ICS13.160.20

CCSX04

34

安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB34/T4878—2024

包裝飲用水中銅綠假單胞菌快速檢測(cè)

膠體金免疫層析法

RapiddetectionofPseudomonasaeruginosainpackageddrinkingwater

—Colloidalgoldimmunochromatographicassay

2024-07-30發(fā)布2024-08-30實(shí)施

安徽省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

.

DB34/T4878—2024

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起

草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由安徽省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院提出。

本文件由安徽省市場(chǎng)監(jiān)督管理局歸口。

本文件起草單位：安徽省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院、安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院、安徽藍(lán)藍(lán)礦泉水

有限公司。

本文件主要起草人：陳趙然、姚幫本、郭佳佳、吳基杰、鄭健、陳偉、閆超、劉玉軍、童寧、朱雙

四、徐建國(guó)、葉應(yīng)旺、張居舟、程瀟、郭佳、孟憲卓、周裔彬、祝紅蕾、張靜、姜采妮、候永成、陳方

圓、徐麗娜、章穎、謝晶、郭婷。

I

DB34/T4878—2024

包裝飲用水中銅綠假單胞菌快速檢測(cè)

膠體金免疫層析法

1范圍

本文件規(guī)定了包裝飲用水中銅綠假單胞菌的膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法。

本文件適用于包裝飲用水中銅綠假單胞菌的快速檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB8538食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4原理

樣品中的銅綠假單胞菌經(jīng)濾膜過濾富集，超聲處理提取DNA，以此為模板，設(shè)計(jì)經(jīng)異硫氰酸熒光素

（FITC）和生物素（biotin）修飾的上下游引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）得到擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)

物的FITC端與膠體金上的FITC抗體結(jié)合，biotin端與試紙條檢測(cè)線（T線）上的鏈霉親和素（SAV）結(jié)合，

導(dǎo)致T線顏色加深，通過T線與控制線（C線）顏色比較，對(duì)樣品中的銅綠假單胞菌進(jìn)行定性判定。

5試劑和材料

除另有說明外，所用試劑均為分析純。

水：試驗(yàn)用水符合GB/T6682中一級(jí)水的要求。

銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株：CMCC（B）10282或等效標(biāo)準(zhǔn)菌株。

三羥甲基氨基甲烷（Tris）。

濃鹽酸（HCl）。

乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na?2H2O）。

氫氧化鈉溶液（NaOH）。

Tris-HCl溶液：稱取Tris（5.3）6.06g，加水（5.1）40mL溶解，調(diào)pH至8.0，加水（5.1）

定容至50mL。

EDTA溶液：稱取EDTA-2Na?2H2O（5.5）9.306g，加水（5.1）35mL，充分溶解，用NaOH溶液（5.6）

調(diào)pH至8.0，加水（5.1）定容至50mL。

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DB34/T4878—2024

TE緩沖溶液：量取1mLTris-HCl溶液（5.7）于100mL容量瓶中，再加入0.2mLEDTA（5.8）

溶液，加水（5.1）定容至100mL。4℃保存，有效期一年。

PCR預(yù)混液：主要成分為DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、氯化鎂（MgCl2）。

無菌雙蒸水（ddH2O）。

上樣緩沖液：主要成分為Tris-HCl溶液、檸檬酸鈉緩沖液、吐溫20、聚乙二醇20000。

營(yíng)養(yǎng)肉湯：主要成分為蛋白胨、牛肉粉、氯化鈉、葡萄糖。

銅綠假單胞菌菌懸液：用接種環(huán)挑取平皿上培養(yǎng)20h～24h的銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（5.2）

典型菌落，接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯（5.13）中，37℃±1℃培養(yǎng)18h～20h，至活菌數(shù)達(dá)到1×108CFU/mL～

5×108CFU/mL時(shí)，即制得銅綠假單胞菌菌懸液。

引物：上游引物5’-Biotin-GGCATTCAGATTGCTGCTCG-3’，下游引物

5’-FITC-ACCGCCGTCAGAATCAGTTT-3’。

6儀器和設(shè)備

PCR儀。

過濾裝置。

微量移液器。

旋渦混合器。

超聲波水浴儀。

電子天平：感量分別為0.01g和0.001g。

無菌濾膜：直徑47mm，微孔徑為0.45μm。

離心管。

離心機(jī)：離心轉(zhuǎn)速≥5000rpm。

pH計(jì)。

膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條。

膠體金讀卡儀（可選）。

7檢測(cè)

樣品處理

將250mL待檢水樣通過孔徑0.45μm的無菌濾膜（6.7）過濾，濾膜備用。以無菌水作為空白對(duì)

照，以銅綠假單胞菌菌懸液（5.14）作為陽性質(zhì)控對(duì)照。

DNA提取

將7.1得到的濾膜置于無菌瓶底部，加入1mL的TE緩沖溶液（5.9）重懸，超聲后將瓶中溶液轉(zhuǎn)移

到1.5mL離心管中，5000rpm室溫離心5min，取上清液備用。

PCR擴(kuò)增

取7.2得到的上清液2μL，加入PCR預(yù)混液（5.10）12.5μL，10μmol/L上下游引物（5.15）各0.8

μL，ddH2O（5.11）8.9μL?；靹蚝筮M(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，

61℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸2min，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，備用。

測(cè)定

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DB34/T4878—2024

取7.3得到的擴(kuò)增產(chǎn)物2μL，滴加在膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條（6.11）上，再滴加48μL上樣

緩沖液（5.12）于樣品墊上，靜置3min，觀察T線和C線顯色情況，進(jìn)行結(jié)果判定。

8結(jié)果判定

無效

控制線（C線）不顯色，或空白試驗(yàn)檢測(cè)線（T線）顯色，或陽性質(zhì)控試驗(yàn)檢測(cè)線（T線）不顯色，

均判定無效。示意圖見圖1。

陰性

控制線（C線）顯色，檢測(cè)線（T線）不顯色。

陽性

控制線（C線）與檢測(cè)線（T線）均顯色。

參比標(biāo)準(zhǔn)

檢測(cè)結(jié)果為陽性時(shí)可采用參比標(biāo)準(zhǔn)GB8538進(jìn)行確認(rèn)。

圖1目視判定示意圖

9性能指標(biāo)

檢出限

檢出限為1CFU/250mL。

靈敏度

靈敏度≥95%。

3

DB34/T4878—2024

特異性

特異性≥95%。

假陰性率

假陰性率≤5%。

假陽性率

假陽性率≤5%。

定性方法性能指標(biāo)計(jì)算方法

見附錄A。

4

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附錄A

（資料性）

定性方法性能指標(biāo)計(jì)算方法

性能指標(biāo)計(jì)算表見表A.1。

表A.1性能指標(biāo)計(jì)算表

檢測(cè)結(jié)果b

樣品情況a總數(shù)

陽性陰性

陽性N11N12N1.=N11+N12

陰性N21N22N2.=N21+N22

總數(shù)N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2

2

2=（|N12-N21|-1）/（N12+N21），

顯著性差異（х2）

自由度（df）=1

靈敏度（p+，%）p+=N11/N1.

特異性（p-，%）p-=N22/N2.

假陰性率（pf-，%）