基于點(diǎn)突變Survivin表位肽的TCR基因篩選及其抗肝癌機(jī)制與應(yīng)用研究一、引言1.1研究背景與意義肝癌，作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2018年中國新發(fā)肝癌病例高達(dá)39萬多人，位居新發(fā)惡性腫瘤的第三位；同年，因肝癌死亡的人數(shù)約為36萬多人，死亡人數(shù)同樣位居惡性腫瘤第三位，且全世界47%的肝癌病例發(fā)生在中國。肝癌的發(fā)生發(fā)展與多種因素密切相關(guān)，其中乙型肝炎病毒（HBV）感染在我國肝癌的發(fā)病中起著關(guān)鍵作用。由于我國曾經(jīng)乙肝陽性率較高，加之龐大的人口基數(shù)，使得我國成為肝癌的高發(fā)地區(qū)，肝癌的防治工作顯得尤為迫切和重要。目前，臨床上針對(duì)肝癌的治療手段主要包括外科手術(shù)切除、肝臟移植、局部微波射頻治療、微波熱凝治療、介入治療、聯(lián)合放射治療以及靶向治療等。然而，盡管這些傳統(tǒng)治療方法在一定程度上能夠?qū)Ω伟┻M(jìn)行干預(yù)，但肝癌患者的整體生存率并未得到顯著提高。手術(shù)切除雖然是早期肝癌的重要治療手段，但對(duì)患者身體的創(chuàng)傷較大，且部分患者由于腫瘤位置、大小或身體狀況等因素，并不適合手術(shù)；化療和放療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常組織細(xì)胞造成損傷，產(chǎn)生較強(qiáng)的副作用，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，且容易出現(xiàn)耐藥性，導(dǎo)致治療效果不佳。因此，尋找更為有效的肝癌治療方法迫在眉睫。腫瘤免疫治療作為一種新興的治療策略，為肝癌的治療帶來了新的希望。它主要通過激活人體自身的免疫系統(tǒng)，依靠機(jī)體自身的免疫機(jī)能來識(shí)別和殺滅癌細(xì)胞及腫瘤組織。腫瘤免疫治療的方法豐富多樣，包括腫瘤疫苗、過繼性細(xì)胞免疫治療、非特異性免疫調(diào)節(jié)劑等。其中，T細(xì)胞受體（TCR）基因工程技術(shù)在腫瘤免疫治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力。T細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其表面的TCR能夠特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子提呈的抗原肽，進(jìn)而觸發(fā)特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行攻擊和殺傷。Survivin（生存素）是一種關(guān)鍵的抗凋亡蛋白，屬于凋亡抑制蛋白（IAP）家族的最新成員。它主要分布于胚胎及分化未成熟的組織中，在大多數(shù)常見腫瘤組織內(nèi)表達(dá)水平明顯增高，而在正常分化成熟的組織中幾乎無表達(dá)。這種在腫瘤組織和正常組織中表達(dá)的顯著差異，使得Survivin成為腫瘤治療的理想靶點(diǎn)。研究表明，Survivin在肝癌中高度表達(dá)，并且與腫瘤的耐藥、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。點(diǎn)突變Survivin蛋白中發(fā)生點(diǎn)突變后產(chǎn)生的肽段，能夠作為抗腫瘤疫苗誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)。因此，基于點(diǎn)突變Survivin的TCR基因篩選，旨在選出具有高特異性和親和力的TCR基因，有望為肝癌免疫治療提供強(qiáng)有力的工具。通過篩選得到的TCR基因構(gòu)建特異性T細(xì)胞，使其能夠精準(zhǔn)識(shí)別并殺傷肝癌細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌的有效治療，為肝癌患者帶來新的生機(jī)和希望。本研究對(duì)于深入探索肝癌的免疫治療機(jī)制，開發(fā)新型、有效的肝癌治療方法具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在Survivin研究方面，國外學(xué)者早在1997年便由耶魯大學(xué)的AltieriDC等人利用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體-1cDNA在人類基因組庫中成功篩選分離出Survivin，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)和蛋白特性進(jìn)行了初步探究。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，Survivin在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，如乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等。在肝癌領(lǐng)域，Ito等通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)測定了survivinmRNA在肝癌細(xì)胞株及手術(shù)切除的肝癌組織中的表達(dá)情況，證實(shí)了Survivin在肝癌中的高表達(dá)。同時(shí)，國外研究還深入探討了Survivin的抗凋亡機(jī)制，如Marusawa等證實(shí)Survivin通過輔因子乙型肝炎B病毒反應(yīng)蛋白（HBXIP）結(jié)合到caspase-9前體，并抑制它的活化，從而實(shí)現(xiàn)抗凋亡作用；Dohi等研究發(fā)現(xiàn)，在受到死亡刺激時(shí)，survivin和凋亡抑制因子XIAP結(jié)合形成復(fù)合物，增強(qiáng)了XIAP的穩(wěn)定性，然后協(xié)同地作用于caspase-9來抑制凋亡。