(2025年)PCR科室培訓(xùn)考核試題附答案一、單選題（每題2分，共40分）1.以下哪種物質(zhì)可抑制PCR反應(yīng)（）A.水B.甘油C.肝素D.氯化鈉答案：C。解析：肝素是一種強(qiáng)抗凝劑，它可以與DNA結(jié)合，抑制DNA聚合酶的活性，從而抑制PCR反應(yīng)。而水是PCR反應(yīng)的溶劑；甘油在一定濃度下可用于改善PCR反應(yīng)的條件；氯化鈉是維持反應(yīng)體系離子強(qiáng)度的常用物質(zhì)，一般不會(huì)抑制PCR反應(yīng)。2.PCR反應(yīng)中，引物的設(shè)計(jì)原則不包括（）A.引物長(zhǎng)度一般為18-25個(gè)核苷酸B.引物的GC含量應(yīng)在40%-60%C.引物3’端可以是A或TD.引物自身不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)答案：C。解析：引物3’端應(yīng)避免是A或T，因?yàn)锳或T與模板的結(jié)合力較弱，可能導(dǎo)致引物錯(cuò)配，影響PCR反應(yīng)的特異性。引物長(zhǎng)度一般為18-25個(gè)核苷酸能保證合適的退火溫度和特異性；GC含量在40%-60%有助于維持引物的穩(wěn)定性和退火溫度；引物自身不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，否則會(huì)影響引物與模板的結(jié)合。3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中，SYBRGreenI熒光染料的作用是（）A.特異性結(jié)合雙鏈DNAB.特異性結(jié)合單鏈DNAC.特異性結(jié)合RNAD.與Taq酶結(jié)合答案：A。解析：SYBRGreenI是一種熒光染料，它能特異性地結(jié)合雙鏈DNA，當(dāng)它與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光信號(hào)增強(qiáng)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度可以對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。它不特異性結(jié)合單鏈DNA、RNA，也不與Taq酶結(jié)合。4.在PCR反應(yīng)體系中，TaqDNA聚合酶的作用是（）A.解開DNA雙鏈B.催化引物與模板的結(jié)合C.催化dNTP合成DNA鏈D.檢測(cè)PCR產(chǎn)物答案：C。解析：TaqDNA聚合酶具有5’-3’聚合酶活性，能以dNTP為原料，以DNA單鏈為模板，在引物的引導(dǎo)下催化合成新的DNA鏈。解開DNA雙鏈?zhǔn)峭ㄟ^(guò)高溫變性實(shí)現(xiàn)的；引物與模板的結(jié)合是在退火溫度下自動(dòng)進(jìn)行的；檢測(cè)PCR產(chǎn)物可以通過(guò)多種方法，如凝膠電泳、熒光定量等，不是TaqDNA聚合酶的作用。5.以下哪種PCR技術(shù)可以用于檢測(cè)基因的甲基化狀態(tài)（）A.RT-PCRB.qPCRC.MSPD.RAPD答案：C。解析：甲基化特異性PCR（MSP）是一種用于檢測(cè)基因甲基化狀態(tài)的技術(shù)，它通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化DNA的特異性引物，對(duì)經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鹽處理后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而判斷基因的甲基化情況。RT-PCR是逆轉(zhuǎn)錄PCR，用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；qPCR是實(shí)時(shí)熒光定量PCR，主要用于對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量分析；RAPD是隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA，用于檢測(cè)基因組的多態(tài)性。6.PCR反應(yīng)的基本步驟不包括（）A.變性B.退火C.延伸D.連接答案：D。解析：PCR反應(yīng)的基本步驟包括變性（高溫使DNA雙鏈解開）、退火（低溫使引物與模板結(jié)合）、延伸（中溫下TaqDNA聚合酶催化合成新的DNA鏈）。連接一般是指在基因工程中用DNA連接酶將DNA片段連接起來(lái)，不是PCR反應(yīng)的基本步驟。7.在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，Ct值的含義是（）A.達(dá)到熒光閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)B.熒光信號(hào)的強(qiáng)度C.PCR反應(yīng)的終止循環(huán)數(shù)D.模板DNA的濃度答案：A。解析：Ct值即循環(huán)閾值，是指在實(shí)時(shí)熒光定量PCR過(guò)程中，熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)。它與模板DNA的起始濃度呈負(fù)相關(guān)，可以通過(guò)Ct值對(duì)模板DNA進(jìn)行定量分析。熒光信號(hào)的強(qiáng)度是檢測(cè)到的熒光值；PCR反應(yīng)一般不會(huì)有固定的終止循環(huán)數(shù)；模板DNA的濃度需要通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線等方法根據(jù)Ct值來(lái)計(jì)算。8.以下關(guān)于PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)的說(shuō)法，錯(cuò)誤的是（）A.