第三章綜合實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目

實(shí)驗(yàn)一中藥化學(xué)成份的系統(tǒng)預(yù)試驗(yàn)操作

在研究一未知樣品時(shí)，多采用中藥化學(xué)成分的系統(tǒng)預(yù)實(shí)驗(yàn)。先根據(jù)各化學(xué)成

分的溶解性不同，選用適當(dāng)?shù)娜軇?，極性梯變，順次將各類溶解性相近的成分提

出。例如：石油隧、汽油、苯可溶解油脂、揮發(fā)油、植物苗醇、某些生物堿、親

脂性強(qiáng)的香豆素等親脂性化合物；乙雄可提取出樹(shù)脂、內(nèi)酯、黃酮等化合物；氯

仿可提取有利生物堿；丙洞、乙醇、甲醇則可提取出一些生物堿及其鹽，有機(jī)酸

及其鹽、甘類、糅制、無(wú)機(jī)鹽類等化合物。通過(guò)制備預(yù)實(shí)驗(yàn)的溶液，可減少各成

分間的相互影響，提高預(yù)試的效果。一般工作中常根據(jù)水能提取極性物質(zhì)，石油

暇可提取非極性物質(zhì)，醇能提取大多數(shù)成分等特點(diǎn)，采用石油隧、95%乙醇和水

為溶劑對(duì)樣品進(jìn)行分別提取。

預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果僅能作為進(jìn)一步提取分離有效成分的初步線索。由于植物中各

成分的復(fù)雜性和相互干擾，各定性反應(yīng)常有例外，例如：碘化強(qiáng)鉀試劑，不僅對(duì)

生物堿發(fā)生反應(yīng)，對(duì)堿性氨基，生物胺等同樣也發(fā)生反應(yīng)。生物堿沉淀反應(yīng)作為

預(yù)實(shí)驗(yàn)陰性結(jié)果可做出無(wú)生物堿存在的結(jié)論，陽(yáng)性結(jié)果實(shí)際意義不大，須進(jìn)一步

配合其他反應(yīng)或配合TLC及PC進(jìn)行。因此，決不能只跟據(jù)預(yù)試結(jié)果武斷作出

某種成分存在與否的結(jié)論、為進(jìn)一步了解所含成分單體的個(gè)數(shù)和情況可配合TLC

和PC。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握中藥成分的預(yù)試驗(yàn)方法，總結(jié)中藥中各主要化學(xué)類型成分的理化性質(zhì)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

根據(jù)中藥化學(xué)成分溶解度不同進(jìn)行溶劑系統(tǒng)提取分離，達(dá)到分類，再利用各

種沉淀試劑和顯色劑進(jìn)行預(yù)試，并配合TLC及PC,初步判斷和了解各部分中可

能含有的化學(xué)成分。

三、溶劑及試劑

95%乙醇150mL石油髓150ml,1%HC130mL氯仿40ml,氨水適量。

四、實(shí)驗(yàn)操作

（一）與實(shí)驗(yàn)溶液的制備

1.水提取液

樣品粉末10g（過(guò)20目篩）

10倍量水，室溫浸泡過(guò)夜

過(guò)濾（濾取一半量）

濾液（檢液A）部分浸液及藥渣

60*2水浴加熱1Omin-1h

過(guò)濾

濾液（檢液B）濾渣

此濾液供糖、多糖、有機(jī)酸、皂昔、昔類、酚類、糅質(zhì)、氨基酸、生物堿等

項(xiàng)的預(yù)試。

2.乙醇提取液

樣品粗粉20g

150ml90-95%乙靜

回流提取45min

乙醉提取液

分成兩份

乙醇液C乙睥液D

回收溶劑至無(wú)醇味

力口1%HC120ml溶解（檢查黃酮、慈醒、酚類、糅質(zhì)、

抽濾甘類、有機(jī)酸、香豆素、赭類、內(nèi)