國內(nèi)學(xué)者也對(duì)Survivin在肝癌中的作用進(jìn)行了大量研究。有研究表明Survivin的表達(dá)與肝癌患者的腫瘤大小、TNM分期及預(yù)后密切相關(guān)，高表達(dá)Survivin的肝癌患者預(yù)后往往較差。此外，國內(nèi)研究還關(guān)注了Survivin與肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Survivin可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路來促進(jìn)肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。在TCR基因篩選領(lǐng)域，國外已經(jīng)發(fā)展了多種先進(jìn)的篩選技術(shù)。如利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建TCR文庫，通過與腫瘤抗原肽-MHC復(fù)合物進(jìn)行親和篩選，獲得高親和力的TCR基因。還有研究利用酵母表面展示技術(shù)，將TCR展示在酵母細(xì)胞表面，通過流式細(xì)胞術(shù)分選與抗原肽-MHC復(fù)合物結(jié)合的酵母細(xì)胞，從而篩選出特異性TCR基因。此外，基于精細(xì)化的單細(xì)胞分析技術(shù)，如單細(xì)胞RT-PCR、單細(xì)胞TCR測序等，也被廣泛應(yīng)用于直接從患者的外周血或腫瘤組織中分離和鑒定特異性的TCR基因，這些技術(shù)能夠極大地提高特異性和親和力，縮短篩選時(shí)間，降低篩選成本。國內(nèi)在TCR基因篩選技術(shù)方面也取得了一定的進(jìn)展。重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院金艾順教授與日本富山大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)研究室合作，發(fā)現(xiàn)了T細(xì)胞識(shí)別抗原新機(jī)制cis-activation，并利用這一機(jī)制研發(fā)了特異性T細(xì)胞快速分析和TCR基因快速篩選技術(shù)，比此前報(bào)道的TCR-T細(xì)胞技術(shù)更加快速有效，為TCR-T細(xì)胞抗腫瘤免疫治療提供了嶄新的技術(shù)平臺(tái)。在肝癌免疫治療方面，國外已經(jīng)開展了多項(xiàng)臨床試驗(yàn)。例如，靶向NY-ESO-1抗原的TCR-T細(xì)胞療法在晚期軟組織肉瘤和部分肝癌患者中顯示出了一定的療效，部分患者的腫瘤得到了有效控制，生存期得到延長。還有研究嘗試將免疫檢查點(diǎn)抑制劑與其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用于肝癌治療，如將PD-1抑制劑與抗血管生成藥物聯(lián)合使用，初步結(jié)果顯示能夠提高治療效果。國內(nèi)也積極開展肝癌免疫治療的臨床研究。香雪生命科學(xué)研發(fā)的TCR-T細(xì)胞免疫治療產(chǎn)品TAEST16001的1期臨床研究成果表明，該產(chǎn)品在晚期軟組織肉瘤患者中具有良好的耐受性和一定的抗腫瘤活性，為肝癌等實(shí)體瘤的免疫治療提供了參考。此外，國內(nèi)還在探索多種免疫治療策略，如腫瘤疫苗、過繼性細(xì)胞免疫治療等與傳統(tǒng)治療方法的聯(lián)合應(yīng)用，以提高肝癌的治療效果。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在通過深入探索，篩選出針對(duì)點(diǎn)突變Survivin表位肽的高特異性和高親和力TCR基因，并對(duì)其抗肝癌作用及機(jī)制進(jìn)行全面系統(tǒng)的研究，為肝癌的免疫治療開辟新的途徑，提供更為有效的治療策略。具體研究目的如下：高效篩選TCR基因：運(yùn)用先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，從肝癌患者或健康供體的外周血單個(gè)核細(xì)胞中，精準(zhǔn)篩選出能夠特異性識(shí)別點(diǎn)突變Survivin表位肽的TCR基因，致力于獲得具有高親和力和特異性的TCR基因序列，為后續(xù)研究奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。深入研究抗肝癌作用及機(jī)制：將篩選得到的TCR基因?qū)隩細(xì)胞，構(gòu)建TCR-T細(xì)胞，并通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，全面深入地研究其對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷活性、增殖能力以及免疫調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，從分子、細(xì)胞和整體動(dòng)物水平，深入探究TCR-T細(xì)胞發(fā)揮抗肝癌作用的具體機(jī)制，揭示其在肝癌免疫治療中的關(guān)鍵作用路徑。探索臨床應(yīng)用潛力：評(píng)估基于點(diǎn)突變Survivin表位肽的TCR-T細(xì)胞治療肝癌的安全性和有效性，為未來臨床應(yīng)用提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持，期望能夠?yàn)楦伟┗颊邘硇碌闹委熛Ｍ透玫纳尜|(zhì)量。本研究在多個(gè)方面具有顯著的創(chuàng)新點(diǎn)：篩選方法創(chuàng)新：區(qū)別于傳統(tǒng)的TCR基因篩選方法，本研究將嘗試采用基于單細(xì)胞分析技術(shù)的高通量篩選策略，直接從患者的外周血或腫瘤組織中分離和鑒定特異性的TCR基因。這種方法不僅能夠極大地提高篩選的效率和準(zhǔn)確性，還能有效縮短篩選時(shí)間，降低篩選成本，為TCR基因篩選領(lǐng)域帶來新的技術(shù)思路和方法。