應(yīng)分為試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本處理區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)B.各區(qū)域應(yīng)獨(dú)立，有明確的標(biāo)識(shí)C.擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)可以合并D.各區(qū)域的氣流方向應(yīng)從清潔區(qū)到污染區(qū)答案：C。解析：PCR實(shí)驗(yàn)室的擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)不能合并，因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)是進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)的區(qū)域，產(chǎn)物分析區(qū)是對(duì)擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和分析的區(qū)域，擴(kuò)增產(chǎn)物可能會(huì)造成污染，如果合并可能會(huì)導(dǎo)致污染擴(kuò)散，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分為試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本處理區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)，各區(qū)域應(yīng)獨(dú)立且有明確標(biāo)識(shí)，氣流方向應(yīng)從清潔區(qū)到污染區(qū)，以防止污染。9.PCR反應(yīng)中，dNTP的作用是（）A.提供能量B.作為DNA合成的原料C.調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pHD.穩(wěn)定TaqDNA聚合酶答案：B。解析：dNTP（脫氧核苷三磷酸）包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP，它們是DNA合成的原料，在TaqDNA聚合酶的作用下，dNTP中的磷酸基團(tuán)之間的高能磷酸鍵斷裂，釋放能量，將脫氧核苷酸添加到正在合成的DNA鏈上。dNTP不是主要用于提供能量，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH一般使用緩沖液，穩(wěn)定TaqDNA聚合酶可以通過(guò)一些添加劑如甘油等，但不是dNTP的主要作用。10.以下哪種情況可能導(dǎo)致PCR產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性條帶（）A.引物特異性高B.退火溫度合適C.模板濃度過(guò)低D.循環(huán)次數(shù)過(guò)多答案：D。解析：循環(huán)次數(shù)過(guò)多會(huì)增加非特異性擴(kuò)增的機(jī)會(huì)，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性條帶。引物特異性高、退火溫度合適有利于提高PCR反應(yīng)的特異性，減少非特異性條帶的產(chǎn)生；模板濃度過(guò)低可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低，但一般不會(huì)直接導(dǎo)致非特異性條帶。11.實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，標(biāo)準(zhǔn)曲線的作用是（）A.確定PCR反應(yīng)的最佳條件B.檢測(cè)PCR產(chǎn)物的純度C.對(duì)未知樣本進(jìn)行定量分析D.判斷PCR反應(yīng)是否成功答案：C。解析：實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，通過(guò)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（以已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)數(shù)濃度為橫坐標(biāo)繪制的曲線），可以根據(jù)未知樣本的Ct值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找到對(duì)應(yīng)的濃度，從而對(duì)未知樣本進(jìn)行定量分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線不能確定PCR反應(yīng)的最佳條件；檢測(cè)PCR產(chǎn)物的純度可以通過(guò)凝膠電泳等方法；判斷PCR反應(yīng)是否成功可以通過(guò)觀察Ct值、熔解曲線等，但不是標(biāo)準(zhǔn)曲線的主要作用。12.以下關(guān)于PCR引物的說(shuō)法，正確的是（）A.引物可以是RNAB.引物的5’端可以進(jìn)行修飾C.引物的長(zhǎng)度越長(zhǎng)越好D.引物不需要進(jìn)行純化答案：B。解析：引物的5’端可以進(jìn)行修飾，如添加生物素、熒光基團(tuán)等，用于后續(xù)的檢測(cè)或其他實(shí)驗(yàn)操作。PCR引物一般是DNA引物；引物長(zhǎng)度并非越長(zhǎng)越好，過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致退火溫度過(guò)高、合成成本增加等問(wèn)題，一般長(zhǎng)度為18-25個(gè)核苷酸；引物在合成后通常需要進(jìn)行純化，以去除雜質(zhì)和未反應(yīng)的原料，提高引物的質(zhì)量。13.在PCR反應(yīng)中，模板DNA的質(zhì)量對(duì)反應(yīng)結(jié)果有重要影響，以下哪種情況會(huì)影響模板DNA的質(zhì)量（）A.