢桿菌有效活菌數(shù)的測定方法按照GB20287執(zhí)行。7.4雜菌率測定從測定有效活菌數(shù)的稀釋樣品中，選取3個連續(xù)適宜稀釋倍數(shù)的樣本，進行雜菌數(shù)量的測定,具體方法按GB20287執(zhí)行。8儲運檢驗合格的產(chǎn)品應儲存于通風、干燥、清潔的倉庫。倉庫內(nèi)無有害氣體、易燃易爆危險品及腐蝕