相對定量實驗方法與數(shù)據(jù)分析---△△CT法為例內(nèi)

容1.相對定量實驗所需材料2.熒光定量PCR的實驗過程2.1.引物/探針設(shè)計2.2.核酸制備2.3.試劑配制2.4.PCR循環(huán)設(shè)計2.5.樣品孔設(shè)計3.數(shù)據(jù)分析1.相對定量實驗所需材料總RNA提取試劑cDNA合成試劑盒SYBRGreenReal-Time

PCR

PremixKit（染料法）或TaqMan

Real-Time

PCR

Premix

Kit

（探針法）用于相對定量實驗的引物/探針(可選，用于TaqMan體系）應(yīng)用于熒光定量PCR實驗的8聯(lián)排管或96/384孔板和應(yīng)用于熒光定量PCR實驗的8聯(lián)排管蓋或光學(xué)封口模（根據(jù)廠家的儀器不同，相應(yīng)配套耗材也不同）熒光定量PCR儀離心機和離心管DEPC

water和PCRwater移液槍、槍頭、無菌手套振蕩混勻儀2.相對定量的實驗過程設(shè)計：

1.相對定量實驗的引物及探針設(shè)計、合成2.確定相對定量PCR實驗應(yīng)用的試劑3.PCR循環(huán)設(shè)計操作：1.相對定量實驗樣本的制備（RNA和DNA)2.試劑混合3.儀器軟件設(shè)置和運行數(shù)據(jù)分析2.1.應(yīng)用于相對定量實驗的引物和探針設(shè)計相對定量的數(shù)學(xué)方法△△Ct法基于相同條件下，目的基因的擴增效率與內(nèi)參基因的擴增效率相同的假設(shè)，所以引物設(shè)計就成為實驗的關(guān)鍵如果使用TaqMan探針，那么TaqMan探針的結(jié)合位置應(yīng)盡量靠近引物的結(jié)合位置，

最好僅相差一個堿基。TaqMan探針的分析方法依賴于Taq酶的5’-3’外切酶活性。引物設(shè)計要點引物長度和序列：引物長度一般為18-30base之間，在緊靠引物3’端的5個堿基中不能出現(xiàn)2個或2個以上的G或C序列，這樣會增加非特異性擴增的可能性。上下游引物避免出現(xiàn)連續(xù)的互補序列，防止引物二聚體的形成擴增產(chǎn)物長度：擴增產(chǎn)物長度最好控制在50-150bp之間，因為擴增較小的片斷，PCR效率高。如果擴增產(chǎn)品不能減少到150bp以內(nèi)，但可以保證PCR效率接近100%的引物也可以使用。G/C含量：G/C含量可以在30%

～

80%之間，不要出現(xiàn)連續(xù)4個相連的G.如果引物序列中的G/C含量過高會降低PCR效率，也可能會增加非特異性擴增的可能性。在使用SYBRGreen法的相對定量實驗時更應(yīng)注意引物序列中的G/C含量Tm值：引物的Tm值是關(guān)系到PCR循環(huán)設(shè)計的參數(shù)，引物的Tm一般設(shè)計在58～60℃，上下游引物的Tm不要相差2℃以上。探針的Tm值高于引物的Tm值5

～

10℃左右探針序列：在探針的5’端結(jié)尾堿基不能是G，因為如果G存在，探針即使在水解后的熒光也依然會被粹滅，影響結(jié)果分析備注：如果您的設(shè)計經(jīng)驗不足，BIONEER可以提供TaqMan的設(shè)計合成服務(wù)2.2.相對定量的樣本制備RNA制備：提取總RNA，用于相對定量的RNA的純度要達(dá)到A260/A280＞1.8。對于從特殊樣本中提取的總RNA要保證提取后的RNA中不含PCR酶抑制劑。cDNA合成：使用逆轉(zhuǎn)錄酶或逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，生成的cDNA可以直接用于擴增.合成的cDNA為避免反復(fù)凍融，合成后應(yīng)立即分裝以供多次使用。RNA制備和cDNA合成過程的注意事項：RT實驗用的器材（包括1ml、200μl、20μl