樣本采集后立即處理B.提取過(guò)程中嚴(yán)格遵守操作規(guī)程C.模板DNA中含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)D.模板DNA保存在合適的條件下答案：C。解析：模板DNA中含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)會(huì)影響PCR反應(yīng)的結(jié)果，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)可能會(huì)抑制TaqDNA聚合酶的活性，干擾PCR反應(yīng)。樣本采集后立即處理、提取過(guò)程中嚴(yán)格遵守操作規(guī)程、模板DNA保存在合適的條件下都有利于保證模板DNA的質(zhì)量。14.以下哪種PCR技術(shù)可以用于檢測(cè)病毒的RNA（）A.普通PCRB.RT-PCRC.巢式PCRD.降落PCR答案：B。解析：逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）是先將病毒的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，因此可以用于檢測(cè)病毒的RNA。普通PCR只能以DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增；巢式PCR是通過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增提高擴(kuò)增的特異性；降落PCR是通過(guò)逐步降低退火溫度來(lái)提高PCR反應(yīng)的特異性，它們都不能直接對(duì)RNA進(jìn)行擴(kuò)增。15.PCR反應(yīng)體系中，Mg2?的作用是（）A.激活TaqDNA聚合酶B.穩(wěn)定引物與模板的結(jié)合C.調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pHD.防止DNA降解答案：A。解析：Mg2?是TaqDNA聚合酶的激活劑，它可以與dNTP、DNA模板和TaqDNA聚合酶形成復(fù)合物，激活TaqDNA聚合酶的活性，促進(jìn)DNA合成。穩(wěn)定引物與模板的結(jié)合主要與退火溫度等因素有關(guān)；調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH一般使用緩沖液；防止DNA降解可以通過(guò)添加一些保護(hù)劑等方法，不是Mg2?的主要作用。16.實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，熔解曲線分析的目的是（）A.檢測(cè)PCR產(chǎn)物的濃度B.判斷PCR產(chǎn)物的特異性C.確定PCR反應(yīng)的最佳循環(huán)數(shù)D.檢測(cè)模板DNA的純度答案：B。解析：熔解曲線分析是通過(guò)逐漸升高溫度，使PCR產(chǎn)物雙鏈解開，根據(jù)熒光信號(hào)的變化繪制熔解曲線。不同的PCR產(chǎn)物具有不同的熔解溫度，如果熔解曲線只有一個(gè)峰，說(shuō)明PCR產(chǎn)物具有較好的特異性；如果出現(xiàn)多個(gè)峰，可能存在非特異性擴(kuò)增。熔解曲線分析不能檢測(cè)PCR產(chǎn)物的濃度；確定PCR反應(yīng)的最佳循環(huán)數(shù)可以通過(guò)觀察Ct值等；檢測(cè)模板DNA的純度可以通過(guò)其他方法，如紫外分光光度法等。17.以下關(guān)于PCR實(shí)驗(yàn)室生物安全的說(shuō)法，錯(cuò)誤的是（）A.實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)穿戴工作服、口罩、手套等防護(hù)用品B.實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期進(jìn)行消毒C.擴(kuò)增產(chǎn)物可以隨意丟棄D.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)及時(shí)清理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面答案：C。解析：擴(kuò)增產(chǎn)物含有大量的DNA片段，可能具有傳染性或其他危害，不能隨意丟棄，應(yīng)按照生物安全的要求進(jìn)行處理，如高壓滅菌等。實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)穿戴工作服、口罩、手套等防護(hù)用品，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期進(jìn)行消毒，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)及時(shí)清理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，這些都是PCR實(shí)驗(yàn)室生物安全的基本要求。18.在PCR反應(yīng)中，退火溫度的選擇主要取決于（）A.引物的長(zhǎng)度和GC含量B.模板DNA的長(zhǎng)度C.TaqDNA聚合酶的活性D.dNTP的濃度答案：A。解析：退火溫度主要取決于引物的長(zhǎng)度和GC含量。引物的長(zhǎng)度和GC含量不同，其退火溫度也不同，一般可以通過(guò)公式進(jìn)行估算。模板DNA的長(zhǎng)度對(duì)退火溫度影響較?。籘aqDNA聚合酶的活性主要與反應(yīng)溫度等因素有關(guān)；dNTP的濃度主要影響DNA合成的速度，而不是退火溫度。19.以下哪種PCR技術(shù)可以用于基因的克?。ǎ〢.普通PCRB.多重PCRC.反向PCRD.以上都可以答案：D。解析：普通PCR可以擴(kuò)增特定的基因片段，用于基因克??；多重PCR可以在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)基因片段，也可用于基因克??