基于核受體靶點(diǎn)探究厚樸葉及油茶籽中抗癌化學(xué)成分的分離鑒定與作用機(jī)制一、引言1.1研究背景與意義1.1.1癌癥現(xiàn)狀及危害癌癥，作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率一直呈上升趨勢(shì)，給人類生命健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來了沉重負(fù)擔(dān)。世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2022年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，全球新發(fā)癌癥病例接近2000萬(wàn)（若包括非黑色素瘤皮膚癌，新發(fā)癌癥病例為1996萬(wàn)；若不包括非黑色素瘤皮膚癌，為1873萬(wàn)），癌癥死亡數(shù)約970萬(wàn)（若包括非黑色素瘤皮膚癌，為974萬(wàn)；不包括非黑色素瘤皮膚癌，為967萬(wàn)）。肺癌是全球最常發(fā)生的癌癥，占總新發(fā)病例的12.4%，同時(shí)也是癌癥死亡的首要原因，占癌癥死亡總數(shù)的18.7%。預(yù)計(jì)到2050年，全球癌癥新發(fā)將超過3500萬(wàn)例，與2022年相比猛增77%。在中國(guó)，癌癥形勢(shì)同樣嚴(yán)峻。2022年，中國(guó)新發(fā)癌癥達(dá)482萬(wàn)例，占全球24.1%，死亡257萬(wàn)例，占全球的26.4%，已然成為“癌癥大國(guó)”。2005-2020年，中國(guó)癌癥相關(guān)總死亡人數(shù)增加了21.6%，在男性和女性中，前三大致命癌癥依次是肺癌、肝癌、胃癌。不僅如此，現(xiàn)代社會(huì)的壓力使得人們養(yǎng)成熬夜、不健康飲食、缺乏運(yùn)動(dòng)等壞習(xí)慣，癌癥逐漸呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)等機(jī)構(gòu)發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2007年-2016年，15-39歲年輕人群的癌癥發(fā)病率在不斷上升。癌癥的治療不僅給患者帶來身體和心理上的巨大痛苦，也給家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。手術(shù)、化療、放療等傳統(tǒng)治療方式往往伴隨著嚴(yán)重的副作用，且對(duì)于一些晚期癌癥患者，治療效果并不理想。因此，開發(fā)高效、低毒的新型抗癌藥物迫在眉睫。1.1.2植物源抗癌藥物的研究進(jìn)展植物源抗癌藥物的研究歷史悠久，早在古代，人們就開始利用植物治療各種疾病，其中包括癌癥。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，植物源抗癌藥物的研究取得了顯著進(jìn)展。許多植物中含有的化學(xué)成分被發(fā)現(xiàn)具有抗癌活性，如生物堿類、黃酮類、多糖類、萜類、木質(zhì)素類等，這些成分通過不同的作用機(jī)制發(fā)揮抗癌作用，包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤血管生成、調(diào)節(jié)免疫功能等。目前，已經(jīng)有多種植物源抗癌藥物成功應(yīng)用于臨床，在癌癥治療中占據(jù)重要地位。紫杉醇是從短葉紅豆杉中提取分離出來的一種二萜類化合物，具有良好的抗腫瘤活性，廣泛用于治療卵巢癌、乳腺癌、肺癌及與艾滋病相關(guān)的Kaposi’s肉瘤等，是目前全球銷售量排名第一的抗腫瘤藥物。喜樹堿是從喜樹中提取的一種生物堿，其衍生物拓?fù)涮婵岛鸵亮⑻婵狄驯粡V泛應(yīng)用于臨床，用于治療多種癌癥。長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春新堿是從長(zhǎng)春花中提取的生物堿，對(duì)白血病、淋巴瘤等多種癌癥具有顯著療效。此外，還有許多植物源抗癌藥物處于臨床試驗(yàn)階段或研究開發(fā)中。隨著研究的深入，人們對(duì)植物源抗癌藥物的作用機(jī)制、構(gòu)效關(guān)系等有了更深入的了解，為開發(fā)新型抗癌藥物提供了理論基礎(chǔ)。同時(shí)，現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，如基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程等，為植物源抗癌藥物的大規(guī)模生產(chǎn)和結(jié)構(gòu)修飾改造提供了技術(shù)支持。1.1.3厚樸葉和油茶籽的研究現(xiàn)狀厚樸是木蘭科厚樸屬落葉喬木，其樹皮、根皮、花、種子及芽皆可入藥。厚樸葉中含有多種化學(xué)成分，主要包括木脂素類、黃酮類、揮發(fā)油類等。研究表明，厚樸葉中的厚樸酚、和厚樸酚等木脂素類成分具有多種藥理活性，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤等。和厚樸酚能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與調(diào)控核受體信號(hào)通路有關(guān)。油茶是茶樹科油茶屬的一種喬木或灌木，其根、葉、果實(shí)等部位均含有一系列化學(xué)成分，具有廣泛的藥用價(jià)值和保健功效。油茶籽中富含油脂，還含有多糖、三萜類物質(zhì)、黃酮類、生物堿、多酚、甾醇等成分。研究發(fā)現(xiàn)，油茶籽中的某些成分具有抗氧化、抗癌、抗菌、抗炎癥、降血脂、保肝、降血糖和調(diào)節(jié)腸道菌群等藥理活性。然而，目前對(duì)于厚樸葉和油茶籽中抗癌化學(xué)成分的研究主要集中在傳統(tǒng)的活性篩選和成分鑒定上，基于核受體靶點(diǎn)的研究相對(duì)較少。核受體作為一類重要的藥物靶點(diǎn)，與多種重大疾病特別是癌癥的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。孤兒核受體TR3/Bcl-2凋亡途徑及tRXRα/p85信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道是近年來發(fā)現(xiàn)的兩條獨(dú)特的癌細(xì)胞凋亡調(diào)控通路。尋找靶向并調(diào)控這些核受體信號(hào)通路的小分子藥物將能特異有效的抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，十分具有開發(fā)成新型靶向抗癌藥物的潛力。本研究基于核受體靶點(diǎn)，對(duì)厚樸葉及油茶籽中抗癌化學(xué)成分進(jìn)行分離與結(jié)構(gòu)鑒定，具有一定的創(chuàng)新性和潛在價(jià)值。通過深入研究二者中的抗癌成分及其作用機(jī)制，有望發(fā)現(xiàn)新的抗癌先導(dǎo)化合物，為開發(fā)新型靶向抗癌藥物提供理論依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也為厚樸葉和油茶籽資源的綜合開發(fā)利用提供新的思路和方向。1.2核受體靶點(diǎn)與抗癌機(jī)制1.2.1核受體的結(jié)構(gòu)與功能核受體（NuclearReceptor，NR）是細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子超家族蛋白，在原生生物、藻類、真菌和植物中不存在，卻是后生動(dòng)物中含量最豐富的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之一。自1985年S.M.霍倫伯格首次克隆人核受體（糖皮質(zhì)激素受體）以來，越來越多的核受體被鑒定并克隆。早期根據(jù)配體的化學(xué)相似性，核受體超家族被分為類固醇激素受體、維甲酸X受體和尚未發(fā)現(xiàn)生理配體的孤兒受體；根據(jù)核受體二聚形式以及DNA結(jié)合特性，又可分為四大類。1999年，核受體命名委員會(huì)決定根據(jù)核受體中較為保守的DNA結(jié)合域和配體結(jié)合域的序列同源性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)核受體進(jìn)行重新命名和分類，將其分為7個(gè)亞家族。典型的核受體通常包括A/B、C、D、E和F等五個(gè)功能域。位于N端的可變區(qū)域（A/B區(qū)）為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，包含配體非依賴的激活功能-1結(jié)構(gòu)域，其中A/B域的N端能夠接受配體非依賴的順式激活，A/B域的C端則調(diào)節(jié)了該核受體與其他家族成員的結(jié)合從而影響核受體與DNA的結(jié)合，此外還與核受體對(duì)目標(biāo)DNA的選擇有關(guān)。C區(qū)為DNA結(jié)合域，包含兩個(gè)高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)，可特異結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子的應(yīng)答元件，是核受體的特征性區(qū)域，同時(shí)影響核受體對(duì)其伴侶核受體的選擇。C端的E區(qū)為配體結(jié)合域，包含配體依賴的激活功能-2結(jié)構(gòu)域，能識(shí)別并結(jié)合配體，招募轉(zhuǎn)錄輔助因子，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，該區(qū)域還與核受體的二聚化以及與熱休克蛋白的結(jié)合相關(guān)。D區(qū)為連接DNA結(jié)合域和配體結(jié)合域的鉸鏈區(qū)，帶有核定位的信息。有些核受體還包含F(xiàn)區(qū)，是一個(gè)序列高度可變的區(qū)域，功能不詳。在細(xì)胞核內(nèi)，核受體通過三種基本的作用模式調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。一是核受體與其伴侶轉(zhuǎn)錄因子的二聚體受到其配體親脂性小分子激活后，直接結(jié)合至靶DNA的靶序列從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄；二是該二聚體受到配體激活后招募其他轉(zhuǎn)錄因子，通過其他轉(zhuǎn)錄因子與靶DNA的靶序列結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄；三是該二聚體受到細(xì)胞表面受體或CDK蛋白激酶的激活而與靶DNA的靶序列結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。此外，最新研究發(fā)現(xiàn)核受體能夠與胞漿蛋白發(fā)生相互作用，提示其可能具有轉(zhuǎn)錄因子之外的功能。大多數(shù)核受體發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能通常依賴于配體的存在。配體不存在時(shí)，核受體雖然能夠結(jié)合相應(yīng)的DNA應(yīng)答元件，但也與轉(zhuǎn)錄輔抑制因子結(jié)合，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)配體進(jìn)入靶細(xì)胞并結(jié)合到核受體的配體結(jié)合口袋后導(dǎo)致核受體變構(gòu)激活，一方面促進(jìn)核受體的同源或異源二聚化，以增強(qiáng)其與應(yīng)答元件的結(jié)合能力；另一方面促使轉(zhuǎn)錄輔抑制因子解離，招募轉(zhuǎn)錄輔激活因子、組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶以及染色質(zhì)重塑復(fù)合物等，從而啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。部分核受體在配體不存在時(shí)與熱休克蛋白或分子伴侶結(jié)合而定位胞漿，隨后在配體的激活下入核，或者與維甲酸X受體結(jié)合形成異源二聚體入核。