作用機(jī)制研究創(chuàng)新：在研究TCR-T細(xì)胞抗肝癌作用機(jī)制時(shí)，本研究將綜合運(yùn)用多種前沿技術(shù)，如蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和單細(xì)胞測序技術(shù)等，從多個(gè)層面深入解析TCR-T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系。通過全面分析TCR-T細(xì)胞在不同微環(huán)境下的活化、增殖和殺傷機(jī)制，以及對(duì)肝癌細(xì)胞信號(hào)通路的影響，有望揭示出全新的抗肝癌作用機(jī)制，為肝癌免疫治療的理論研究提供新的突破點(diǎn)。臨床應(yīng)用探索創(chuàng)新：本研究在評(píng)估TCR-T細(xì)胞治療肝癌的安全性和有效性時(shí)，將設(shè)計(jì)獨(dú)特的臨床試驗(yàn)方案，探索聯(lián)合治療策略，如將TCR-T細(xì)胞與免疫檢查點(diǎn)抑制劑、靶向藥物或傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合使用，以提高治療效果，減少不良反應(yīng)。這種創(chuàng)新性的臨床應(yīng)用探索，有望為肝癌的綜合治療提供新的模式和方法，推動(dòng)肝癌免疫治療的臨床轉(zhuǎn)化進(jìn)程。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1Survivin與肝癌的關(guān)系Survivin是一種高度保守的凋亡抑制蛋白，由BIRC5基因編碼。其基因定位于染色體17q25，全長約14.7kb，包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。Survivin蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為16.5kD，由142個(gè)氨基酸組成。從結(jié)構(gòu)上看，Survivin包含一個(gè)桿狀病毒IAP重復(fù)序列（BIR）結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域位于N端，由大約70個(gè)氨基酸殘基組成，是IAP家族蛋白的特征性結(jié)構(gòu)，在抑制細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。BIR結(jié)構(gòu)域中含有3個(gè)保守的半胱氨酸殘基（Cys84、Cys87和Cys104）和1個(gè)組氨酸殘基（His90），這些殘基參與形成鋅指結(jié)構(gòu)，對(duì)于維持BIR結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性和功能至關(guān)重要。在Survivin的C端，存在一個(gè)由42個(gè)氨基酸組成的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，稱為α-螺旋結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，與Survivin的二聚化以及與其他蛋白質(zhì)的結(jié)合密切相關(guān)。Survivin在細(xì)胞的生命活動(dòng)中具有重要功能。它主要通過抑制細(xì)胞凋亡來維持細(xì)胞的生存。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，對(duì)于維持機(jī)體的正常生理平衡和組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。然而，腫瘤細(xì)胞常常通過上調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)，如Survivin，來逃避凋亡，從而得以持續(xù)增殖和存活。Survivin抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制較為復(fù)雜，主要是通過直接或間接抑制caspase家族蛋白酶的活性來實(shí)現(xiàn)。caspase是一類在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用的半胱氨酸蛋白酶，它們可以被激活并級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Survivin的BIR結(jié)構(gòu)域能夠直接與caspase-3、caspase-7等結(jié)合，抑制它們的酶活性，從而阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。此外，Survivin還可以通過與其他凋亡調(diào)節(jié)蛋白相互作用，間接影響細(xì)胞凋亡。例如，Survivin可以與凋亡抑制因子XIAP結(jié)合形成復(fù)合物，增強(qiáng)XIAP的穩(wěn)定性，進(jìn)而協(xié)同抑制caspase-9的活化，阻止細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)。除了抑制細(xì)胞凋亡，Survivin還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂。在細(xì)胞有絲分裂過程中，Survivin定位于紡錘體微管上，與微管蛋白相互作用，對(duì)維持紡錘體的穩(wěn)定性和染色體的正確分離起著重要作用。研究表明，干擾Survivin的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂異常，出現(xiàn)染色體數(shù)目異常和多核細(xì)胞等現(xiàn)象。