酸水液酯、隹體化合物、強(qiáng)心昔）

氨太堿化（pH9?10）

氯仿萃?。?0mlx3）

氯仿層

水洗至中性

回收溶劑至干

殘?jiān)?/p>

解“藐容解其余用l%HQ溶解

檢液E檢液F

（供薄層點(diǎn)樣用）（檢查生物堿）

3.石油懶提取液

樣品粗粉1g，加10ml石油酸（60?90℃）放置2?3h,過(guò)濾，濾液放在表

面皿上，讓石油醛揮發(fā)，用殘留物進(jìn)行菇類、的類、脂肪等的檢查。

（二）各類成分檢查

I.生物堿

（I）碘一碘化鉀試劑：取檢液F2ml于試管中若中性要酸化至酸性，滴加

碘一碘化鉀試劑2滴，如有棕紅色沉淀產(chǎn)生，可能含有生物堿。

（2）碘化鈿鉀試劑：試劑同上，也呈酸性，加碘化鈿鉀試劑立即有桔紅色

或黃色沉淀產(chǎn)生，亦可能有生物堿。本反應(yīng)于紙片上進(jìn)行較為敏感。

（3）硅鶴酸試劑：操作同上，如有生物堿，試液與硅鋁酸試劑相遇，即產(chǎn)

生類白色或有淺黃色沉淀.

2.氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)

（1）雙縮胭試驗(yàn)（Biuret反應(yīng)）：取1%硫酸銅溶液與10%氫氧化鈉溶液等

量混合。本試驗(yàn)主要是C；與蛋白質(zhì)或肽類分子中肽鍵一CONH—絡(luò)合顯色。取

1ml檢液A,加入1?3滴40%氫氧化鈉溶液，搖勻，使呈堿性，再逐滴加入

1%硫酸銅溶液，邊加邊搖勻（注意不要過(guò)量），如顯紫、紅或紫紅，表示有多

肽或蛋白質(zhì)。

（2）荀三酮試劑（Ninhydrin試劑）：檢液A點(diǎn)在紙片上，滴上或噴灑0.2%

的三酮乙醇液后，在100℃左右的烘箱中放置2min,如有氨基酸和肽就顯藍(lán)色或

紫紅色斑點(diǎn)，也有少數(shù)氨基酸呈黃色斑點(diǎn)。

亦可在試管中進(jìn)行，水提液1ml,加試劑2?3滴后在沸水浴上加熱5min,

冷后有藍(lán)紫色出現(xiàn)，表明有氨基酸或多肽。

［注］除上述成分外，伯胺也會(huì)顯色。

3.有機(jī)酸

（1）用pH試紙檢查：取檢液D用pH試紙檢查，如呈酸性，則可能含有

游離酸或酚性化合物。

（2）溟酚藍(lán)溶液：取檢液D點(diǎn)于濾紙片上，噴灑0.1%溟酚藍(lán)溶液（溶于

7%乙醇中），立即在藍(lán)色背景上顯黃色斑點(diǎn)，表明可能含有機(jī)酸。如覺(jué)得不明

顯，可再噴灑氨水，然后暴露在鹽酸氣體中，背景逐漸由藍(lán)色變?yōu)辄S色，而有機(jī)

酸斑點(diǎn)仍為藍(lán)色。經(jīng)過(guò)這樣一個(gè)反復(fù)，用pH試紙難以肯定的有機(jī)酸樣品也可檢

出。

4.糅質(zhì)