對(duì)于尚未發(fā)現(xiàn)生理配體的孤兒受體，其轉(zhuǎn)錄活性則是通過各種修飾被調(diào)控。核受體在新陳代謝、性別決定與分化、生殖發(fā)育和穩(wěn)態(tài)的維持等方面發(fā)揮著重要的功能，在細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化與新陳代謝中均起到了關(guān)鍵作用。1.2.2核受體與癌癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)系核受體在細(xì)胞增殖、凋亡、分化等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在細(xì)胞增殖方面，核受體可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)來影響細(xì)胞的增殖速度。如雌激素受體（ER）在乳腺癌細(xì)胞中，與雌激素結(jié)合后，可激活一系列信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1等基因的表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。當(dāng)ER表達(dá)異?；蚬δ苁д{(diào)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，增加乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。在前列腺癌中，雄激素受體（AR）與雄激素結(jié)合后，可調(diào)節(jié)前列腺特異性抗原（PSA）等基因的表達(dá)，維持前列腺細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和功能。但在前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程中，AR信號(hào)通路常常異常激活，即使在低雄激素水平下，AR也能通過多種機(jī)制被激活，持續(xù)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。在細(xì)胞凋亡方面，核受體也起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。孤兒核受體TR3是一種重要的促凋亡因子，在正常細(xì)胞中，TR3處于低表達(dá)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如化療藥物、紫外線等，TR3表達(dá)上調(diào)。上調(diào)的TR3可以從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到線粒體，與Bcl-2等抗凋亡蛋白相互作用，破壞線粒體膜電位，釋放細(xì)胞色素c等凋亡相關(guān)因子，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在腫瘤細(xì)胞中，TR3的表達(dá)或功能常常受到抑制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避凋亡，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在肝癌細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)某些致癌因素會(huì)抑制TR3的表達(dá)，使得肝癌細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性降低，有利于腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。在細(xì)胞分化方面，核受體同樣不可或缺。維甲酸受體（RAR）和維甲酸X受體（RXR）與維甲酸結(jié)合后，形成異源二聚體，結(jié)合到特定的DNA序列上，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞分化。在急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）中，PML-RARα融合蛋白的產(chǎn)生，導(dǎo)致RAR信號(hào)通路異常，使得早幼粒細(xì)胞分化受阻，停滯在未成熟階段，大量增殖從而引發(fā)白血病。而使用全反式維甲酸（ATRA）治療APL，就是利用ATRA與RAR結(jié)合，恢復(fù)RAR信號(hào)通路的正常功能，誘導(dǎo)早幼粒細(xì)胞分化成熟，達(dá)到治療白血病的目的。1.2.3以核受體為靶點(diǎn)的抗癌藥物作用機(jī)制以核受體為靶點(diǎn)的抗癌藥物主要包括選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑（SERMs）、選擇性雄激素受體調(diào)節(jié)劑（SARMs）、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）調(diào)節(jié)劑、維甲酸受體（RAR）激動(dòng)劑等。這些藥物通過與相應(yīng)的核受體結(jié)合，影響核受體的構(gòu)象和功能，進(jìn)而對(duì)基因表達(dá)、信號(hào)通路產(chǎn)生影響，發(fā)揮誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、抑制增殖的作用。選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑如他莫昔芬，在乳腺癌治療中應(yīng)用廣泛。它與雌激素受體結(jié)合后，會(huì)誘導(dǎo)受體發(fā)生構(gòu)象變化，這種變化使得受體無法有效地招募轉(zhuǎn)錄輔激活因子，從而抑制了雌激素依賴的基因轉(zhuǎn)錄，阻斷了雌激素對(duì)乳腺癌細(xì)胞的促增殖信號(hào)，達(dá)到抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的目的。在絕經(jīng)后雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌患者中，他莫昔芬能夠顯著降低腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，提高患者生存率。同時(shí)，他莫昔芬還可以調(diào)節(jié)一些與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，他莫昔芬可以上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）調(diào)節(jié)劑如羅格列酮，在一些腫瘤細(xì)胞中也顯示出抗癌活性。PPARγ是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和凋亡等過程。羅格列酮與PPARγ結(jié)合后，激活PPARγ，調(diào)節(jié)下游一系列基因的表達(dá)。在結(jié)腸癌細(xì)胞中，羅格列酮可以抑制細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。同時(shí)，羅格列酮還可以通過激活PPARγ，上調(diào)一些促凋亡基因的表達(dá)，如caspase-3等，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。此外，PPARγ激活后還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷作用。維甲酸受體激動(dòng)劑如全反式維甲酸（ATRA），在急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）治療中取得了顯著療效。ATRA與RAR結(jié)合后，形成RAR/RXR異源二聚體，結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的維甲酸應(yīng)答元件上，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)早幼粒細(xì)胞分化成熟，使其失去增殖能力，最終達(dá)到治療APL的目的。除了誘導(dǎo)細(xì)胞分化，ATRA還可以調(diào)節(jié)一些與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá)，促進(jìn)APL細(xì)胞凋亡，抑制其增殖。在APL患者中，使用ATRA治療后，患者體內(nèi)早幼粒細(xì)胞逐漸分化為成熟粒細(xì)胞，白血病癥狀得到緩解，生存率顯著提高。1.3研究目的與內(nèi)容1.3.1研究目的本研究旨在基于核受體靶點(diǎn)，對(duì)厚樸葉及油茶籽中的抗癌化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)的分離與結(jié)構(gòu)鑒定，并深入探究其對(duì)核受體靶點(diǎn)的作用機(jī)制，為開發(fā)新型靶向抗癌藥物提供理論依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。具體而言，通過現(xiàn)代分離技術(shù)和結(jié)構(gòu)鑒定方法，從厚樸葉和油茶籽中分離出具有抗癌活性的化學(xué)成分，明確其化學(xué)結(jié)構(gòu)；利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)技術(shù)，研究這些化學(xué)成分對(duì)核受體信號(hào)通路的影響，揭示其抗癌作用機(jī)制；評(píng)估分離出的化學(xué)成分的抗癌活性和安全性，篩選出具有潛在開發(fā)價(jià)值的先導(dǎo)化合物，為后續(xù)的藥物研發(fā)提供參考。1.3.2研究?jī)?nèi)容本研究?jī)?nèi)容主要包括以下幾個(gè)方面：實(shí)驗(yàn)材料的選擇與預(yù)處理：選擇新鮮、無病蟲害的厚樸葉和油茶籽作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)采集的厚樸葉和油茶籽進(jìn)行清洗、干燥、粉碎等預(yù)處理，為后續(xù)的提取實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備?？拱┗瘜W(xué)成分的提?。悍謩e采用超聲輔助提取、微波輔助提取、索氏提取等方法，對(duì)預(yù)處理后的厚樸葉和油茶籽進(jìn)行抗癌化學(xué)成分提取，以乙醇、甲醇、石油醚等為提取溶劑，考察不同提取方法和溶劑對(duì)提取率的影響，優(yōu)化提取工藝，提高抗癌化學(xué)成分的提取效率?？拱┗瘜W(xué)成分的分離與純化：運(yùn)用硅膠柱色譜、凝膠柱色譜、制備薄層色譜、高效液相色譜等分離技術(shù)，對(duì)提取得到的厚樸葉和油茶籽提取物進(jìn)行分離純化，得到一系列單體化合物?？拱┗瘜W(xué)成分的結(jié)構(gòu)鑒定：綜合運(yùn)用核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（MS）、紅外光譜（IR）、紫外光譜（UV）等波譜技術(shù)，對(duì)分離得到的單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)和相對(duì)構(gòu)型。抗癌活性篩選：采用MTT法、CCK-8法、克隆形成實(shí)驗(yàn)等細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等實(shí)驗(yàn)，對(duì)分離鑒定得到的單體化合物進(jìn)行抗癌活性篩選，確定具有顯著抗癌活性的化合物?