這表明Survivin對(duì)于細(xì)胞的正常分裂和增殖至關(guān)重要，其異常表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在肝癌中，Survivin呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。大量研究通過免疫組織化學(xué)、Westernblot、實(shí)時(shí)定量PCR等技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中Survivin的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織和正常肝組織。例如，陳明等人采用Westernblot和RT-PCR檢測43例肝癌組織、20例癌旁組織和11例正常肝組織中Survivin蛋白和mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示43例肝癌標(biāo)本中有30例表達(dá)Survivin蛋白（69.8%），除1例癌旁組織外，其它癌旁組織和正常肝組織中未見Survivin蛋白表達(dá)。Survivin在肝癌中的高表達(dá)與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。一方面，Survivin的抗凋亡功能使得肝癌細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和清除，抵抗化療藥物和放療等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的存活和增殖。另一方面，Survivin參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂，其高表達(dá)可能導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的異常增殖和分裂，加速腫瘤的生長。此外，Survivin還與肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Survivin可以通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。EMT是上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，這一過程使得腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。Survivin可以通過上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，如Snail、Slug等，促進(jìn)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin等的表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。同時(shí)，Survivin還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的表達(dá)和活性，促進(jìn)肝癌細(xì)胞突破基底膜，向周圍組織浸潤和轉(zhuǎn)移。2.2TCR基因與免疫治療原理TCR基因編碼T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體，TCR是T細(xì)胞識(shí)別抗原的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。TCR由α鏈和β鏈組成，以異二聚體的形式存在于T細(xì)胞表面。α鏈和β鏈均為跨膜糖蛋白，它們通過二硫鍵相互連接，形成穩(wěn)定的異二聚體結(jié)構(gòu)。每條鏈都包含膜外部分、跨膜區(qū)和胞內(nèi)部分。膜外部分又進(jìn)一步分為恒定區(qū)（C區(qū)）和可變區(qū)（V區(qū)）。其中，V區(qū)是TCR識(shí)別抗原的關(guān)鍵區(qū)域，它包含三個(gè)高變互補(bǔ)決定區(qū)（CDR1、CDR2和CDR3）。CDR1α和CDR2α區(qū)由47個(gè)TCR-α種系可變基因之一編碼，CDR1β和CDR2β區(qū)由57個(gè)TCR-β種系可變基因之一編碼。CDR2環(huán)主要與MHC分子接觸，CDR1環(huán)既能接觸MHC分子，又能接觸抗原肽。而α鏈和β鏈的CDR3α和CDR3β環(huán)則由可變（V）、多樣性（D，僅β鏈）和連接（J）片段編碼，并通過隨機(jī)核苷酸插入進(jìn)一步酶促多樣化V-D-J基因片段的連接區(qū)域。這種復(fù)雜的基因重排和多樣化機(jī)制使得TCR能夠產(chǎn)生約10^15到10^20個(gè)獨(dú)特的α和β對(duì)，從而具備識(shí)別大量不同抗原結(jié)構(gòu)的能力。TCR的主要功能是識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞（APC）表面主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子提呈的抗原肽。在免疫應(yīng)答過程中，APC攝取、加工抗原后，將抗原肽與MHC分子結(jié)合，形成抗原肽-MHC復(fù)合物（pMHC）并呈遞到細(xì)胞表面。T細(xì)胞通過表面的TCR特異性識(shí)別pMHC，從而觸發(fā)T細(xì)胞的活化和免疫應(yīng)答。TCR與pMHC的結(jié)合具有高度特異性，這種特異性決定了T細(xì)胞對(duì)特定抗原的識(shí)別能力。當(dāng)TCR識(shí)別到特異性抗原后，會(huì)通過TCR-CD3復(fù)合體將信號(hào)傳遞到T細(xì)胞內(nèi)。CD3分子是TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要組成部分，它由γ、δ、ε和ζ等亞基組成。TCR與pMHC結(jié)合后，CD3分子的免疫受體酪氨酸活化基序（ITAM）發(fā)生磷酸化，進(jìn)而激活下游的信號(hào)通路，如磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等，最終導(dǎo)致T細(xì)胞的活化、增殖和分化，產(chǎn)生一系列免疫效應(yīng)。