（1）1%三氯化鐵試驗(yàn)：（樣品溶液如為酸性，即可直接進(jìn)行檢查。如為堿

性，可加酸酸化后再滴加三氯化鐵試劑。）取檢液B1ml,加1%三氯化鐵試劑,

如呈藍(lán)墨綠色或藍(lán)紫色，證明可能含有酚類或棘質(zhì)。可■水解鞅制多為藍(lán)色，縮合

糅制多呈綠色。

（2）明膠實(shí)驗(yàn)：取檢液B2ml,加入氯化鈉-明膠溶液，如產(chǎn)生白色沉淀，

則表明含有鞍質(zhì)。

5.糖、多糖和昔

（1）斐林試劑（Fehling）：斐林試劑為CuSO4與酒石酸鉀鈉試劑臨用前等

體積混合。取檢液B2ml,加入新配制的斐林試劑，在沸水浴上加熱數(shù)分鐘，如

產(chǎn)生紅棕色氧化亞銅沉淀，證明含有還原糖存在。另取熱水提取液，加鹽酸，使

呈酸性，加熱微沸5?lOmin,使產(chǎn)生水解反應(yīng)，冷后，調(diào)節(jié)pH至中性，同上法

加斐林試劑，如熱水提取漫未水解前呈負(fù)反應(yīng)，水解后呈正反應(yīng)，或水解后產(chǎn)生

氧化亞銅沉淀較前為多，表明可能含有多糖、苗類成分。

（2）a-蔡酚試驗(yàn)（Molish反應(yīng)）：取檢液B和D各3mL加熱濃縮，使

溶于0.5ml乙醇中，再加等體積的10%a-蔡酚乙醇液，搖勻，沿試管壁緩緩滴加

濃硫酸，如在二液界面處產(chǎn)生紫紅色環(huán)，證明含有糖類、多糖或甘類。

（3）氨性硝酸銀試劑：0.1N硝酸銀溶液和5N的氨水臨用前等量混合。取

檢液B點(diǎn)于紙上，噴灑上述試劑，在1。?！婕訜??lOmin,還原糖呈褐色。

6.皂玳

（I）泡沫試驗(yàn)：取檢液B3ml于試管內(nèi)，激烈振徭，如產(chǎn)生持續(xù)性泡沫，

就可能含有皂甘、高級(jí)脂肪酸、蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)。皂甘和脂肪酸鹽泡沫特別明顯，