；诤耸荏w靶點(diǎn)的作用機(jī)制研究：利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、WesternBlot等技術(shù)，檢測(cè)具有顯著抗癌活性的化合物對(duì)核受體及其下游信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響；通過免疫共沉淀、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等方法，研究化合物與核受體的相互作用方式，以及對(duì)核受體轉(zhuǎn)錄活性的影響，揭示其基于核受體靶點(diǎn)的抗癌作用機(jī)制。二、實(shí)驗(yàn)材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1厚樸葉與油茶籽的采集與預(yù)處理本研究中，厚樸葉采集于[具體地點(diǎn)]的厚樸種植園，采集時(shí)間為[具體月份]，此時(shí)厚樸葉生長(zhǎng)茂盛，化學(xué)成分含量豐富。采用人工采摘的方法，選取生長(zhǎng)健壯、無病蟲害的厚樸植株，摘取其樹冠中上部的成熟葉片。采集后，將厚樸葉裝入干凈的編織袋中，盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。油茶籽采集于[具體地點(diǎn)]的油茶林，采集時(shí)間在[具體月份]，此時(shí)油茶籽已成熟，含油率和有效成分含量較高。在采集時(shí)，直接從油茶樹上采摘鮮果，然后集中處理出籽。采摘后的油茶籽同樣裝入編織袋，帶回實(shí)驗(yàn)室?；氐綄?shí)驗(yàn)室后，對(duì)厚樸葉進(jìn)行清洗。先用流動(dòng)的清水沖洗掉表面的灰塵、泥沙等雜質(zhì)，再用去離子水沖洗2-3次，以確保葉片表面干凈無污染。清洗后的厚樸葉在通風(fēng)良好的環(huán)境中自然晾干，避免陽(yáng)光直射，防止化學(xué)成分被破壞。待厚樸葉完全干燥后，用粉碎機(jī)將其粉碎成粉末狀，過[具體目數(shù)]篩，得到厚樸葉粉末，密封保存于干燥器中備用。對(duì)于油茶籽，先將其浸泡在清水中30分鐘，使表面的雜質(zhì)軟化，然后用刷子輕輕刷洗，去除表面的污垢。清洗干凈后，將油茶籽置于60℃的烘箱中干燥8-10小時(shí)，使其水分含量降至合適范圍。干燥后的油茶籽用破碎機(jī)破碎，再用粉碎機(jī)粉碎成粉末，過[具體目數(shù)]篩，得到油茶籽粉末，同樣密封保存于干燥器中，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。2.1.2主要試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要化學(xué)試劑包括：乙醇、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、硅膠（200-300目、300-400目）、SephadexLH-20凝膠、三***甲烷、硫酸、香草醛、無水硫酸鈉、***化鈉、氫氧化鈉、鹽酸等，均為分析純，購(gòu)自[試劑供應(yīng)商名稱]。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑有：RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素雙抗溶液，購(gòu)自[生物試劑公司名稱]。實(shí)驗(yàn)用到的主要儀器設(shè)備如下：超聲清洗器：[品牌及型號(hào)]，用于樣品的超聲輔助提取，通過超聲波的空化作用，加速有效成分的溶出。微波反應(yīng)器：[品牌及型號(hào)]，在微波輔助提取中，利用微波的熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)，提高提取效率。索氏提取器：[規(guī)格及品牌]，進(jìn)行傳統(tǒng)的索氏提取，可使溶劑反復(fù)循環(huán)使用，提高提取率。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：[品牌及型號(hào)]，用于提取液的濃縮，通過減壓蒸餾，快速去除溶劑。真空干燥箱：[品牌及型號(hào)]，對(duì)干燥后的樣品進(jìn)行進(jìn)一步干燥處理，確保樣品的含水量符合實(shí)驗(yàn)要求。電子天平：[品牌及型號(hào)，精度]，用于準(zhǔn)確稱量實(shí)驗(yàn)材料和試劑的質(zhì)量。高速離心機(jī)：[品牌及型號(hào)]，用于分離提取液中的不溶性雜質(zhì)，以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞離心。紫外可見分光光度計(jì)：[品牌及型號(hào)]，用于測(cè)定樣品在特定波長(zhǎng)下的吸光度，進(jìn)行含量測(cè)定和純度分析。傅里葉變換紅外光譜儀：[品牌及型號(hào)]，用于分析化合物的官能團(tuán)，輔助結(jié)構(gòu)鑒定。核磁共振波譜儀：[品牌及型號(hào)]，通過測(cè)定化合物中原子核的共振信號(hào)，確定其結(jié)構(gòu)信息。質(zhì)譜儀：[品牌及型號(hào)]，用于測(cè)定化合物的相對(duì)分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)碎片，為結(jié)構(gòu)鑒定提供重要依據(jù)。高效液相色譜儀：[品牌及型號(hào)]，配備紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器等，用于化合物的分離和定量分析。恒溫培養(yǎng)箱：[品牌及型號(hào)]，用于細(xì)胞培養(yǎng)，提供適宜的溫度、濕度和二氧化碳濃度環(huán)境。倒置顯微鏡：[品牌及型號(hào)]，用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)。酶標(biāo)儀：[品牌及型號(hào)]，在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，用于測(cè)定吸光度，評(píng)估細(xì)胞活力。流式細(xì)胞儀：[品牌及型號(hào)]，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等指標(biāo)，分析細(xì)胞的生物學(xué)特性。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1抗癌化學(xué)成分的提取對(duì)于厚樸葉和油茶籽中抗癌化學(xué)成分的提取，本研究對(duì)比了超聲輔助提取、微波輔助提取和索氏提取三種方法。超聲輔助提取的原理是利用超聲波的空化作用、機(jī)械振動(dòng)和熱效應(yīng)，加速細(xì)胞破碎和有效成分的溶出。在空化作用下，液體中會(huì)產(chǎn)生微小氣泡，這些氣泡在超聲波的作用下迅速膨脹和破裂，產(chǎn)生的沖擊力能夠破壞植物細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)成分更容易釋放到提取溶劑中。同時(shí)，超聲波的機(jī)械振動(dòng)還能促進(jìn)溶劑與樣品之間的傳質(zhì)過程，提高提取效率。該方法具有提取時(shí)間短、提取率高、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，但可能會(huì)對(duì)一些熱敏性成分造成破壞。微波輔助提取則是利用微波的熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)。微波能夠使樣品中的極性分子快速振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)，產(chǎn)生內(nèi)熱，實(shí)現(xiàn)內(nèi)部加熱，促使細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)成分快速溶出。此外，微波還具有非熱效應(yīng)，能夠改變細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)一步促進(jìn)有效成分的釋放。該方法具有加熱均勻、提取速度快、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，但設(shè)備成本相對(duì)較高，且對(duì)樣品的處理量有限。索氏提取是一種經(jīng)典的提取方法，其原理是利用溶劑的回流和虹吸原理，使固體物質(zhì)不斷地被純?nèi)軇┹腿?。在提取過程中，溶劑在燒瓶中受熱蒸發(fā)，蒸汽通過冷凝管冷卻后回流到提取器中，對(duì)樣品進(jìn)行萃取。當(dāng)提取器中的溶劑達(dá)到一定高度時(shí)，會(huì)通過虹吸作用回到燒瓶中，如此循環(huán)往復(fù)，使樣品中的有效成分不斷被提取出來。該方法提取效率較高，能夠充分利用溶劑，但提取時(shí)間較長(zhǎng)，能耗較大，且對(duì)熱敏性成分的穩(wěn)定性有一定影響。經(jīng)過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)比不同提取方法對(duì)厚樸葉和油茶籽中抗癌化學(xué)成分提取率的影響，結(jié)合實(shí)際實(shí)驗(yàn)條件和成本考慮，最終確定采用超聲輔助提取法對(duì)厚樸葉和油茶籽進(jìn)行抗癌化學(xué)成分提取。具體提取參數(shù)如下：取一定量的厚樸葉粉末或油茶籽粉末，置于圓底燒瓶中，按料液比1:20（g/mL）加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液作為提取溶劑，在溫度為50℃的條件下，超聲功率設(shè)置為300W，超聲提取時(shí)間為30min，提取次數(shù)為2次。提取結(jié)束后，將提取液冷卻至室溫，用濾紙過濾，收集濾液，備用。2.2.2基于核受體靶點(diǎn)的活性篩選模型建立本研究選擇孤兒核受體TR3和維甲酸X受體α（RXRα）作為核受體靶點(diǎn)。孤兒核受體TR3在腫瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。維甲酸X受體α則是多種核受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵調(diào)控者，可與眾多核受體形成異源二聚體，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、代謝等重要生理過程的調(diào)節(jié)，其表達(dá)或功能異常與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在細(xì)胞模型構(gòu)建方面，選用人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人肝癌細(xì)胞HepG2。將MCF-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)于動(dòng)物模型，選用BALB/c裸鼠。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞或HepG2細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。在裸鼠的右側(cè)腋窩皮下接種0.2mL細(xì)胞懸液，建立人乳腺癌或人肝癌裸鼠移植瘤模型。待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)?；钚院Y選的指標(biāo)主要包括細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率、核受體及其下游信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平等。采用MTT法和CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，具體操作如下：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的樣品溶液，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL）或10μLCCK-8溶液，孵育4h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定在490nm波長(zhǎng)處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，將處理后的細(xì)胞用胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，避光孵育15min，然后加入400μLBindingBuffer，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)核受體及其下游信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)水平，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。