————附件1食品中嗎啡、可待因的快速檢測膠體金免疫層析法（KJ201707）1范圍本方法規(guī)定了食品中嗎啡、可待因的膠體金免疫層析快速檢測方法。本方法適用于經(jīng)調(diào)味料、火鍋底料、麻辣燙底料或其他食用湯料等勾兌、調(diào)配或添加形成的液體食品；經(jīng)調(diào)味醬、調(diào)味油脂、火鍋底料、麻辣燙底料、蘸料或其他調(diào)味料等勾兌、調(diào)配或添加形成的半固體食品，醬油；經(jīng)香辛香料、復(fù)合調(diào)味料等勾兌、調(diào)配或添加形成的固體食品，食用醋（含以食用醋為主的調(diào)味料）中嗎啡、可待因的快速測定。2原理本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的嗎啡、可待因經(jīng)水提取后與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和檢測線（T線）上抗原的結(jié)合，導(dǎo)致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線與控制線（C線）顏色深淺比較，對樣品中嗎啡、可待因進(jìn)行定性判定。3試劑與材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的三級水。3.1試劑甲醇。3.2參考物質(zhì)嗎啡、可待因參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對分子量見表1，純度均≥99%。表1嗎啡、可待因參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對分子量序號(hào)中文名稱英文名稱CAS登錄號(hào)分子式相對分子量1嗎啡Morphine57-27-2C17H19NO3285.342磷酸可待因CodeinePhosphate41444-62-6C18H21NO3?H3PO4?3/2H2O424.39注：或等同可溯源物質(zhì)。3.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制3.3.1嗎啡、可待因標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1?mg/mL）：精密稱取適量嗎啡、可待因參考物質(zhì)（3.2），用甲醇（3.1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別制成濃度為1?mg/mL的嗎啡、可待因標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。-20℃避光保存，有效期1年。3.3.2嗎啡、可待因標(biāo)準(zhǔn)中間液（10?μg/mL）：精密移取嗎啡、可待因標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1?mg/mL）（3.3.1）1mL分別置于100?mL容量瓶中，用甲醇（3.1）稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為10?μg/mL的嗎啡、可待因標(biāo)準(zhǔn)中間液。-20℃避光保存，有效期3個(gè)月。3.3.3嗎啡、可待因標(biāo)準(zhǔn)工作液（1?μg/mL）：精密移取嗎啡、可待因標(biāo)準(zhǔn)中間液（10?μg/mL）（3.3.2）1mL分別置于10?mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1?μg/mL的嗎啡、可待因標(biāo)準(zhǔn)工作液。4℃避光保存，有效期1個(gè)月。3.4材料嗎啡、可待因膠體金免疫層析檢測卡，及配套的試劑（可選），適用基質(zhì)為食品。4儀器和設(shè)備4.1天平：感量為0.01g。4.2讀數(shù)儀：產(chǎn)品配套可使用的檢測儀器（可選）。4.3環(huán)境條件：溫度10—40℃，相對濕度≤80%。5分析步驟5.1試樣制備取適量樣品，液體樣品或半固體樣品充分混勻，固體樣品充分粉碎混勻。5.2試樣提取和凈化5.2.1液體食品：吸取試樣（盡量避免吸取油脂層）測定。層析展不開時(shí)，用0.45μm微孔濾膜過濾后測定。5.2.2半固體食品及醬油：準(zhǔn)確稱取試樣1g±0.1g于15mL具塞離心管中，加2—3mL水，大力振搖至均勻（必要時(shí)置約70℃水浴加熱），靜置5—10min，吸取水層（盡量避免吸取油脂層或沉淀）測定。層析展不開時(shí)，用0.45μm微孔濾膜過濾后測定。5.2.3固體食品及食用醋：準(zhǔn)確稱取試樣1g±0.1g于15mL具塞離心管中，加8—10mL水，大力振搖1—2min至均勻，靜置5—10min，吸取水層測定。層析展不開時(shí)，用0.45μm微孔濾膜過濾后測定。注：試樣提取和凈化（5.2）過程可按照試劑盒說明書，不做限定。5.3測定步驟測試前，將未開封的檢測卡恢復(fù)至室溫。緩慢滴加3—4滴待測溶液至檢測卡加樣孔中，靜置，5—10min內(nèi)對結(jié)果進(jìn)行判定。注：測定步驟建議按照試劑盒說明書。5.4質(zhì)控試驗(yàn)每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)。5.4.1空白試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取空白試樣1g±0.1g，按照5.2和5.3步驟與試樣同法操作。