；反向PCR可以擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列，同樣可用于基因克隆。所以以上三種PCR技術(shù)都可以用于基因的克隆。20.PCR反應(yīng)中，循環(huán)數(shù)一般設(shè)置為（）A.5-10次B.10-15次C.25-35次D.40-50次答案：C。解析：PCR反應(yīng)中，循環(huán)數(shù)一般設(shè)置為25-35次。循環(huán)次數(shù)過(guò)少，可能導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物量不足，無(wú)法檢測(cè)到；循環(huán)次數(shù)過(guò)多，會(huì)增加非特異性擴(kuò)增的機(jī)會(huì)，同時(shí)也會(huì)浪費(fèi)時(shí)間和試劑。所以通常選擇25-35次的循環(huán)數(shù)。二、多選題（每題3分，共30分）1.PCR實(shí)驗(yàn)室的污染來(lái)源主要包括（）A.擴(kuò)增產(chǎn)物的污染B.試劑的污染C.操作人員的污染D.環(huán)境的污染答案：ABCD。解析：PCR實(shí)驗(yàn)室的污染來(lái)源是多方面的。擴(kuò)增產(chǎn)物含有大量的DNA片段，一旦泄漏很容易造成污染；試劑在生產(chǎn)、儲(chǔ)存或使用過(guò)程中可能被污染；操作人員在操作過(guò)程中如果不遵守規(guī)范，如未戴手套、口罩等，可能將自身攜帶的微生物或DNA污染實(shí)驗(yàn)；環(huán)境中的灰塵、空氣等也可能含有DNA等物質(zhì)，造成環(huán)境的污染。2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)點(diǎn)包括（）A.靈敏度高B.特異性強(qiáng)C.可進(jìn)行定量分析D.無(wú)需電泳檢測(cè)答案：ABCD。解析：實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有靈敏度高的特點(diǎn)，能夠檢測(cè)到極少量的模板DNA；通過(guò)設(shè)計(jì)特異性的引物和探針等，特異性強(qiáng)；可以根據(jù)Ct值對(duì)模板DNA進(jìn)行定量分析；而且在反應(yīng)過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)，無(wú)需進(jìn)行電泳檢測(cè)，操作更加簡(jiǎn)便快速。3.以下關(guān)于PCR引物設(shè)計(jì)的注意事項(xiàng)，正確的有（）A.避免引物之間形成二聚體B.引物的3’端盡量避免連續(xù)的G或CC.引物的序列應(yīng)與模板DNA完全互補(bǔ)D.引物可以跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)答案：ABCD。解析：引物之間形成二聚體會(huì)影響引物與模板的結(jié)合，降低PCR反應(yīng)的效率，所以應(yīng)避免；引物的3’端連續(xù)的G或C可能導(dǎo)致引物錯(cuò)配，應(yīng)盡量避免；引物的序列應(yīng)與模板DNA完全互補(bǔ)，以保證引物能準(zhǔn)確地與模板結(jié)合；對(duì)于有內(nèi)含子的基因，引物可以跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)，這樣可以區(qū)分cDNA和基因組DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物。4.PCR反應(yīng)體系的組成成分包括（）A.模板DNAB.引物C.TaqDNA聚合酶D.dNTP答案：ABCD。解析：PCR反應(yīng)體系的基本組成成分包括模板DNA，它是擴(kuò)增的對(duì)象；引物，引導(dǎo)DNA合成的起始；TaqDNA聚合酶，催化DNA鏈的合成；dNTP，作為DNA合成的原料。此外，還可能包括緩沖液、Mg2?等成分。5.以下哪些因素會(huì)影響PCR反應(yīng)的特異性（）A.引物的特異性B.退火溫度C.循環(huán)次數(shù)D.模板的質(zhì)量答案：ABCD。解析：引物的特異性直接影響PCR反應(yīng)能否準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增目標(biāo)序列；退火溫度不合適可能導(dǎo)致引物錯(cuò)配，影響特異性；循環(huán)次數(shù)過(guò)多會(huì)增加非特異性擴(kuò)增的機(jī)會(huì)；模板的質(zhì)量不好，如含有雜質(zhì)等，也可能影響PCR反應(yīng)的特異性。6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR中常用的熒光化學(xué)方法有（）A.SYBRGreenI法B.TaqMan探針?lè)–.MolecularBeacons法D.FRET探針?lè)ù鸢福篈BCD。解析：SYBRGreenI法是通過(guò)SYBRGreenI熒光染料結(jié)合雙鏈DNA來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物；TaqMan探針?lè)ㄊ抢肨aqMan探針的熒光信號(hào)變化來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物；MolecularBeacons法是基于分子信標(biāo)探針的熒光變化進(jìn)行檢測(cè)；FRET探針?lè)ㄊ抢脽晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移原理來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物。這些都是實(shí)時(shí)熒光定量PCR中常用的熒光化學(xué)方法。7.以下關(guān)于PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，正確的有（）A.