在試管內(nèi)能持續(xù)lOmin以上，即使加熱，加乙醇，泡沫也不明顯地減少。在有皂

背的基礎(chǔ)上，可取二試管取檢液分別滴加5%HC1,5%NaOH振搖，比較泡沫高

度，判斷三菇皂甘與脩體皂昔。

（2）醋SF-濃硫酸試驗(yàn)（Liebermann-Burchard反應(yīng)3取檢液B和D各2ml

置蒸發(fā)皿中，在水浴上小心蒸去溶劑，殘?jiān)芙饣驊腋∮诖佐?.5ml中，滴加1

滴濃硫酸，如呈紫紅色，并且在溶液上層逐漸變綠，證明可能含有皂成。

（3）溶血試驗(yàn)：取松液B2ml,蒸干，使溶于0.9%生理鹽水中，加血球生

理鹽水懸浮液，產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，表明含有皂首。

7.植物俗醇、三菇類

（1）醋酎-濃硫酸試驗(yàn)（Liebermann-Burchard反應(yīng)）：取檢液D2mL操作

方法同前，結(jié)果如果紅紫色，并逐漸變?yōu)槲劬G色，表明含有植物脩醇或三菇類成

分。顏色變化較快這為鉛醇。

（2）氯仿-濃硫酸試驗(yàn)（Sackowski反應(yīng)）：取檢液D2mL在水浴上蒸干，

以氯仿溶解殘?jiān)?，加濃硫酸，如氯仿層顯紅色或青色，流酸層有綠色熒光，則表

明有植物笛醇。

8.黃酮類

（1）鹽酸-鎂粉試驗(yàn)：取檢液D2ml于試管中，加鎂粉少許，再滴入濃鹽酸

數(shù)滴（必要時(shí)在沸水中加熱3min）,如顯櫻紅色，說(shuō)明含有黃酮類化合物。如

乙醇提取液加濃鹽酸而不加鎂粉即出現(xiàn)紅色表明含有花色索。

（2）氨熏試驗(yàn)：將檢液D點(diǎn)于濾紙片上，置氨蒸氣中熏半分鐘，如顯黃色，

置熒光燈下顯黃色熒光，表明有黃酮類化合物。

（3）三氯化鋁試驗(yàn)：將檢液D點(diǎn)于濾紙片上，噴灑1%三氯化鋁乙醇溶液，

干燥后于紫外燈光下如顯明顯之黃色或黃綠色熒光，表明可能有黃酮類化合物存

在。

9.香豆素與菇類內(nèi)酯化合物

（I）熒光試驗(yàn)：將檢液D點(diǎn)于濾紙片上，干燥后，放在紫外燈光下觀察,

如有天藍(lán)色熒光者，可能含有香豆素類。

（2）偶合試驗(yàn)：取檢液D2ml,加入等體積3%碳酸鈉水溶液，于水浴上

煮沸3?5min,冷卻后，加新配制的重氮化試劑，如顯紅色或紫色，表明可能含

有親脂性強(qiáng)的香豆素類。

（3）異羥月虧酸鐵試驗(yàn)：取檢液D2ml,加2?4滴鹽酸羥胺試液和10%氫氧

化鉀甲醇液至呈堿性（pH8?9）,于水浴上加熱至反應(yīng)完全，冷卻，加鹽酸酸

化（pH2?3）,并加入1%三氯化鐵溶液，混勻，如溶液呈紅色或

紫色反應(yīng)，表明含有酯、內(nèi)酯、香豆素類成分。

10.強(qiáng)心忒

（1）堿性3,5-二硝基苯甲酸試驗(yàn)（Kedde反應(yīng)）：取檢液D2mL加入新鮮

配制的堿性3,5-二硝基苯甲酸試劑2?3滴，溶液呈紫紅色，表明可能含有強(qiáng)心

式。此反應(yīng)也可在濾紙片上進(jìn)行。

（2）堿性苦味酸實(shí)驗(yàn)（Balje［反應(yīng)）：取檢液D2ml,加入堿性苦味酸試劑

2?3滴，放置15min左右，溶液呈現(xiàn)橙色或紅色，表明可.能含有強(qiáng)心忒。

（3）亞硝酰鐵氟化鈉試驗(yàn)（Legal反應(yīng)）：取檢液D2ml,在水浴上小心蒸

干，加入1ml叱咤溶解殘?jiān)?，加?.5%亞硝酰鐵氟化鈉水溶液1滴，混勻，再

加入10%氫氧化鈉1?2滴，搖勻，如呈紅色，而后顏色又逐漸消失，表明可能

含有強(qiáng)心忒。

（4）三氯化鐵冰醋酸試驗(yàn)（Keller反應(yīng)）：取檢液D3mL在水浴上蒸干,

冷后，加三氯化鐵冰醋酸試劑，溶解殘?jiān)谝辉嚬苤校毓鼙诘渭訚饬蛩?，于?/p>

液界面處顯棕色環(huán)，上層的冰醋酸呈藍(lán)綠色，表示具有a-脫氧糖的強(qiáng)心甘存在。

11.檢查慈醍類

（1）KOH試驗(yàn)：取檢液D1?2ml,加入10%KOH水溶液3?4滴，如呈

紅色，表明含蔥醍類。

（2）醋酸鎂試驗(yàn)：取檢液D1?2ml,滴加3滴10%醋酸鎂甲醇液，如呈

橙紅至紅色，表明含意醍類。

12.揮發(fā)油和油脂

（1）一般檢查：將石油酸提取液滴于濾紙片上，如紙片上的油斑能在大氣

中自然揮發(fā)，就可能含有揮發(fā)油。如果油斑不消失，可能含有揮發(fā)油、油脂或脂

質(zhì)體。

（2）磷鋁酸試驗(yàn)：將石油髓提取液滴于濾紙片上，噴灑25%磷鴿酸乙醇溶

液后，將紙片放在115?118℃烘箱中2min,對(duì)油脂、三菇及俗醇等呈藍(lán)色，背

景為黃綠色或藏青色。

（三）薄層檢查

1.生物堿（以下條件僅限于本試驗(yàn)）

吸附劑：硅膠G

樣品：檢液E

對(duì)照品：粉防己總生物堿、苦參總堿

展開(kāi)劑：CHC13-MeOH-濃氨水(5:0.6:0.3)