Tip頭；EP管和PCR反應(yīng)管等）：用0.1%的DEPC水（1000ml超純水加1mlDEPC）37℃浸泡過夜，高壓滅菌。提取的RNA溶解和cDNA合成均要使用DEPC水合成cDNA時，RNA的用量和cDNA的產(chǎn)量與廠家提供的試劑盒有關(guān)，請參照試劑生產(chǎn)廠家的說明書操作2.3.試劑選擇有兩類預(yù)混合試劑盒可供選擇：SYBR

Green

Real-Time

PCR

PreMix:

應(yīng)用于基于SYBRGreen方法的相對定量分析。要配合使用熔解曲線軟件分析，確定是否存在引物二聚體和非特異性擴增。如果引物設(shè)計合理，無引物二聚體和非特異性擴增產(chǎn)生，那么使用SYBR

Green是經(jīng)濟(jì)實用的最佳選擇TaqManReal-Time

PCR

PreMix；應(yīng)用于基于TaqMan技術(shù)的相對定量分析，結(jié)果無需使用熔解曲線分析。如果無法解決引物二聚體和非特異性擴增的問題，那么可以使用TaqMan探針來代替SYBR

Green法，因為在TaqMan探針的定量PCR體系中，引物二聚體和非特異擴增不會產(chǎn)生熒光信號，所以即使存在引物二聚體或非特異性擴增也不會影響結(jié)果分析BIONEER相關(guān)產(chǎn)品：GreenStar

Real-Time

PCR

Premix(SYBRGreen),

Dual-Star

Real-Time

PCR

Premix(TaqMan探針)，獨特的凍干粉狀Real-Time

PCR

Premix，有效避免分裝時的加樣誤差。-20℃條件下可達(dá)到12個月的保存期，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過液態(tài)Real-Time

PCR

Premix

3個月的有效期。自制熒光定量PCR試劑體系：常規(guī)PCR體系SYBRGreen或TaqMan探針備注：Real-Time實驗中通常使用熱啟動酶以降低引物二聚體和非特異性擴增出現(xiàn)的可能性，SYBRGreen對PCR反應(yīng)有抑制作用，加入量要進(jìn)行優(yōu)化混合試劑混合：試劑按照體積大小從大往小的加，將引物/探針（TaqMan方法選用），Real-Time

PCRPremix和PCRwater加入到反應(yīng)管中，cDNA模板最后加。如果是同種引物/探針有多管的話只是DNA不同，那么采取的方法是算出總體積后加在一個管子里面，混合均勻之后再分裝到各個管子里去，這樣可以有效地避免誤差及污染操作注意事項1.2.3.4.樣本制備區(qū)和加樣區(qū)要同擴增區(qū)分開，避免污染。定量PCR是非常靈敏的實驗，微量污染也會被擴增出，影響結(jié)果分析加樣操作要做到非常精確，微量的加樣誤差也會對實驗的重復(fù)性造成非常大的影響

PCR預(yù)混合液如果需要多次使用，要避光分裝保存。避免反復(fù)凍融和熒光染料見光降解每次使用PCR預(yù)混合液時要等融化后完全混勻，否則對PCR效率造成很大影響試劑50μL體系20μL體系終濃度Forward

Primer1-2μl1-2μl0.3μM-1.0μMReverse

Primer1-2μl1-2μl0.3μM-1.0μMcDNA模板5-10μl2-4μl＜500ngDEPC

water適量適量總體積50μL20μL備注：大多數(shù)情況下，引物終濃度在0.5μM是合適濃度。如果擴增效率不高，可提高引物的濃度。如果發(fā)生非特異性擴增反應(yīng)時，應(yīng)降低引物濃度。引物種濃度請在

0.3μM-1.0μM進(jìn)行優(yōu)化初次實驗時，最好將DNA模板進(jìn)行梯度稀釋，以內(nèi)參基因的Ct值在15-25之間為合適的濃度。定量PCR反應(yīng)體系的配備與各試劑廠家提供的試劑而不同，使用其他廠家的試劑時，請參照相關(guān)廠家的操作說明書配置典型的PCR反應(yīng)體系以BIONEER