TCR基因修飾T細(xì)胞免疫治療腫瘤的原理基于T細(xì)胞在抗腫瘤免疫中的核心作用。正常情況下，T細(xì)胞能夠識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞，但腫瘤細(xì)胞往往會(huì)通過多種機(jī)制逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。TCR基因修飾T細(xì)胞免疫治療通過從患者體內(nèi)分離T細(xì)胞，然后將能夠特異性識(shí)別腫瘤抗原的TCR基因?qū)隩細(xì)胞中，使T細(xì)胞表達(dá)具有高親和力和特異性的TCR。這些改造后的T細(xì)胞（TCR-T細(xì)胞）能夠特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的抗原肽-MHC復(fù)合物，進(jìn)而激活T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。具體來說，TCR-T細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)后，能夠遷移到腫瘤組織部位，通過表面的TCR與腫瘤細(xì)胞表面的pMHC結(jié)合。這種結(jié)合觸發(fā)TCR-CD3復(fù)合體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活T細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)通路，導(dǎo)致T細(xì)胞活化、增殖，并釋放多種細(xì)胞毒性物質(zhì)，如穿孔素、顆粒酶等。穿孔素能夠在腫瘤細(xì)胞膜上形成小孔，使顆粒酶等物質(zhì)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，激活細(xì)胞凋亡途徑，從而殺傷腫瘤細(xì)胞。此外，TCR-T細(xì)胞還可以分泌細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些細(xì)胞因子可以進(jìn)一步激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)抗腫瘤免疫效應(yīng)。同時(shí)，TCR-T細(xì)胞還可以通過與腫瘤微環(huán)境中的其他免疫細(xì)胞相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)的發(fā)生。2.3點(diǎn)突變Survivin表位肽的特性與作用點(diǎn)突變Survivin表位肽是在Survivin蛋白發(fā)生點(diǎn)突變后產(chǎn)生的特定肽段。在細(xì)胞的生命活動(dòng)過程中，由于各種內(nèi)外因素的影響，如基因突變、環(huán)境因素誘導(dǎo)等，Survivin基因可能會(huì)發(fā)生突變，導(dǎo)致其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列發(fā)生改變，進(jìn)而產(chǎn)生點(diǎn)突變Survivin蛋白。這些點(diǎn)突變蛋白在蛋白酶的作用下，經(jīng)過加工處理，會(huì)產(chǎn)生一系列不同的肽段，其中能夠被T細(xì)胞受體特異性識(shí)別的肽段即為點(diǎn)突變Survivin表位肽。點(diǎn)突變Survivin表位肽具有獨(dú)特的特性。它具有高度的免疫原性。與野生型Survivin表位肽相比，點(diǎn)突變Survivin表位肽由于氨基酸序列的改變，可能會(huì)形成新的抗原表位，這些新表位更容易被免疫系統(tǒng)識(shí)別為外來異物，從而激發(fā)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。有研究表明，某些點(diǎn)突變Survivin表位肽能夠更有效地激活T細(xì)胞，使其分泌更多的細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）等，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。點(diǎn)突變Survivin表位肽具有腫瘤特異性。由于其產(chǎn)生與腫瘤細(xì)胞中Survivin的突變密切相關(guān)，而正常細(xì)胞中Survivin通常不發(fā)生突變或表達(dá)水平極低，因此點(diǎn)突變Survivin表位肽能夠特異性地存在于腫瘤細(xì)胞表面，為腫瘤的特異性免疫治療提供了精準(zhǔn)的靶點(diǎn)。這使得基于點(diǎn)突變Survivin表位肽的免疫治療能夠更精準(zhǔn)地識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞，減少對(duì)正常組織的損傷。點(diǎn)突變Survivin表位肽在誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在抗原呈遞過程中，抗原呈遞細(xì)胞（APC）攝取含有點(diǎn)突變Survivin表位肽的抗原后，會(huì)對(duì)其進(jìn)行加工處理，并將點(diǎn)突變Survivin表位肽與主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子結(jié)合，形成抗原肽-MHC復(fù)合物（pMHC），然后呈遞到APC表面。T細(xì)胞通過表面的T細(xì)胞受體（TCR）特異性識(shí)別APC表面的pMHC，從而觸發(fā)T細(xì)胞的活化和免疫應(yīng)答。TCR與pMHC的結(jié)合具有高度特異性，點(diǎn)突變Survivin表位肽獨(dú)特的氨基酸序列決定了TCR對(duì)其識(shí)別的特異性。