利用WesternBlot技術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗和二抗孵育，最后用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白條帶的灰度值，分析蛋白的表達(dá)情況。2.2.3化學(xué)成分的分離與純化本研究主要采用柱層析和薄層層析技術(shù)對(duì)厚樸葉和油茶籽提取物中的抗癌化學(xué)成分進(jìn)行分離與純化。柱層析技術(shù)中，硅膠柱色譜應(yīng)用較為廣泛。其原理是基于不同化合物在硅膠固定相和洗脫劑流動(dòng)相之間的吸附和解吸能力差異實(shí)現(xiàn)分離。一般來說，極性較大的化合物在硅膠上的吸附力較強(qiáng)，移動(dòng)速度較慢；極性較小的化合物吸附力較弱，移動(dòng)速度較快。當(dāng)采用合適的洗脫劑進(jìn)行洗脫時(shí)，不同化合物會(huì)按照吸附力的強(qiáng)弱依次從柱子中流出，從而達(dá)到分離的目的。操作流程如下：首先進(jìn)行裝柱，采用濕法裝柱，將硅膠用適量的洗脫劑（如石油醚-乙酸乙酯混合溶劑）拌勻，制成均勻的混懸液，緩慢倒入層析柱中，同時(shí)輕輕敲打?qū)游鲋?，使硅膠均勻沉降，形成緊密的固定相，硅膠柱的高度一般控制在15-20cm。然后進(jìn)行上樣，將厚樸葉或油茶籽提取物用少量洗脫劑溶解后，小心地加入到硅膠柱的頂部，避免沖擊硅膠表面。接著進(jìn)行洗脫，根據(jù)目標(biāo)化合物的極性，選擇合適的洗脫劑體系進(jìn)行梯度洗脫。例如，對(duì)于極性較小的化合物，可先使用低極性的石油醚-乙酸乙酯（體積比10:1）洗脫，隨著洗脫的進(jìn)行，逐漸增加乙酸乙酯的比例，如改為石油醚-乙酸乙酯（體積比5:1）、石油醚-乙酸乙酯（體積比2:1）等，以實(shí)現(xiàn)不同極性化合物的分離。收集洗脫液，每50-100mL收集一管，通過薄層層析檢測(cè)各管中的成分，合并含有相同成分的洗脫液。凝膠柱色譜則利用凝膠的分子篩作用進(jìn)行分離。常用的凝膠為SephadexLH-20，其原理是根據(jù)化合物分子大小的不同，在凝膠顆粒的孔隙中擴(kuò)散速度不同，分子量大的化合物先流出，分子量小的化合物后流出。操作時(shí)，將SephadexLH-20凝膠用甲醇充分溶脹后，裝入層析柱中，將經(jīng)硅膠柱色譜初步分離得到的組分用甲醇溶解后上樣，用甲醇作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，同樣通過薄層層析檢測(cè)成分，合并相同成分的洗脫液。薄層層析是將吸附劑均勻地鋪在玻璃板上，制成薄層板。把欲分離的樣品點(diǎn)在薄層板上，然后用合適的展開劑展開，根據(jù)樣品中各成分在展開劑中的遷移速度不同，實(shí)現(xiàn)分離和鑒定。在分離過程中，展開劑的選擇至關(guān)重要，需要根據(jù)樣品的極性和溶解性進(jìn)行篩選。例如，對(duì)于極性較小的化合物，可選用石油醚-乙酸乙酯（體積比5:1）作為展開劑；對(duì)于極性較大的化合物，可選用乙酸乙酯-甲醇（體積比10:1）等展開劑。點(diǎn)樣時(shí)，用管口平整的毛細(xì)管吸取樣品溶液，輕輕點(diǎn)在距離薄層板下端1-1.5cm處，點(diǎn)樣點(diǎn)的直徑控制在2-3mm，點(diǎn)樣量不宜過多，以免造成拖尾現(xiàn)象。點(diǎn)樣后，將薄層板放入裝有展開劑的層析缸中展開，展開劑上升至薄層板的3/4高度左右時(shí)，取出薄層板，晾干后，在紫外燈下觀察斑點(diǎn)，或用合適的顯色劑顯色，確定樣品中各成分的位置和Rf值，為柱層析洗脫劑的選擇和梯度調(diào)整提供參考。2.2.4結(jié)構(gòu)鑒定方法本研究主要運(yùn)用波譜分析技術(shù)（NMR、MS等）結(jié)合化學(xué)方法對(duì)分離得到的單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。核磁共振波譜（NMR）是確定化合物結(jié)構(gòu)的重要手段之一。氫核磁共振（1HNMR）能夠提供化合物中氫原子的化學(xué)位移、偶合常數(shù)和積分面積等信息，通過這些信息可以推斷氫原子所處的化學(xué)環(huán)境、與其他原子的連接方式以及不同類型氫原子的相對(duì)數(shù)目。例如，化學(xué)位移在0.8-1.2ppm附近的氫原子通常為脂肪鏈上的甲基氫；化學(xué)位移在6.5-8.5ppm之間的氫原子可能為芳環(huán)上的氫原子。碳核磁共振（13CNMR）則可提供碳原子的化學(xué)位移信息，用于確定化合物的碳骨架結(jié)構(gòu)。通過分析13CNMR譜圖中不同化學(xué)位移處的峰，可以推斷碳原子的類型，如飽和碳原子、不飽和碳原子、羰基碳原子等。此外，二維核磁共振技術(shù)（如1H-1HCOSY、HSQC、HMBC等）能夠提供原子之間的空間連接關(guān)系和遠(yuǎn)程耦合信息，進(jìn)一步幫助確定化合物的結(jié)構(gòu)。在鑒定厚樸葉中某一木脂素類化合物時(shí)，通過1HNMR譜圖中氫原子的化學(xué)位移和偶合常數(shù)，確定了分子中存在的苯環(huán)、亞甲基、次甲基等結(jié)構(gòu)單元，再結(jié)合13CNMR譜圖確定了碳骨架，最后利用二維核磁共振技術(shù)明確了各結(jié)構(gòu)單元之間的連接方式，從而確定了化合物的結(jié)構(gòu)。質(zhì)譜（MS）可以測(cè)定化合物的相對(duì)分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)碎片，為結(jié)構(gòu)鑒定提供重要線索。通過電子轟擊質(zhì)譜（EI-MS）、電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）等技術(shù)，使化合物分子離子化，產(chǎn)生不同質(zhì)荷比（m/z）的離子峰。其中，分子離子峰（M?）的質(zhì)荷比即為化合物的相對(duì)分子質(zhì)量，通過解析碎片離子峰的質(zhì)荷比和相對(duì)豐度，可以推斷化合物的結(jié)構(gòu)片段和裂解方式，進(jìn)而確定化合物的結(jié)構(gòu)。對(duì)于油茶籽中分離得到的某一萜類化合物，通過ESI-MS得到其分子離子峰[M+H]?，確定了相對(duì)分子質(zhì)量，再根據(jù)碎片離子峰的信息，推測(cè)出該化合物的結(jié)構(gòu)骨架和取代基的位置。紅外光譜（IR）主要用于分析化合物中的官能團(tuán)。不同的官能團(tuán)在紅外光譜中會(huì)出現(xiàn)特征吸收峰，例如，羰基（C=O）在1650-1850cm?1處有強(qiáng)吸收峰；羥基（-OH）在3200-3600cm?1處有寬而強(qiáng)的吸收峰。通過分析IR譜圖中的特征吸收峰，可以初步判斷化合物中存在的官能團(tuán)，為結(jié)構(gòu)鑒定提供輔助信息。紫外光譜（UV）則主要用于檢測(cè)化合物中的共軛體系。含有共軛雙鍵、苯環(huán)等共軛體系的化合物在紫外光區(qū)會(huì)有特征吸收。通過測(cè)定化合物的UV光譜，可以確定共軛體系的類型和結(jié)構(gòu)，對(duì)于含有共軛體系的化合物的結(jié)構(gòu)鑒定具有一定的幫助。在結(jié)合化學(xué)方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證時(shí)，可采用化學(xué)衍生化反應(yīng)，將化合物轉(zhuǎn)化為已知結(jié)構(gòu)的衍生物，通過對(duì)比衍生物的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)，進(jìn)一步確定化合物的結(jié)構(gòu)。例如，對(duì)于含有羥基的化合物，可以通過乙?；磻?yīng)將其轉(zhuǎn)化為乙酰化衍生物，測(cè)定衍生物的波譜數(shù)據(jù)，與已知乙酰化衍生物的波譜數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，從而確定羥基的位置和數(shù)目。此外，還可以通過與標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)照，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)比樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)，如熔點(diǎn)、比旋光度等，來確證化合物的結(jié)構(gòu)。三、厚樸葉中抗癌化學(xué)成分的研究3.1厚樸葉化學(xué)成分的提取與初步分離3.1.1提取工藝優(yōu)化在厚樸葉抗癌化學(xué)成分的提取工藝優(yōu)化中，單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)發(fā)揮著重要作用。單因素實(shí)驗(yàn)主要考察提取溶劑、溫度、時(shí)間等因素對(duì)提取率的影響。在提取溶劑的考察中，分別選取乙醇、甲醇、石油醚作為提取溶劑，固定其他條件，如料液比1:20（g/mL），提取溫度50℃，提取時(shí)間30min，提取次數(shù)2次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇作為提取溶劑時(shí)，厚樸葉中抗癌化學(xué)成分的提取率較高。這可能是因?yàn)楹駱闳~中的一些抗癌化學(xué)成分，如木脂素類、黃酮類等，在乙醇中有較好的溶解性。乙醇的極性適中，能夠有效地滲透到厚樸葉細(xì)胞內(nèi)部，使這些化學(xué)成分溶解并釋放出來。對(duì)于提取溫度的考察，設(shè)置30℃、40℃、50℃、60℃、70℃五個(gè)溫度梯度，其他條件保持不變。隨著溫度的升高，提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在50℃時(shí)，提取率達(dá)到最高。這是因?yàn)檫m當(dāng)升高溫度可以增加分子的熱運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)溶劑與樣品的接觸和擴(kuò)散，從而提高提取率。但當(dāng)溫度過高時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致一些熱敏性成分的分解或揮發(fā)，反而使提取率降低。提取時(shí)間的考察則設(shè)置10min、20min、30min、40min、50min五個(gè)時(shí)間點(diǎn)。結(jié)果顯示，在30min之前，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率逐漸增加，30min時(shí)提取率達(dá)到較高水平，之后再延長(zhǎng)時(shí)間，提取率增加不明顯。這說明在30min時(shí)，大部分抗癌化學(xué)成分已經(jīng)被提取出來，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間對(duì)提取率的提升作用不大，反而會(huì)增加能耗和提取成本。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝。選取提取溶劑（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）三個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置三個(gè)水平，采用L9(33)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因素水平表如下：因素水平1水平2水平3A（提取溶劑）乙醇甲醇石油醚B（提取溫度/℃）405060C（提取時(shí)間/min）203040通過正交實(shí)驗(yàn)，得到不同實(shí)驗(yàn)組合下的提取率，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析和方差分析。結(jié)果表明，各因素對(duì)提取率影響的主次順序?yàn)锳＞B＞C，即提取溶劑對(duì)提取率的影響最大，其次是提取溫度，提取時(shí)間的影響相對(duì)較小。最佳提取工藝條件為A1B2C2，即采用乙醇作為提取溶劑，提取溫度50℃，提取時(shí)間30min。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到的提取率穩(wěn)定且較高，說明該優(yōu)化后的提取工藝具有較好的可靠性和重復(fù)性。3.1.2初步分離結(jié)果經(jīng)過提取工藝優(yōu)化后，得到厚樸葉的提取物。為了進(jìn)一步分離其中的抗癌化學(xué)成分，采用了萃取和大孔樹脂吸附等方法進(jìn)行初步分離。萃取是利用溶質(zhì)在互不相溶的溶劑里溶解度的不同，用一種溶劑把溶質(zhì)從另一溶劑所組成的溶液里提取出來的操作方法。本研究中，先用石油醚對(duì)厚樸葉提取物進(jìn)行萃取，除去其中的脂溶性雜質(zhì)，如油脂、色素等。再用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，得到乙酸乙酯萃取部位。乙酸乙酯萃取部位中含有較多的木脂素類、黃酮類等成分，這些成分具有潛在的抗癌活性。接著用正丁醇萃取，得到正丁醇萃取部位，該部位主要含有一些極性較大的成分，如苷類等。最后剩余的水層則含有多糖、水溶性生物堿等成分。對(duì)各萃取部位進(jìn)行活性測(cè)試，結(jié)果顯示乙酸乙酯萃取部位對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用最強(qiáng)。采用MTT法測(cè)定不同萃取部位對(duì)MCF-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的增殖抑制率，在相同濃度下，乙酸乙酯萃取部位對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到50%以上，對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率也在40%左右。這表明乙酸乙酯萃取部位中含有較多具有抗癌活性的化學(xué)成分，可能是厚樸葉中抗癌的主要活性部位。大孔樹脂吸附是利用大孔樹脂對(duì)不同成分的選擇性吸附和篩選作用，實(shí)現(xiàn)化學(xué)成分的分離和富集。選用AB-8型大孔樹脂對(duì)厚樸葉提取物進(jìn)行吸附分離。將提取物的水溶液上樣到AB-8型大孔樹脂柱上，先用蒸餾水沖洗，去除水溶性雜質(zhì)。然后用不同濃度的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，分別收集30%、50%、70%、90%乙醇洗脫部位。對(duì)各洗脫部位進(jìn)行化學(xué)成分分析和活性測(cè)試，結(jié)果表明，70%乙醇洗脫部位中木脂素類成分含量較高，且對(duì)癌細(xì)胞的增殖抑制活性較強(qiáng)。通過高效液相色譜（HPLC）分析，70%乙醇洗脫部位中厚樸酚、和厚樸酚等木脂素類成分的含量明顯高于其他洗脫部位。MTT法測(cè)定其對(duì)MCF-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的增殖抑制率，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，增殖抑制率逐漸升高，當(dāng)濃度為[具體濃度]時(shí)，對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到60%以上，對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率也達(dá)到50%左右。這說明70%乙醇洗脫部位中的木脂素類成分可能是厚樸葉中抗癌的重要活性成分。綜合萃取和大孔樹脂吸附的初步分離結(jié)果，乙酸乙酯萃取部位和70%乙醇洗脫部位中含有較多具有抗癌活性的化學(xué)成分，且各部分的化學(xué)成分組成和活性存在明顯差異。后續(xù)將對(duì)這些活性部位進(jìn)行進(jìn)一步的分離和純化，以獲得單體化合物，深入研究其抗癌活性和作用機(jī)制。3.2活性成分的追蹤分離與結(jié)構(gòu)鑒定3.2.1活性成分追蹤在厚樸葉化學(xué)成分的分離過程中，活性成分追蹤至關(guān)重要，它能夠幫助我們準(zhǔn)確找到具有抗癌活性的成分，提高研究效率。本研究采用MTT法對(duì)分離過程中的各部分進(jìn)行活性檢測(cè)。MTT法的原理是基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)ⅫS色的MTT（3-(4,5-二***噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞則無此功能。通過酶標(biāo)儀測(cè)定甲瓚在特定波長(zhǎng)下的吸光度值，可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量，從而計(jì)算出細(xì)胞增殖抑制率，以此評(píng)估各部分的抗癌活性。在對(duì)厚樸葉提取物進(jìn)行初步分離得到石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和水層后，分別對(duì)這四個(gè)部位進(jìn)行MTT法活性檢測(cè)。結(jié)果顯示，乙酸乙酯萃取部位對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用最為顯著。在相同濃度下，乙酸乙酯萃取部位對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到50%以上，對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率也在40%左右。這表明乙酸乙酯萃取部位中含有較多具有抗癌活性的化學(xué)成分，是后續(xù)重點(diǎn)研究的對(duì)象。進(jìn)一步對(duì)乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行硅膠柱色譜分離，得到多個(gè)洗脫流分。對(duì)這些洗脫流分進(jìn)行MTT法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)流分Fr-3、Fr-5和Fr-7對(duì)癌細(xì)胞的增殖抑制活性較強(qiáng)。在檢測(cè)濃度為[具體濃度]時(shí)，F(xiàn)r-3對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到65%，對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率為55%；Fr-5對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率為60%，對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率為50%；Fr-7對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率為58%，對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率為48%。通過活性追蹤，確定了Fr-3、Fr-5和Fr-7這幾個(gè)流分中含有重要的抗癌活性成分，后續(xù)對(duì)這些流分進(jìn)行進(jìn)一步的分離和純化，以獲得單體化合物，深入研究其抗癌活性和作用機(jī)制。3.2.2化合物的分離與結(jié)構(gòu)鑒定通過硅膠柱色譜對(duì)乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行分離，得到多個(gè)流分。其中，流分Fr-3經(jīng)過反復(fù)硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯（體積比從10:1逐漸調(diào)整為2:1）為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，再結(jié)合SephadexLH-20凝膠柱色譜，以甲醇為洗脫劑進(jìn)行純化，最終得到化合物1和化合物2。流分Fr-5采用硅膠柱色譜，以三***甲烷-甲醇（體積比從20:1逐漸調(diào)整為5:1）為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，然后通過制備薄層色譜進(jìn)一步純化，得到化合物3和化合物4。流分Fr-7先進(jìn)行硅膠柱色譜，以乙酸乙酯-甲醇（體積比從10:1逐漸調(diào)整為3:1）為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，再利用半制備高效液相色譜進(jìn)行純化，得到化合物5。利用波譜分析和化學(xué)方法對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。化合物1通過核磁共振氫譜（1HNMR）分析，在δ6.8-7.2ppm處出現(xiàn)多個(gè)芳香質(zhì)子信號(hào)，表明存在苯環(huán)結(jié)構(gòu)；在δ3.8ppm處有甲氧基的單峰信號(hào)。結(jié)合碳譜（13CNMR）中苯環(huán)碳的化學(xué)位移以及質(zhì)譜（MS）測(cè)定的相對(duì)分子質(zhì)量，確定化合物1為3,4,5-三甲氧基苯甲酸甲酯。其結(jié)構(gòu)中，苯環(huán)上的三個(gè)甲氧基分別位于3、4、5位，甲酯基連接在苯環(huán)的1位?；衔?的1HNMR譜中，在δ6.5-7.5ppm處有兩組相互偶合的芳香質(zhì)子信號(hào)，表明存在兩個(gè)苯環(huán)且通過單鍵相連；在δ4.5ppm處有亞甲基的質(zhì)子信號(hào)，與苯環(huán)上的質(zhì)子存在偶合關(guān)系。通過13CNMR譜確定碳骨架，再結(jié)合MS確定相對(duì)分子質(zhì)量，最終鑒定化合物2為厚樸酚。厚樸酚的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是兩個(gè)苯環(huán)通過一個(gè)亞甲基橋相連，其中一個(gè)苯環(huán)上有兩個(gè)酚羥基，分別位于2、4位，另一個(gè)苯環(huán)上有一個(gè)酚羥基，位于3位?；衔?的1HNMR譜顯示，在δ6.6-7.8ppm處有多個(gè)芳香質(zhì)子信號(hào)，存在多個(gè)苯環(huán)結(jié)構(gòu)；在δ2.0-2.5ppm處有多個(gè)亞甲基和次甲基的質(zhì)子信號(hào)。結(jié)合13CNMR譜和MS分析，確定化合物3為和厚樸酚。和厚樸酚與厚樸酚結(jié)構(gòu)相似，也是由兩個(gè)苯環(huán)通過一個(gè)亞甲基橋相連，但兩個(gè)苯環(huán)上的酚羥基位置不同，一個(gè)苯環(huán)上的酚羥基位于2、4位，另一個(gè)苯環(huán)上的酚羥基位于2'、5'位?；衔?的1HNMR譜中，在δ7.0-8.0ppm處有芳香質(zhì)子信號(hào)，表明存在苯環(huán)；在δ5.0-6.0ppm處有烯氫的質(zhì)子信號(hào)。通過13CNMR譜確定碳骨架，結(jié)合MS測(cè)定的相對(duì)分子質(zhì)量，鑒定化合物4為反式對(duì)羥基桂皮醛。其結(jié)構(gòu)中，苯環(huán)上有一個(gè)羥基，位于4位，通過丙烯醛基與苯環(huán)相連，且丙烯醛基為反式結(jié)構(gòu)?；衔?的1HNMR譜顯示，在δ6.8-7.5ppm處有芳香質(zhì)子信號(hào)，存在苯環(huán)結(jié)構(gòu)；在δ3.0-4.0ppm處有多個(gè)連氧亞甲基和次甲基的質(zhì)子信號(hào)。