顯色劑：改良碘化鈾鉀試劑。

2.各類成分的層析條件參見(jiàn)教材及相關(guān)文獻(xiàn)。

五、實(shí)驗(yàn)安排

本實(shí)驗(yàn)共分3次完成

第一次：水提液的制等及檢查；

第二次：乙醇提取液(檢液D)的制備及檢查

第三次：檢液E和F的制備，生物堿的檢查

實(shí)驗(yàn)二銀翹散抗流感病毒有效組分研究

銀翹散為清代醫(yī)家吳鞠通根據(jù)《內(nèi)經(jīng)》“風(fēng)淫于內(nèi)，治以辛涼，佐以苦甘；

熱淫于內(nèi)，治以咸寒，佐以甘苦”的理論而創(chuàng)制的名方，臨床應(yīng)用已久，由金銀

花、連翹、牛勞子、甘草、薄荷、荊芥、桔梗、淡豆豉、淡竹葉等9味藥組成。

始見(jiàn)于1788年出版的《溫病條辯》?，F(xiàn)代用于治療流行性感冒、急性扁桃體炎、

咽峽皰疹、麻疹、腮腺炎、乙腦、流腦、大葉性肺炎等疾病的初期階段。現(xiàn)代藥

理實(shí)驗(yàn)表明銀翹散具有良好的抗流感病毒活性。石任兵教授課題組以銀翹散全方

為研究對(duì)象,按傳統(tǒng)用藥方式，結(jié)合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn),綜合運(yùn)用現(xiàn)代分離技術(shù)和方法，

初步闡明了銀翹散抗流感病毒作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，并初步探討了其作用機(jī)理。

一、銀翹散抗流感病毒有效組分群的篩選

取銀翹散原方（金銀花:連翹：牛芳子：甘.草：薄荷：荊芥：桔梗:淡豆豉:淡竹葉

為9:9:9:5:6:6:6:6:4）按傳統(tǒng)用藥方式，以水煎煮，得到水煎液。水煎液經(jīng)過(guò)AB-8

型大孔樹(shù)脂柱處理，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)篩選，以抗甲型、乙型流感病毒為活性評(píng)價(jià)指

標(biāo)，采用雞胚法和CPE法，篩選出了銀翹散抗流感病毒有效組分群（EFY）。

二、銀翹散抗流感病毒有效組分群化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)鑒定

采用多種分離純化方法和結(jié)構(gòu)鑒定手段（如UV、IR、ELMS、ESI-MS、iHNMR、

L'CNMR等波譜學(xué)技術(shù)和化學(xué)方法），對(duì)銀翹散抗流感病毒有效組分群（EFY）中化學(xué)

成分的系統(tǒng)研究，從中分離得到43個(gè)化合物，并對(duì)其中的31個(gè)進(jìn)行了鑒定。1個(gè)

為新化合物，8個(gè)為首次從銀翹散中分得的已知化合物，其余為銀翹散各單味藥

已有報(bào)道的化合物。

1.儀器與試劑

HMK顯微熔點(diǎn)儀（溫度計(jì)未校正）。TU1201型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)和

U2000紫外分光光度計(jì)。NicoletImpact410型紅外分光光度計(jì)，KBr壓片。

JEOL-300型核磁共振儀、VarianGemini-300型核磁共振儀和BrukerAVANC

-EDRX-500超導(dǎo)核磁共振儀。VG-ZAB-HS型質(zhì)譜儀、VG-20-250型質(zhì)譜儀、

Mariner質(zhì)譜儀和APEXIIFT-1CR質(zhì)譜儀。XZ-7旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（中國(guó)科學(xué)院生物