病原體的檢測(cè)B.腫瘤的診斷和監(jiān)測(cè)C.遺傳病的診斷D.藥物療效的評(píng)估答案：ABCD。解析：PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用?？梢杂糜诓≡w的檢測(cè)，如檢測(cè)病毒、細(xì)菌等；在腫瘤的診斷和監(jiān)測(cè)方面，可以檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因的突變、表達(dá)等情況；對(duì)于遺傳病的診斷，通過(guò)檢測(cè)相關(guān)基因的突變來(lái)進(jìn)行；還可以通過(guò)檢測(cè)藥物作用后相關(guān)基因的表達(dá)變化等評(píng)估藥物療效。8.PCR實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制措施包括（）A.定期校準(zhǔn)儀器設(shè)備B.使用質(zhì)量合格的試劑C.嚴(yán)格遵守操作規(guī)程D.進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量評(píng)價(jià)答案：ABCD。解析：PCR實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制措施包括定期校準(zhǔn)儀器設(shè)備，以保證儀器的準(zhǔn)確性；使用質(zhì)量合格的試劑，避免因試劑問(wèn)題影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，防止操作失誤導(dǎo)致的誤差；進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量評(píng)價(jià)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和可比性。9.以下關(guān)于巢式PCR的說(shuō)法，正確的有（）A.巢式PCR可以提高擴(kuò)增的特異性B.巢式PCR需要兩對(duì)引物C.巢式PCR的第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物作為第二輪擴(kuò)增的模板D.巢式PCR可以用于檢測(cè)低豐度的模板答案：ABCD。解析：巢式PCR通過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增，使用兩對(duì)引物，第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物作為第二輪擴(kuò)增的模板，這樣可以提高擴(kuò)增的特異性，減少非特異性擴(kuò)增的影響。由于其較高的特異性和敏感性，巢式PCR可以用于檢測(cè)低豐度的模板。10.在PCR反應(yīng)中，可能出現(xiàn)的問(wèn)題及解決方法有（）A.無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，可能是引物設(shè)計(jì)不合理，需重新設(shè)計(jì)引物B.出現(xiàn)非特異性條帶，可能是退火溫度過(guò)低，需提高退火溫度C.擴(kuò)增產(chǎn)物量少，可能是模板濃度過(guò)低，需增加模板量D.電泳條帶模糊，可能是上樣量過(guò)多，需減少上樣量答案：ABCD。解析：無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物可能是引物設(shè)計(jì)不合理，如引物與模板不匹配等，需要重新設(shè)計(jì)引物；出現(xiàn)非特異性條帶可能是退火溫度過(guò)低，導(dǎo)致引物錯(cuò)配，提高退火溫度可以增加引物與模板結(jié)合的特異性；擴(kuò)增產(chǎn)物量少可能是模板濃度過(guò)低，增加模板量可以提高擴(kuò)增效率；電泳條帶模糊可能是上樣量過(guò)多，導(dǎo)致條帶擴(kuò)散，減少上樣量可以使條帶更清晰。三、簡(jiǎn)答題（每題10分，共30分）1.簡(jiǎn)述PCR技術(shù)的基本原理。答：PCR技術(shù)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種體外擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)。其基本原理基于DNA的半保留復(fù)制機(jī)制。首先將含有待擴(kuò)增DNA模板的反應(yīng)體系加熱至高溫（一般94-95℃），使雙鏈DNA解開成為單鏈，這一過(guò)程稱為變性。然后將溫度降低（一般50-65℃），使引物與單鏈DNA模板特異性結(jié)合，這一過(guò)程稱為退火。接著將溫度升高至TaqDNA聚合酶的最適溫度（一般72℃），在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料，從引物的3’端開始，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，合成新的DNA鏈，這一過(guò)程稱為延伸。重復(fù)變性、退火、延伸這三個(gè)步驟，每一輪循環(huán)都會(huì)使DNA模板的數(shù)量大致翻倍，經(jīng)過(guò)多次循環(huán)后，就可以在體外大量擴(kuò)增特定的DNA片段。2.請(qǐng)說(shuō)明實(shí)時(shí)熒光定量PCR中Ct值的意義及應(yīng)用。答：Ct值即循環(huán)閾值，是指在實(shí)時(shí)熒光定量PCR過(guò)程中，熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)。其意義在于它與模板DNA的起始濃度呈負(fù)相關(guān)，即模板DNA的起始濃度越高，Ct值越?。荒０錎NA的起始濃度越低，Ct值越大。Ct值的應(yīng)用主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：一是定量分析，通過(guò)