GreenStar

qPCR PreMix為例步驟溫度時間預(yù)變性95℃1-10min循環(huán)中的變性95℃20s退火50-60℃30s延伸68-72℃30s兩步法PCR循環(huán)設(shè)計步驟溫度時間預(yù)變性95℃1-10min循環(huán)中的變性95℃20s退火/延伸60℃30s備注：變性時間長短由DNA來源和GC含量決定，退火的溫度由引物的Tm值決定，一般設(shè)為低于引物Tm值5

℃。延伸的時間由擴增產(chǎn)物的片斷大小所決

定。PCR循環(huán)中各步條件都可以通過優(yōu)化達(dá)到最佳。如果擴增產(chǎn)物片斷長度在300bp以內(nèi)。也可以采用二步法PCR進(jìn)行實驗，即退火和延伸合為一步，溫度可在60-65℃之間選擇2.4.PCR循環(huán)設(shè)計三步法PCR循環(huán)設(shè)計2.5.反應(yīng)板設(shè)計設(shè)置樣品孔時的關(guān)鍵要素（以BIONEER

Exicyler熒光定量PCR儀為例）：探針（Probe):用來檢測目的基因和內(nèi)參基因的報告基團(tuán)。未知樣品（Unknown

Sample):

要進(jìn)行定量的未知目的基因樣品和內(nèi)參基因樣品陽性對照（Positive

Control）：無需設(shè)置專門的陽性對照，以內(nèi)參基因代替無模板對照（NTC)：具備其他所有試劑，為加入DNA模板樣品名稱（Sample

Name):

定義樣品的不同來源設(shè)置樣品孔時的注意事項：要分別設(shè)置為不同的探針名稱和不同探針顏色進(jìn)行區(qū)分設(shè)置無模板對照監(jiān)控污染同一樣品至少做2個復(fù)孔以獲得一致的重復(fù)性結(jié)果，相對應(yīng)的內(nèi)參基因樣品也要做 同樣數(shù)量的重復(fù)孔在軟件設(shè)置中，所有的樣品孔設(shè)置“Unknown

Sample”,無模板對照設(shè)置為“NTC”備注：樣品孔和對照孔的信息設(shè)置一定要正確設(shè)置，符合△△CT分析方法的格式。否則會導(dǎo)致實驗結(jié)果不能用相對定量的軟件進(jìn)行自動分析Sample

NameProbe

Name應(yīng)用舉例：反應(yīng)板設(shè)置樣板樣品孔信息3.數(shù)據(jù)分析雙擊鼠標(biāo)打開“ExicyclerAnalysis”程序在彈出的對話框中選擇“RelativeQuantification”,選擇“Ok”擴增效率分析：通過觀察熒光曲線是否是典型的“S”型曲線，可以判斷擴增效率Flu.Graph中分析原始熒光曲線大部分情況下，可以使用自動生成的域值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?在“probe”匡中選擇一種探針，然后將

“Threshod”和“baseline”匡中的

“auto”改為”manual”,調(diào)整基線的起點和終點基線起點：進(jìn)口試劑起點設(shè)為3，國產(chǎn)試劑起點設(shè)為6基線終點：如果最小的Ct值大于

18，那么終點設(shè)為15。如果大于18，基線終點設(shè)為Ct－3如果數(shù)據(jù)質(zhì)量不佳，如曲線形狀不正常或重復(fù)性不佳，可以嘗試進(jìn)行基線調(diào)整，重新生成域值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析Flu.Graph在中調(diào)整基線在Report

Form中分析數(shù)據(jù)質(zhì)量重復(fù)性分析重復(fù)樣本Ct值差異＜0.5，數(shù)據(jù)為有效數(shù)據(jù)如果Ct值差異＞0.5，刪除變異大的數(shù)據(jù)重新分析選擇參照：選擇某種樣本作為參照樣本進(jìn)行分

析，被選擇的樣本相對表達(dá)量為1在Results

Plot使用相對定量自動分析功能--基于△△CT分析方法相對定量分析：選擇參照樣品后，軟件自動給出分析結(jié)果并繪制出柱狀圖