物理所科龍儀器廠）。SHZ-3循環(huán)水真空泵（河南省鞏義市英峪電子儀器廠）。

H66025超聲波清洗儀（無(wú)錫市超聲電子設(shè)備廠）。DS-II電熱三用水箱（北京

市醫(yī)療設(shè)備廠）。WatersDeltaPerp3000制備液相色譜儀,Waters484可調(diào)波

長(zhǎng)紫外檢測(cè)器。Waters745數(shù)據(jù)記錄儀，流動(dòng)相：甲醇-水系統(tǒng)。Gilson制備液相

色譜儀，Gilson306泵,Gilson118紫外/可見(jiàn)檢測(cè)器,Gilson712化學(xué)工作站,

流動(dòng)相：甲醇水系統(tǒng)。薄層層析和柱層析硅膠（青島海洋化工廠出品）。薄層

展開(kāi)系統(tǒng):氯仿-甲醇。S印-hadexLH-20（上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站分裝廠產(chǎn)品）。

AB-8型大孔吸附樹(shù)脂（天津南開(kāi)大學(xué)化工廠出品）。柱層析聚酰胺（上海化學(xué)

試劑公司出品）。聚酰胺6薄膜（浙江四青生化材料廠產(chǎn)品）。展開(kāi)系統(tǒng)：甲

醇一水（4:1）。顯色劑：10%硫酸乙醇溶液；1%三氯化鋁乙醇溶液。所用有機(jī)

溶劑均為分析純。

2.提取分離流程

銀翹散抗流感病毒有效組分群（EFY）經(jīng)AB-8型大孔吸附樹(shù)脂處理，水-乙

醇梯度洗脫，分別得到30%、50%、70%和95%乙醇部分。各部分分別經(jīng)聚酰胺

柱層析，水-乙醇梯度洗脫，聚酰胺薄膜檢測(cè)，合并相同組分.合并后的組分再行

反復(fù)硅膠柱層析，氯仿-甲醇梯度洗脫；SephadexLH-20柱層析，甲醇-水不同比

例洗脫；硅膠薄層制備，氯仿-甲醇系統(tǒng)展開(kāi)；HPLC制備，甲醇-水系統(tǒng)作為流動(dòng)

相。最后從95%乙醇部分中得到4個(gè)單體化合物;從70%乙醇部分得到5個(gè)單體

化合物；從50%乙醇部分得到18個(gè)單體化合物;從30%乙醇部分得到16個(gè)單體化合

物。具體分離流程如下:

EFY（30（）g）

AB-8大孔吸附樹(shù)脂

水-乙醇梯度洗脫

30%乙醉部分50%乙醇部分70%乙醉部分95%乙醉部分

（72g）（93g）（12g）（6g）

反復(fù)柱層析，反復(fù)柱層析，反復(fù)柱層析，

硅膠薄層制備,硅膠薄層制備,硅膠薄層制備,反復(fù)柱層析

HPLC制備HPLC制備HPLC制備

16個(gè)化合物18個(gè)化合物5個(gè)化合物4個(gè)化合物

3.銀翹散抗流感病毒有效組分群化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)鑒定

通過(guò)對(duì)銀翹散抗流感病毒有效組分群(EFY)中化學(xué)成分的系統(tǒng)研究，從中

分離得到43個(gè)化合物，經(jīng)理化常數(shù)測(cè)定及光譜解析，鑒定出其中的31個(gè)化合物，

其中黃酮類17個(gè)、木脂素類3個(gè)、酚酸類5個(gè)和三菇類4個(gè)，其它2個(gè)?，F(xiàn)以30%乙

醇部分分得的化合物A為例說(shuō)明結(jié)構(gòu)鑒定的一般過(guò)程。

人為黃色結(jié)晶性粉末，mp219222℃,MgHC1反應(yīng)及Molish反應(yīng)均呈陽(yáng)