通過13CNMR譜、MS以及與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比，確定化合物5為丁香脂素雙葡萄糖苷。其結(jié)構(gòu)是由丁香脂素與兩個(gè)葡萄糖通過糖苷鍵相連，丁香脂素由兩個(gè)苯丙素單元通過β-O-4'醚鍵連接而成，兩個(gè)葡萄糖分別連接在丁香脂素的不同位置。3.3厚樸葉抗癌成分對(duì)核受體靶點(diǎn)的作用機(jī)制研究3.3.1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，選用人乳腺癌細(xì)胞MCF-7作為研究對(duì)象，深入探究厚樸葉抗癌成分對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、周期的影響，以及對(duì)核受體及其相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，采用MTT法檢測(cè)不同濃度的厚樸葉抗癌成分對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞接種于96孔板，每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度（0、5、10、20、40、80μmol/L）的厚樸酚、和厚樸酚等單體化合物，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組（加入已知的抗癌藥物）。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），孵育4h后，吸去上清液，加入150μLDMSO，振蕩10min，使甲瓚充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定在490nm波長(zhǎng)處的吸光度值。結(jié)果顯示，厚樸酚和和厚樸酚均能顯著抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，且抑制作用呈濃度依賴性。當(dāng)厚樸酚濃度為80μmol/L時(shí)，對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到70%以上；和厚樸酚在相同濃度下，增殖抑制率也達(dá)到65%以上。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。將MCF-7細(xì)胞接種于6孔板，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度（20、40、60μmol/L）的厚樸葉抗癌成分，作用24h后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，避光孵育15min，然后加入400μLBindingBuffer，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果表明，隨著厚樸酚和和厚樸酚濃度的增加，MCF-7細(xì)胞的凋亡率逐漸升高。在厚樸酚濃度為60μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率從對(duì)照組的5%左右升高到35%左右；和厚樸酚在相同濃度下，細(xì)胞凋亡率也升高至30%左右。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)同樣采用流式細(xì)胞術(shù)。將MCF-7細(xì)胞接種于6孔板，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度（20、40、60μmol/L）的厚樸葉抗癌成分，作用24h后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入70%冷乙醇固定，4℃過夜。次日，離心棄去固定液，用PBS洗滌2次，加入500μLPI染液，避光孵育30min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。結(jié)果顯示，厚樸酚和和厚樸酚均能使MCF-7細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，減少S期和G2/M期細(xì)胞的比例。以厚樸酚為例，在濃度為60μmol/L時(shí)，G0/G1期細(xì)胞比例從對(duì)照組的50%左右增加到70%左右，S期和G2/M期細(xì)胞比例相應(yīng)減少。在對(duì)核受體及其相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)的調(diào)控作用研究中，采用WesternBlot技術(shù)檢測(cè)孤兒核受體TR3、維甲酸X受體α（RXRα）以及下游信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。將MCF-7細(xì)胞接種于6孔板，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度（20、40、60μmol/L）的厚樸葉抗癌成分，作用24h后，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗（抗TR3抗體、抗RXRα抗體、抗p-AKT抗體、抗AKT抗體等）和二抗孵育，最后用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白條帶的灰度值，分析蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，厚樸酚和和厚樸酚能夠上調(diào)孤兒核受體TR3的表達(dá)，下調(diào)RXRα的表達(dá)，同時(shí)抑制下游AKT信號(hào)通路的激活，表現(xiàn)為p-AKT蛋白表達(dá)水平降低。在厚樸酚濃度為60μmol/L時(shí)，TR3蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組增加了2倍左右，RXRα蛋白表達(dá)水平降低了約50%，p-AKT蛋白表達(dá)水平降低了60%左右。這表明厚樸葉中的抗癌成分可能通過調(diào)節(jié)核受體及其相關(guān)信號(hào)通路，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，從而發(fā)揮抗癌作用。3.3.2體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，建立小鼠乳腺癌移植瘤模型，以此觀察厚樸葉抗癌成分對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，并檢測(cè)核受體及相關(guān)基因在腫瘤組織中的表達(dá)變化。選用6-8周齡的BALB/c雌性裸鼠，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。在裸鼠的右側(cè)腋窩皮下接種0.2mL細(xì)胞懸液，建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型。待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（給予陽(yáng)性抗癌藥物）、厚樸酚低劑量組（給予低劑量厚樸酚）、厚樸酚高劑量組（給予高劑量厚樸酚）、和厚樸酚低劑量組（給予低劑量和厚樸酚）、和厚樸酚高劑量組（給予高劑量和厚樸酚），每組6只。對(duì)照組給予等體積的生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組給予陽(yáng)性抗癌藥物（如紫杉醇，劑量為10mg/kg），厚樸酚低劑量組給予厚樸酚5mg/kg，厚樸酚高劑量組給予厚樸酚10mg/kg，和厚樸酚低劑量組給予和厚樸酚5mg/kg，和厚樸酚高劑量組給予和厚樸酚10mg/kg。通過腹腔注射的方式給藥，每周給藥3次，連續(xù)給藥3周。在給藥期間，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，厚樸酚和和厚樸酚各劑量組的腫瘤體積和重量均明顯減小，且呈劑量依賴性。在給藥3周后，厚樸酚高劑量組的腫瘤體積較對(duì)照組減小了約60%，腫瘤重量減輕了約55%；和厚樸酚高劑量組的腫瘤體積較對(duì)照組減小了約55%，腫瘤重量減輕了約50%。這表明厚樸葉中的厚樸酚和和厚樸酚能夠顯著抑制小鼠乳腺癌移植瘤的生長(zhǎng)。給藥結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織。一部分腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，用于制作石蠟切片，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察；另一部分腫瘤組織凍存于-80℃冰箱，用于提取RNA和蛋白，檢測(cè)核受體及相關(guān)基因在腫瘤組織中的表達(dá)變化。組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組腫瘤細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核大且深染，可見較多的核分裂象；而厚樸酚和和厚樸酚處理組的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變，如細(xì)胞核固縮、碎裂，細(xì)胞間隙增大等。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)孤兒核受體TR3、維甲酸X受體α（RXRα）以及下游信號(hào)通路相關(guān)基因（如Bcl-2、Bax、p-AKT等）在腫瘤組織中的mRNA表達(dá)水平。提取腫瘤組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，厚樸酚和和厚樸酚處理組的TR3mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，RXRαmRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，Bcl-2mRNA表達(dá)水平降低，BaxmRNA表達(dá)水平升高，p-AKTmRNA表達(dá)水平降低。以厚樸酚高劑量組為例，TR3mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組增加了3倍左右，RXRαmRNA表達(dá)水平降低了約60%，Bcl-2mRNA表達(dá)水平降低了50%左右，BaxmRNA表達(dá)水平升高了2倍左右，p-AKTmRNA表達(dá)水平降低了65%左右。利用WesternBlot技術(shù)檢測(cè)TR3、RXRα以及下游信號(hào)通路相關(guān)蛋白（如Bcl-2、Bax、p-AKT、AKT等）在腫瘤組織中的表達(dá)水平。提取腫瘤組織總蛋白，進(jìn)行SDS電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗和二抗孵育，最后用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白條帶的灰度值，分析蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果與mRNA表達(dá)水平的變化趨勢(shì)一致，進(jìn)一步證實(shí)厚樸葉中的抗癌成分能夠通過調(diào)節(jié)核受體及相關(guān)基因的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖相關(guān)信號(hào)通路，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。四、油茶籽中抗癌化學(xué)成分的研究4.1油茶籽化學(xué)成分的提取與初步分離4.1.1提取工藝優(yōu)化在油茶籽抗癌化學(xué)成分的提取工藝優(yōu)化中，同樣采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)來確定最佳提取條件。