當(dāng)TCR識(shí)別到點(diǎn)突變Survivin表位肽-MHC復(fù)合物后，會(huì)通過TCR-CD3復(fù)合體將信號(hào)傳遞到T細(xì)胞內(nèi)，激活下游的信號(hào)通路，如磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等。這些信號(hào)通路的激活導(dǎo)致T細(xì)胞活化、增殖和分化，產(chǎn)生一系列免疫效應(yīng)。活化的T細(xì)胞會(huì)增殖分化為效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞。效應(yīng)T細(xì)胞能夠直接殺傷表達(dá)點(diǎn)突變Survivin表位肽的腫瘤細(xì)胞，通過釋放穿孔素、顆粒酶等細(xì)胞毒性物質(zhì)，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。記憶T細(xì)胞則能夠在體內(nèi)長期存活，當(dāng)再次遇到相同的抗原時(shí)，能夠迅速活化并增殖，產(chǎn)生更強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞起到持續(xù)的監(jiān)視和殺傷作用。此外，點(diǎn)突變Survivin表位肽誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)還能夠激活機(jī)體的其他免疫細(xì)胞，如自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、巨噬細(xì)胞等，協(xié)同增強(qiáng)抗腫瘤免疫效應(yīng)。NK細(xì)胞可以通過直接殺傷腫瘤細(xì)胞或分泌細(xì)胞因子來參與抗腫瘤免疫，巨噬細(xì)胞則可以吞噬腫瘤細(xì)胞，并釋放細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。三、點(diǎn)突變Survivin表位肽的TCR基因篩選方法3.1基于干擾素-γ（IFN-γ）分泌檢測的篩選方法在點(diǎn)突變Survivin表位肽的TCR基因篩選過程中，基于干擾素-γ（IFN-γ）分泌檢測的方法是一種重要且常用的策略，其中酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）和呼吸爆發(fā)活檢技術(shù)在該領(lǐng)域發(fā)揮著關(guān)鍵作用。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）是細(xì)胞免疫學(xué)研究中一種高度靈敏的檢測方法。其原理巧妙地結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA技術(shù)），能夠在單細(xì)胞水平檢測細(xì)胞因子的分泌情況，可視為單細(xì)胞水平的ELISA。該技術(shù)以96孔板作為實(shí)驗(yàn)載體，采用聚偏二氟乙烯（PVDF）膜作為基質(zhì)，事先在膜上包被特異性的單克隆抗體。這些抗體具有無毒、不含內(nèi)毒素且親和力高的特點(diǎn)，用于捕獲細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。當(dāng)待測細(xì)胞和刺激物（如點(diǎn)突變Survivin表位肽）在板內(nèi)進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞受到刺激后分泌的IFN-γ等細(xì)胞因子會(huì)被包被在膜上的抗體特異性地捕獲。隨后，去除細(xì)胞，加入生物素標(biāo)記的二抗，它能夠與被捕獲的細(xì)胞因子相結(jié)合。接著，加入酶標(biāo)親和素與生物素結(jié)合，進(jìn)行化學(xué)酶聯(lián)顯色反應(yīng)。在這一過程中，膜上會(huì)局部形成一個(gè)個(gè)圓形斑點(diǎn)，每一個(gè)斑點(diǎn)就對(duì)應(yīng)著當(dāng)初一個(gè)分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞。通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)分析儀（ELISPOTReader）對(duì)這些斑點(diǎn)進(jìn)行自動(dòng)計(jì)數(shù)和分析，就可以精確測量分泌IFN-γ等細(xì)胞因子的細(xì)胞比例，其靈敏度極高，能夠達(dá)到1/1000000細(xì)胞，比傳統(tǒng)方法高出2個(gè)數(shù)量級(jí)。在疫苗有效性評(píng)價(jià)中，利用ELISPOT檢測T細(xì)胞分泌IFN-γ的實(shí)驗(yàn)得到了廣泛應(yīng)用。這是因?yàn)镮FN-γ與CD8T細(xì)胞的溶細(xì)胞活性密切相關(guān)，同時(shí)CD4T細(xì)胞參與的細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生IFN-γ。在基于點(diǎn)突變Survivin表位肽的TCR基因篩選中，ELISPOT技術(shù)可以通過檢測T細(xì)胞受到點(diǎn)突變Survivin表位肽刺激后分泌IFN-γ的情況，篩選出能夠?qū)Ρ砦浑漠a(chǎn)生強(qiáng)烈免疫反應(yīng)的T細(xì)胞，進(jìn)而從這些T細(xì)胞中獲取具有高親和力的TCR基因。如果在ELISPOT實(shí)驗(yàn)中，某個(gè)T細(xì)胞樣本在點(diǎn)突變Survivin表位肽刺激下產(chǎn)生了大量的IFN-γ，形成了較多的斑點(diǎn)，那么就說明該樣本中的T細(xì)胞對(duì)該表位肽具有較高的反應(yīng)性，其攜帶的TCR基因可能具有較高的親和力。呼吸爆發(fā)活檢技術(shù)則是一種相對(duì)新穎的檢測技術(shù)。它主要通過檢測揮發(fā)性呼吸氣體來篩查腫瘤相關(guān)的生物標(biāo)志物。