性，酸水解檢出半乳糖，示為黃酮甘類化合物。FAB-MS給出準(zhǔn)分子離子峰

m/z465(M+1)和碎片峰m/z303(M-Gal+I),結(jié)合內(nèi)和^CNMR數(shù)據(jù)推斷

分子式C21H據(jù)此計(jì)算不飽和度為12,推知A可能為單半乳糖甘。

IR光譜(KBr)cm4：3240(OH),1650(a,(3-不飽和C=O),1600,1550,

1496(苯環(huán))。

'HNMR(DMSO-d6)：8：12.60(1H,s),10.81(1H,s),9.67(1H,s),

9.10(1H,s)為四個(gè)酚羥基質(zhì)子信號(hào)，其中312.60位5位羥基質(zhì)子信號(hào)，因其

與C=O形成氫鍵而大幅度移向低場(chǎng)。3：7.65(1H,dd,J=8.4,2.4Hz),7.51(1H,

d,J=2.4Hz),6.8O(1H,d,J=8.4Hz)三組峰為苯環(huán)上的3個(gè)氫信號(hào),判斷其

組成了1個(gè)ABX系統(tǒng)，提示分子結(jié)構(gòu)中有三取代的苯環(huán)存在，是典型3',4'-

二氧取代黃酮類化合物B環(huán)上的2',6'-H和5'-H質(zhì)子信號(hào)。8：6.39(1H,d,

J=2.1Hz),6.19(IH,d,J=2.1Hz)峰為苯環(huán)上的2個(gè)間位偶合的氫信號(hào),可歸屬

于昔元A環(huán)的8?H和6-H,示A環(huán)為5,7-二氧取代。6：5.36(1H,d,J=7.5Hz)

為糖的端基質(zhì)子信號(hào)，根據(jù)其偶合常數(shù)可知糖計(jì)鍵為。構(gòu)型。

,3CNMR(DMSO-C16)5：177.8(04麒基)，3：156.7(02),133.9(C-3),為

典型的黃酮醇類骨架類型。同時(shí)也可觀察到糖的一組碳信號(hào)，6：102.2為糖端基

碳信號(hào)，6：75.9,73.3,71.4,68.1,60.3是糖上其它碳信號(hào)，經(jīng)與糖標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)

對(duì)照，確定為B-D-半乳糖，

結(jié)合'HNMRfll,3CNMR數(shù)據(jù)，推斷該化合物甘元為梅皮素。A的首元部分

與文獻(xiàn)相比“CNMR3：C-2,C-3信號(hào)分別位移了+10和-2,說(shuō)明C-3位取代成

昔。

綜合上述各種結(jié)果，鑒定A為梅皮素-3-0邛-D-半乳糖昔即金絲桃音(hyperosid),

其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1,全部碳?xì)湫盘?hào)歸屬見(jiàn)表1。

表1化合物A的】HNMR和QcNMR數(shù)據(jù)

No.SC3HNo.6C3H

2156.7P121.4

3133.92,115.57.51(1H,d,J=2.4Hz)

4177.83，144.8

5161.14'148.5

698.66.39(1H,d,J=2.1Hz)5'116.37.51(IH,d,J=2.4Hz)

7164.26，122.17.65(1H,dd,J=8.4,2.4Hz)

893.96.39(1H,d,J=2.1Hz)1〃102.25.36(1H,d,J=7.5Hz)

9156.62"71.4]

1()104.23"73.33.l-3.7(10H,m,糖上其余6個(gè)

C5-OH12.60(1H,s)4"68.1＞質(zhì)子和4個(gè)-OH質(zhì)子）

C7-OH10.81(1H,s)5"75.9

C3"-OH9.67(1H,s)6"60.3J

C4,-OH9.10(1H,s)

三、單體化合物抗流感病毒活性測(cè)定

對(duì)所得部分化合物按EFY活性篩選方法進(jìn)行了抗流感病毒活性測(cè)定。結(jié)果表

明，所試的化合物中，大部分由于細(xì)胞毒性較大難以測(cè)定其活性，只有兩個(gè)化合

物顯示出較好的抗流感病毒活性，且毒性較低，但兩者的抗流感病毒活性均不及

EFY.由此也可以看出，中藥復(fù)方的藥效不僅僅依賴于某一個(gè)或幾個(gè)單體成分的

作用，而應(yīng)是整體協(xié)同作用的結(jié)果。

四、銀翹散抗流感病毒有效組分群質(zhì)量控制研究

銀翹散組方中各單味藥的化學(xué)成分研究表明，其主要含有黃酮類、木脂素類、

三菇類、揮發(fā)油類等，從銀翹散抗流感病毒有效組分群(EFY)化學(xué)成分的分離

鑒定中也發(fā)現(xiàn)了大量的黃酮類和木脂素類成分。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黃酮類和木