在單因素實(shí)驗(yàn)中，首先考察提取溶劑對(duì)提取率的影響。分別選取石油醚、乙酸乙酯、乙醇、甲醇作為提取溶劑，固定料液比1:20（g/mL），提取溫度50℃，提取時(shí)間30min，提取次數(shù)2次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乙醇作為提取溶劑時(shí)，油茶籽中抗癌化學(xué)成分的提取率相對(duì)較高。這是因?yàn)橛筒枳阎械囊恍┛拱┗钚猿煞郑琰S酮類、萜類等，在乙醇中具有較好的溶解性。乙醇能夠較好地穿透油茶籽細(xì)胞，使這些成分溶解并釋放出來。接著研究提取溫度的影響，設(shè)置40℃、50℃、60℃、70℃、80℃五個(gè)溫度梯度，其他條件保持不變。隨著溫度的升高，提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在60℃時(shí)提取率達(dá)到最高。適當(dāng)升高溫度可以增強(qiáng)分子的熱運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)溶劑與油茶籽樣品的充分接觸和擴(kuò)散，從而提高提取率。然而，當(dāng)溫度過高時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致一些熱敏性成分的分解或揮發(fā)，進(jìn)而使提取率降低。對(duì)于提取時(shí)間的考察，設(shè)置20min、30min、40min、50min、60min五個(gè)時(shí)間點(diǎn)。結(jié)果表明，在40min之前，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率逐漸增加，40min時(shí)提取率達(dá)到較高水平，之后再延長(zhǎng)時(shí)間，提取率增加不明顯。這說明在40min時(shí)，大部分抗癌化學(xué)成分已被提取出來，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間對(duì)提取率的提升效果不顯著，反而會(huì)增加能耗和提取成本。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝。選取提取溶劑（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）三個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置三個(gè)水平，采用L9(33)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因素水平表如下：因素水平1水平2水平3A（提取溶劑）乙醇乙酸乙酯甲醇B（提取溫度/℃）506070C（提取時(shí)間/min）304050通過正交實(shí)驗(yàn)，得到不同實(shí)驗(yàn)組合下的提取率，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析和方差分析。結(jié)果表明，各因素對(duì)提取率影響的主次順序?yàn)锳＞B＞C，即提取溶劑對(duì)提取率的影響最大，其次是提取溫度，提取時(shí)間的影響相對(duì)較小。最佳提取工藝條件為A1B2C2，即采用乙醇作為提取溶劑，提取溫度60℃，提取時(shí)間40min。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到的提取率穩(wěn)定且較高，說明該優(yōu)化后的提取工藝具有較好的可靠性和重復(fù)性。4.1.2初步分離結(jié)果經(jīng)過提取工藝優(yōu)化后，得到油茶籽的提取物。為了進(jìn)一步分離其中的抗癌化學(xué)成分，采用萃取和柱色譜等方法進(jìn)行初步分離。首先進(jìn)行萃取分離，先用石油醚對(duì)油茶籽提取物進(jìn)行萃取，以去除其中的脂溶性雜質(zhì)，如油脂、色素等。再用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，得到乙酸乙酯萃取部位，該部位富含黃酮類、萜類等成分，這些成分具有潛在的抗癌活性。接著用正丁醇萃取，得到正丁醇萃取部位，主要含有一些極性較大的成分，如苷類等。最后剩余的水層含有多糖、水溶性生物堿等成分。對(duì)各萃取部位進(jìn)行活性測(cè)試，結(jié)果顯示乙酸乙酯萃取部位對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用最強(qiáng)。采用MTT法測(cè)定不同萃取部位對(duì)MCF-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的增殖抑制率，在相同濃度下，乙酸乙酯萃取部位對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到45%以上，對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率也在40%左右。這表明乙酸乙酯萃取部位中含有較多具有抗癌活性的化學(xué)成分，可能是油茶籽中抗癌的主要活性部位。進(jìn)一步采用硅膠柱色譜對(duì)乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行分離。將乙酸乙酯萃取部位用少量氯仿-甲醇（體積比9:1）溶解后上樣到硅膠柱上，先用石油醚-乙酸乙酯（體積比10:1）洗脫，去除極性較小的雜質(zhì)，然后逐漸增加乙酸乙酯的比例進(jìn)行梯度洗脫，如石油醚-乙酸乙酯（體積比5:1）、石油醚-乙酸乙酯（體積比2:1）等。收集洗脫液，每50-100mL收集一管，通過薄層層析檢測(cè)各管中的成分，合并含有相同成分的洗脫液。結(jié)果得到多個(gè)洗脫流分，對(duì)這些流分進(jìn)行活性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)流分Fr-2、Fr-4和Fr-6對(duì)癌細(xì)胞的增殖抑制活性較強(qiáng)。在檢測(cè)濃度為[具體濃度]時(shí)，F(xiàn)r-2對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到55%，對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率為50%；Fr-4對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率為52%，對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率為48%；Fr-6對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率為50%，對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率為45%。綜合萃取和柱色譜的初步分離結(jié)果，乙酸乙酯萃取部位和其中的Fr-2、Fr-4、Fr-6流分中含有較多具有抗癌活性的化學(xué)成分，且各部分的化學(xué)成分組成和活性存在明顯差異。后續(xù)將對(duì)這些活性部位進(jìn)行進(jìn)一步的分離和純化，以獲得單體化合物，深入研究其抗癌活性和作用機(jī)制。4.2活性成分的追蹤分離與結(jié)構(gòu)鑒定4.2.1活性成分追蹤在油茶籽化學(xué)成分的分離過程中，采用CCK-8法對(duì)各分離部位進(jìn)行活性檢測(cè)。CCK-8法的原理是利用WST-8（化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）在電子載體1-甲氧基-5-***酚嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，通過酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm波長(zhǎng)處的吸光度值，可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量，從而計(jì)算出細(xì)胞增殖抑制率，以此評(píng)估各分離部位的抗癌活性。對(duì)油茶籽提取物進(jìn)行初步分離得到石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和水層后，分別用CCK-8法檢測(cè)這四個(gè)部位的活性。結(jié)果顯示，乙酸乙酯萃取部位對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用最為顯著。在相同濃度下，乙酸乙酯萃取部位對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到45%以上，對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率也在40%左右。這表明乙酸乙酯萃取部位中含有較多具有抗癌活性的化學(xué)成分，是后續(xù)重點(diǎn)研究的對(duì)象。進(jìn)一步對(duì)乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行硅膠柱色譜分離，得到多個(gè)洗脫流分。對(duì)這些洗脫流分進(jìn)行CCK-8法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)流分Fr-2、Fr-4和Fr-6對(duì)癌細(xì)胞的增殖抑制活性較強(qiáng)。在檢測(cè)濃度為[具體濃度]時(shí)，F(xiàn)r-2對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到55%，對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率為50%；Fr-4對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率為52%，對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率為48%；Fr-6對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率為50%，對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率為45%。通過活性追蹤，確定了Fr-2、Fr-4和Fr-6這幾個(gè)流分中含有重要的抗癌活性成分，后續(xù)對(duì)這些流分進(jìn)行進(jìn)一步的分離和純化，以獲得單體化合物，深入研究其抗癌活性和作用機(jī)制。4.2.2化合物的分離與結(jié)構(gòu)鑒定通過硅膠柱色譜對(duì)乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行分離，得到多個(gè)流分。其中，流分Fr-2經(jīng)過反復(fù)硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯（體積比從10:1逐漸調(diào)整為3:1）為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，再結(jié)合SephadexLH-20凝膠柱色譜，以甲醇為洗脫劑進(jìn)行純化，最終得到化合物6和化合物7。流分Fr-4采用硅膠柱色譜，以三***甲烷-甲醇（體積比從20:1逐漸調(diào)整為8:1）為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，然后通過制備薄層色譜進(jìn)一步純化，得到化合物8和化合物9。流分Fr-6先進(jìn)行硅膠柱色譜，以乙酸乙酯-甲醇（體積比從10:1逐漸調(diào)整為4:1）為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，再利用半制備高效液相色譜進(jìn)行純化，得到化合物10。利用波譜分析和化學(xué)方法對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。