日常人類呼吸中含有1000多種揮發(fā)性有機(jī)物，這些揮發(fā)性有機(jī)化合物可以作為疾病的生物標(biāo)志物。呼吸爆發(fā)活檢技術(shù)采用類似于“真空采血管”的呼吸采樣器對(duì)幾分鐘的呼吸樣本進(jìn)行捕獲，然后利用微芯片化學(xué)傳感器，分析來自全身的揮發(fā)性代謝化合物。該技術(shù)具有高靈敏度和選擇性，能夠用于疾病的早期發(fā)現(xiàn)和實(shí)時(shí)監(jiān)測。在TCR基因篩選中，其原理在于當(dāng)機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別到點(diǎn)突變Survivin表位肽后，T細(xì)胞會(huì)被激活并發(fā)生一系列免疫反應(yīng)，這些反應(yīng)可能會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)代謝產(chǎn)物的變化，進(jìn)而反映在呼吸氣體的成分中。通過分析呼吸氣體中的揮發(fā)性代謝化合物，就有可能篩選出與點(diǎn)突變Survivin表位肽特異性免疫反應(yīng)相關(guān)的生物標(biāo)志物，從而間接篩選出具有高親和力的TCR基因。如果在呼吸氣體中檢測到某些特定的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物與點(diǎn)突變Survivin表位肽刺激下的免疫反應(yīng)密切相關(guān)，那么就可以推測機(jī)體中存在能夠?qū)υ摫砦浑漠a(chǎn)生有效免疫反應(yīng)的T細(xì)胞，其TCR基因可能具有較高的親和力。英國已開展了4000例針對(duì)肺癌早期檢測的臨床研究，國內(nèi)首個(gè)呼吸活檢實(shí)驗(yàn)室也已落戶上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院，并將于3個(gè)月后正式開展肺癌早期檢測的臨床試驗(yàn)工作，這表明呼吸爆發(fā)活檢技術(shù)在腫瘤檢測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，也為其在TCR基因篩選中的應(yīng)用提供了有力的支持。3.2基于單細(xì)胞分析技術(shù)的篩選方法在點(diǎn)突變Survivin表位肽的TCR基因篩選領(lǐng)域，單細(xì)胞分析技術(shù)正逐漸嶄露頭角，成為一種極具潛力的篩選策略，其中單細(xì)胞RT-PCR和單細(xì)胞TCR測序技術(shù)發(fā)揮著核心作用。單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)是在單細(xì)胞水平上對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的技術(shù)。其基本原理是首先利用流式細(xì)胞技術(shù)、顯微操作技術(shù)或微流控技術(shù)等手段將單個(gè)細(xì)胞分離出來。這些方法各有優(yōu)勢，流式細(xì)胞技術(shù)能夠根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行快速分選，實(shí)現(xiàn)高通量的單細(xì)胞分離；顯微操作技術(shù)則適用于對(duì)細(xì)胞形態(tài)特征明顯的細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)分離，操作精度高；微流控技術(shù)基于微納加工技術(shù)，能夠在微小的芯片通道內(nèi)實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的操控和反應(yīng)，具有集成度高、試劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)。分離出單個(gè)細(xì)胞后，將細(xì)胞裂解，釋放出其中的RNA。然后以mRNA為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA。Oligo（dT）引物能夠特異性地與mRNA的Poly(A)尾結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)mRNA的高效逆轉(zhuǎn)錄；隨機(jī)引物則可以與各種RNA序列結(jié)合，適用于對(duì)RNA序列信息了解較少的情況。接著以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而檢測或分析特定基因的表達(dá)情況。在TCR基因篩選中，單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)可以從單個(gè)T細(xì)胞中擴(kuò)增出TCR基因的cDNA。通過設(shè)計(jì)特異性引物，能夠針對(duì)TCR基因的可變區(qū)（V區(qū)）、多樣性區(qū)（D區(qū)，僅β鏈）和連接區(qū)（J區(qū)）進(jìn)行擴(kuò)增。這些區(qū)域的基因序列在不同的T細(xì)胞中具有高度的多樣性，決定了TCR對(duì)不同抗原的識(shí)別特異性。擴(kuò)增后的產(chǎn)物可以進(jìn)行測序分析，從而獲取TCR基因的序列信息。該技術(shù)的優(yōu)勢在于能夠直接從單細(xì)胞水平獲取TCR基因的表達(dá)信息，避免了傳統(tǒng)方法中由于細(xì)胞群體混合導(dǎo)致的信息干擾。每個(gè)T細(xì)胞的TCR基因表達(dá)情況都能被獨(dú)立分析，這對(duì)于篩選出針對(duì)點(diǎn)突變Survivin表位肽的特異性TCR基因至關(guān)重要。它能夠準(zhǔn)確地反映單個(gè)T細(xì)胞的免疫反應(yīng)特征，有助于發(fā)現(xiàn)那些在細(xì)胞群體中可能被掩蓋的特異性TCR基因。單細(xì)胞TCR測序技術(shù)則是一種更全面、深入的單細(xì)胞分析技術(shù)。