脂素類具有良好的抗流感病毒活性，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)EFY經(jīng)聚酰胺處理

時(shí)，水洗部分與醇洗部分均顯示抗流感病毒活性，但作用不及EFY。結(jié)合上述實(shí)

驗(yàn)結(jié)果，可以確定在銀翹散抗流感病毒有效組分群中如此高含量的黃酮類和木脂

素類成分就是其抗流感病毒的有效成分。為了更好的控制EFY的質(zhì)量，我們采用

總成分和單體化合物共同測(cè)定作為質(zhì)量控制的定量指標(biāo)即采用比色法、紫外分光

光度法及反相高效液相色譜法分別對(duì)EFY中的主要成分類別總黃酮和總木脂素

以及主要指標(biāo)性成分醉魚草甘、異甘草素和牛勞子營(yíng)進(jìn)行定量研究。現(xiàn)以HPLC

測(cè)定EFY中牛芳子甘含量為例說(shuō)明定量分析的一般方法。

1.儀器與試藥

Waters515高效液相色譜泵，Waters2487DualXAbsorbance檢測(cè)器，Millen

-nium32ChromatographyManager化學(xué)工作站；H66025型超聲清洗機(jī).

牛一子昔(arctiin)龍照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所)。銀翹散抗流

感病毒有效組分群(EFY)。乙睛、甲醇為色譜純，水為重蒸儲(chǔ)水。

2.對(duì)照品溶液制備

對(duì)照品溶液的配制精密稱取牛勞子背對(duì)照品8.8mg,置于100ml容量瓶中，

用甲醇完全溶解并稀釋至刻度，配制成0.088mg/ml的對(duì)照品溶液。

3.樣品溶液的制備

精密稱取EFY樣品約lO.Omg,置于10ml容量瓶中，加適量50%乙睛溶液超

聲使其完全溶解后加50%乙精溶液定容至刻度。經(jīng)0.45pm微孔濾膜過(guò)濾，即得

樣品溶液。

4.色譜條件

色譜柱:YWG-C18柱(250mmx4.6mm,10pm)；沅動(dòng)相：乙睛-水系統(tǒng)(25:7

5)；流速：l.Oml/min；柱溫:室溫；紫外檢測(cè)器：0.08AUFS,檢測(cè)波長(zhǎng)278nm。

5.方法與結(jié)果

5.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取牛勞子背對(duì)照品適量，用甲醇溶解并稀釋，以甲醇為空白，在200-400nm

掃描，證明牛勞子存在278nm處有較強(qiáng)的吸收。因此，選定278nm為測(cè)定的紫外

檢測(cè)波長(zhǎng)。牛勞子甘甲醇液紫外光譜圖見(jiàn)圖2。

圖2牛芳子昔甲醇液紫外光譜圖

5.2流動(dòng)相的選擇

選用C18柱，用不同比例的乙月青-水系統(tǒng)為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)乙睛-水系統(tǒng)在(25:75)

時(shí)分離效果較好，其保留時(shí)間適中，分離度亦符合要求。因此選定乙睛-水(25:75)

為流動(dòng)相。樣品與對(duì)照品HPLC色譜圖見(jiàn)圖3。

in

圖3牛落子昔對(duì)照品(I)、樣品EFY(II)及陰性樣品(HI)HPLC色譜圖

1牛將子昔

5.3空白試驗(yàn)

取按處方比例及工藝制得不含牛勞子(牛勞子甘)的陰性樣品，按“樣品溶液

的制備“項(xiàng)下配制陰性樣品溶液，進(jìn)樣10位，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖3。表明處方

中的其它成分不干擾牛勞子甘的測(cè)定。

5.4系統(tǒng)適用性試驗(yàn)