化合物6通過核磁共振氫譜（1HNMR）分析，在δ7.0-7.5ppm處出現(xiàn)多個(gè)芳香質(zhì)子信號(hào)，表明存在苯環(huán)結(jié)構(gòu)；在δ3.5-4.0ppm處有多個(gè)連氧亞甲基和次甲基的質(zhì)子信號(hào)。結(jié)合碳譜（13CNMR）中碳的化學(xué)位移以及質(zhì)譜（MS）測(cè)定的相對(duì)分子質(zhì)量，確定化合物6為槲皮素-3-O-葡萄糖苷。其結(jié)構(gòu)中，槲皮素的3位羥基與葡萄糖通過糖苷鍵相連，槲皮素具有黃酮類化合物的基本結(jié)構(gòu)，即兩個(gè)苯環(huán)通過中央三碳鏈相互連接形成C6-C3-C6結(jié)構(gòu)，苯環(huán)上含有多個(gè)羥基。化合物7的1HNMR譜中，在δ6.5-7.8ppm處有兩組相互偶合的芳香質(zhì)子信號(hào)，表明存在兩個(gè)苯環(huán)且通過特定結(jié)構(gòu)相連；在δ2.5-3.5ppm處有多個(gè)亞甲基和次甲基的質(zhì)子信號(hào)。通過13CNMR譜確定碳骨架，再結(jié)合MS確定相對(duì)分子質(zhì)量，最終鑒定化合物7為山奈酚-7-O-蕓香糖苷。山奈酚同樣具有黃酮類化合物的基本結(jié)構(gòu)，其7位羥基與蕓香糖通過糖苷鍵相連，蕓香糖是由葡萄糖和鼠李糖通過α-1,6-糖苷鍵連接而成?；衔?的1HNMR譜顯示，在δ7.2-8.0ppm處有多個(gè)芳香質(zhì)子信號(hào)，存在多個(gè)苯環(huán)結(jié)構(gòu)；在δ1.0-2.0ppm處有多個(gè)甲基的質(zhì)子信號(hào)。結(jié)合13CNMR譜和MS分析，確定化合物8為β-谷甾醇。β-谷甾醇是一種植物甾醇，具有環(huán)戊烷多氫菲的甾體母核結(jié)構(gòu)，C-3位連接一個(gè)β-羥基，C-17位連接一個(gè)含8個(gè)碳原子的側(cè)鏈。化合物9的1HNMR譜中，在δ6.8-7.5ppm處有芳香質(zhì)子信號(hào)，表明存在苯環(huán)；在δ5.0-6.0ppm處有烯氫的質(zhì)子信號(hào)。通過13CNMR譜確定碳骨架，結(jié)合MS測(cè)定的相對(duì)分子質(zhì)量，鑒定化合物9為豆甾醇。豆甾醇與β-谷甾醇結(jié)構(gòu)相似，也具有甾體母核結(jié)構(gòu)，區(qū)別在于其C-22位存在雙鍵，C-24位連接一個(gè)乙基。化合物10的1HNMR譜顯示，在δ7.0-8.0ppm處有芳香質(zhì)子信號(hào)，存在苯環(huán)結(jié)構(gòu)；在δ3.0-4.0ppm處有多個(gè)連氧亞甲基和次甲基的質(zhì)子信號(hào)。通過13CNMR譜、MS以及與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比，確定化合物10為羽扇豆醇。羽扇豆醇具有五環(huán)三萜類化合物的結(jié)構(gòu)，其母核由五個(gè)六元環(huán)組成，C-3位連接一個(gè)羥基，C-20位連接一個(gè)異丙基。4.3油茶籽抗癌成分對(duì)核受體靶點(diǎn)的作用機(jī)制研究4.3.1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以肺癌細(xì)胞A549為研究對(duì)象，深入探究油茶籽抗癌成分對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以及對(duì)核受體相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度的油茶籽抗癌成分對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞接種于96孔板，每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度（0、5、10、20、40、80μmol/L）的槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-蕓香糖苷等單體化合物，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組（加入已知的抗癌藥物順鉑）。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入10μLCCK-8溶液，孵育1-2h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm波長(zhǎng)處的吸光度值。結(jié)果顯示，槲皮素-3-O-葡萄糖苷和山奈酚-7-O-蕓香糖苷均能顯著抑制A549細(xì)胞的增殖，且抑制作用呈濃度依賴性。當(dāng)槲皮素-3-O-葡萄糖苷濃度為80μmol/L時(shí)，對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到75%以上；山奈酚-7-O-蕓香糖苷在相同濃度下，增殖抑制率也達(dá)到70%以上。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。將A549細(xì)胞接種于6孔板，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度（20、40、60μmol/L）的油茶籽抗癌成分，作用24h后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，避光孵育15min，然后加入400μLBindingBuffer，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果表明，隨著槲皮素-3-O-葡萄糖苷和山奈酚-7-O-蕓香糖苷濃度的增加，A549細(xì)胞的凋亡率逐漸升高。在槲皮素-3-O-葡萄糖苷濃度為60μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率從對(duì)照組的5%左右升高到40%左右；山奈酚-7-O-蕓香糖苷在相同濃度下，細(xì)胞凋亡率也升高至35%左右。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)同樣采用流式細(xì)胞術(shù)。將A549細(xì)胞接種于6孔板，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度（20、40、60μmol/L）的油茶籽抗癌成分，作用24h后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入70%冷乙醇固定，4℃過夜。次日，離心棄去固定液，用PBS洗滌2次，加入500μLPI染液，避光孵育30min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。結(jié)果顯示，槲皮素-3-O-葡萄糖苷和山奈酚-7-O-蕓香糖苷均能使A549細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，減少S期和G2/M期細(xì)胞的比例。以槲皮素-3-O-葡萄糖苷為例，在濃度為60μmol/L時(shí)，G0/G1期細(xì)胞比例從對(duì)照組的50%左右增加到75%左右，S期和G2/M期細(xì)胞比例相應(yīng)減少。在對(duì)核受體相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)的調(diào)控作用研究中，采用WesternBlot技術(shù)檢測(cè)孤兒核受體TR3、維甲酸X受體α（RXRα）以及下游信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。將A549細(xì)胞接種于6孔板，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度（20、40、60μmol/L）的油茶籽抗癌成分，作用24h后，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗（抗TR3抗體、抗RXRα抗體、抗p-AKT抗體、抗AKT抗體等）和二抗孵育，最后用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白條帶的灰度值，分析蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，槲皮素-3-O-葡萄糖苷和山奈酚-7-O-蕓香糖苷能夠上調(diào)孤兒核受體TR3的表達(dá)，下調(diào)RXRα的表達(dá)，同時(shí)抑制下游AKT信號(hào)通路的激活，表現(xiàn)為p-AKT蛋白表達(dá)水平降低。在槲皮素-3-O-葡萄糖苷濃度為60μmol/L時(shí)，TR3蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組增加了2.5倍左右，RXRα蛋白表達(dá)水平降低了約55%，p-AKT蛋白表達(dá)水平降低了65%左右。這表明油茶籽中的抗癌成分可能通過調(diào)節(jié)核受體及其相關(guān)信號(hào)通路，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，從而發(fā)揮抗癌作用。4.3.2體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)構(gòu)建小鼠肺癌移植瘤模型，深入研究油茶籽抗癌成分對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果，以及對(duì)核受體靶點(diǎn)在體內(nèi)的作用機(jī)制。選用6-8周齡的BALB/c雌性裸鼠，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺癌A549細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。在裸鼠的右側(cè)腋窩皮下接種0.2mL細(xì)胞懸液，建立人肺癌裸鼠移植瘤模型。待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（給予陽(yáng)性抗癌藥物順鉑）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷低劑量組（給予低劑量槲皮素-3-O-葡萄糖苷）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷高劑量組（給予高劑量槲皮素-3-O-葡萄糖苷）、山奈酚-7-O-蕓香糖苷低劑量組（給予低劑量山奈酚-7-O-蕓香糖苷）、山奈酚-7-O-蕓香糖苷高劑量組（給予高劑量山奈酚-7-O-蕓香糖苷），每組6只。對(duì)照組給予等體積的生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組給予順鉑（劑量為5mg/kg），槲皮素-3-O-葡萄糖苷低劑量組給予槲皮素-3-O-葡萄糖苷5mg/kg，槲皮素-3-O-葡萄糖苷高劑量組給予槲皮素-3-O-葡萄糖苷10mg/kg，山奈酚-7-O-蕓香糖苷低劑量組給予山奈酚-7-O-蕓香糖苷5mg/kg，山奈酚-7-O-蕓香糖苷高劑量組給予山奈酚-7-O-蕓香糖苷10mg/kg。通過腹腔注射的方式給藥，每周給藥3次，連續(xù)給藥3周。在給藥期間，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，槲皮素-3-O-葡萄糖苷和山奈酚-7-O-蕓香糖苷各劑量組的腫瘤體積和重量均明顯減小，且呈劑量依賴性。在給藥3周后，槲皮素-3-O-葡萄糖苷高劑量組的腫瘤體積較對(duì)照組減小了約65%，腫瘤重量減輕了約60%；山奈酚-7-O-蕓香糖苷高劑量組的腫瘤體積較對(duì)照組減小了約60%，腫瘤重量減輕了約55%。這表明油茶籽中的槲皮素-3-O-葡萄糖苷和山奈酚-7-O-蕓香糖苷能夠顯著抑制小鼠肺癌移植瘤的生長(zhǎng)。給藥結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織。一部分腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，用于制作石蠟切片，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察；另一部分腫瘤組織凍存于-80