5.4.2加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)：稱取空白試樣，分別添加適量標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.3.3），使液體、半固體試樣或醬油試樣中嗎啡、可待因含量均為40μg/kg，使固體或食用醋試樣中嗎啡、可待因含量均為100μg/kg，按照5.2和5.3步驟與試樣同法操作。注：根據(jù)每次試驗(yàn)時(shí)的基質(zhì)類型做相應(yīng)的基質(zhì)加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)。6結(jié)果判定要求采用目視法對結(jié)果進(jìn)行判定，示意圖如圖1和圖2所示。結(jié)果判定也可使用膠體金讀數(shù)儀，具體操作與判定原則參照讀數(shù)儀使用說明書。結(jié)果判定建議按照試劑盒說明書。6.1比色法6.1.1無效控制線（C線）不顯色，無論檢測線（T線）是否顯色，表示操作不正確或檢測卡已失效。6.1.2陰性結(jié)果控制線（C線）顯色，檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色深或檢測線（T線）顏色與控制線（C線）顏色相當(dāng)，均表示樣品中不含嗎啡、可待因或含量低于方法檢測限，判為陰性。6.1.3陽性結(jié)果控制線（C線）顯色，檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色明顯淺或檢測線（T線）不顯色，均表示樣品中嗎啡、可待因含量高于方法檢測限，判為陽性。圖1目視判定示意圖（比色法）6.2消線法6.2.1無效控制線（C線）不顯色，無論檢測線（T線）是否顯色，表示操作不正確或檢測卡無效。6.2.2陰性結(jié)果控制線（C線）顯色，檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色深、檢測線（T線）顏色與控制線（C線）顏色相當(dāng)或檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色淺，均表示樣品中不含嗎啡、可待因或含量低于方法檢測限，判為陰性。6.2.3陽性結(jié)果控制線（C線）顯色，檢測線（T線）不顯色，表示樣品中嗎啡、可待因含量高于方法檢測限，判為陽性。圖2目視判定示意圖（消線法）6.3質(zhì)控試驗(yàn)要求空白試驗(yàn)測定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)測定結(jié)果應(yīng)為陽性。7結(jié)論當(dāng)檢測結(jié)果為陽性時(shí)，應(yīng)對結(jié)果進(jìn)行確證。8性能指標(biāo)8.1檢測限：經(jīng)調(diào)味料、火鍋底料、麻辣燙底料或其他食用湯料等勾兌、調(diào)配或添加形成的液體食品：嗎啡、可待因均為40μg/kg；經(jīng)調(diào)味醬、調(diào)味油脂、火鍋底料、麻辣燙底料、蘸料或其他調(diào)味料等勾兌、調(diào)配或添加形成的半固體食品，醬油：嗎啡、可待因均為40μg/kg；香辛香料、復(fù)合調(diào)味料等勾兌、調(diào)配或添加形成的固體食品，食用醋（含以食用醋為主的調(diào)味料）：嗎啡、可待因均為100μg/kg。8.2靈敏度：靈敏度≥99%。8.3特異性：特異性≥95%。8.4假陰性率：假陰性率≤1%。8.5假陽性率：假陽性率≤5%。注：性能指標(biāo)計(jì)算方法見附錄A。9其他本方法分析步驟和結(jié)果判定可以根據(jù)廠家試劑盒的說明書進(jìn)行，但應(yīng)符合或優(yōu)于本方法規(guī)定的性能指標(biāo)。本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時(shí)不做限定。但方法使用者應(yīng)使用經(jīng)過驗(yàn)證的滿足本方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)的試劑、試劑盒。本方法參比方法為《火鍋食品中罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（DB31/2010—2012）（包括所有的修改單）。

附錄A快速檢測方法性能指標(biāo)計(jì)算表表A.1性能指標(biāo)計(jì)算方法樣品情況a檢測結(jié)果b總數(shù)陽性陰性陽性N11N12N1.=N11+N12陰性N21N22N2.=N21+N22總數(shù)N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2顯著性差異（c2）c2=（?N12-N21?-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1靈敏度（p+，%）p+=N11/N1.特異性（p-，%）p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-靈敏度假陽性率（pf+，%）pf+=N21/N2.=100-特異性相對準(zhǔn)確度，%c（N11+N22）/(N1.+N2.)注：a由參比方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果或者樣品中實(shí)際的公議值結(jié)果；b由待確認(rèn)方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果。靈敏度的計(jì)算使用確認(rèn)后的結(jié)果。N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個(gè)下標(biāo)指行