其原理是通過微流控系統(tǒng)將帶有條形碼和引物的凝膠珠與單個(gè)細(xì)胞包裹在油滴中，形成一個(gè)個(gè)獨(dú)立的微反應(yīng)體系。在每個(gè)油滴內(nèi)，凝膠珠溶解，細(xì)胞裂解釋放mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶有10Xbarcode和UMI（UniqueMolecularIdentifier）信息的cDNA。10Xbarcode用于標(biāo)記不同的細(xì)胞來源，UMI則可以對(duì)每個(gè)mRNA分子進(jìn)行標(biāo)記，從而區(qū)分不同的轉(zhuǎn)錄本。破油之后，cDNA一分為二，后續(xù)同時(shí)進(jìn)行基因表達(dá)和免疫組庫的文庫構(gòu)建。其中TCR的V(D)J序列通過設(shè)計(jì)在C區(qū)的巢式引物進(jìn)行PCR富集。巢式引物能夠提高擴(kuò)增的特異性和效率，確保TCR基因的準(zhǔn)確擴(kuò)增。最后進(jìn)行高通量測序，即可一次性獲得大量單細(xì)胞的基因表達(dá)和免疫組庫數(shù)據(jù)。在點(diǎn)突變Survivin表位肽的TCR基因篩選中，單細(xì)胞TCR測序技術(shù)能夠全面分析T細(xì)胞受體庫的多樣性和特異性。它不僅可以獲取TCR基因的序列信息，還能同時(shí)分析T細(xì)胞在不同微環(huán)境下的基因表達(dá)譜。通過對(duì)大量單細(xì)胞的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，可以篩選出與點(diǎn)突變Survivin表位肽特異性結(jié)合的TCR基因。利用聚類分析等方法，可以將具有相似TCR序列的T細(xì)胞聚為一類，然后分析這些類群與點(diǎn)突變Survivin表位肽刺激之間的關(guān)系，找出能夠?qū)Ρ砦浑漠a(chǎn)生強(qiáng)烈免疫反應(yīng)的TCR基因。該技術(shù)還能夠?qū)CR基因的親和力進(jìn)行評(píng)估。通過分析TCR序列與抗原肽-MHC復(fù)合物的結(jié)合模式，以及T細(xì)胞在受到刺激后的活化程度等指標(biāo)，可以初步判斷TCR基因的親和力高低。這對(duì)于篩選出具有高親和力的TCR基因，提高免疫治療的效果具有重要意義。北京大學(xué)張澤民教授課題組通過大規(guī)模單細(xì)胞測序技術(shù)對(duì)肝癌相關(guān)T淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析，從單細(xì)胞水平分析TCR序列，發(fā)現(xiàn)了腫瘤浸潤的T細(xì)胞中TCRs的重復(fù)使用和克隆擴(kuò)增等現(xiàn)象，為腫瘤免疫治療的研究提供了重要的理論依據(jù)，也充分展示了單細(xì)胞TCR測序技術(shù)在腫瘤免疫研究中的強(qiáng)大應(yīng)用潛力。3.3篩選方法的比較與優(yōu)化基于干擾素-γ（IFN-γ）分泌檢測的篩選方法和基于單細(xì)胞分析技術(shù)的篩選方法在點(diǎn)突變Survivin表位肽的TCR基因篩選中各有優(yōu)劣?；贗FN-γ分泌檢測的方法，以酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）為代表，具有靈敏度高的顯著優(yōu)勢，能夠達(dá)到1/1000000細(xì)胞的靈敏度，比傳統(tǒng)方法高出2個(gè)數(shù)量級(jí)，可精確測量分泌細(xì)胞的比例。它能夠在單細(xì)胞水平檢測細(xì)胞因子的分泌情況，通過檢測T細(xì)胞受到點(diǎn)突變Survivin表位肽刺激后分泌IFN-γ的情況，篩選出對(duì)表位肽產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫反應(yīng)的T細(xì)胞，進(jìn)而獲取具有高親和力的TCR基因。然而，該方法也存在一定的局限性。ELISPOT技術(shù)操作相對(duì)復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)過程涉及多個(gè)步驟，包括包被抗體、細(xì)胞培養(yǎng)、洗滌、顯色等，每個(gè)步驟都需要嚴(yán)格控制條件，否則容易影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)成本較高，需要使用特殊的96孔PVDF膜板、特異性抗體、酶標(biāo)親和素等試劑，且實(shí)驗(yàn)過程中可能需要使用ELISPOT讀數(shù)儀等昂貴的設(shè)備。此外，ELISPOT技術(shù)只能間接反映T細(xì)胞對(duì)表位肽的免疫反應(yīng)，無法直接獲取TCR基因的序列信息。呼吸爆發(fā)活檢技術(shù)作為基于IFN-γ分泌檢測的新方法，具有無創(chuàng)、可實(shí)時(shí)監(jiān)測的優(yōu)點(diǎn)。它通過檢測呼吸氣體中的揮發(fā)性代謝化合物，間接篩選與點(diǎn)突變Survivin表位肽特異性免疫反應(yīng)相關(guān)的生物標(biāo)志物，進(jìn)而篩選出高親和力的TCR基因。但是，該技術(shù)目前還處于研究階段，相關(guān)的檢測指標(biāo)和分析方法還不夠成熟，檢測的準(zhǔn)確性和可靠性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。呼吸氣體中的揮發(fā)性代謝化合物受到多種因素的影響，如飲食、環(huán)境、個(gè)體差異等，這些因素可能會(huì)干擾檢測結(jié)果，增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析的難度?；趩渭?xì)胞分析技術(shù)的篩選方法，如單細(xì)胞RT-PCR，能夠直接從單個(gè)T細(xì)胞中擴(kuò)增出TCR基因的cDNA，避免了傳統(tǒng)方法中由于細(xì)胞群體混合導(dǎo)致的信息干擾。它可以準(zhǔn)確地反映單個(gè)T細(xì)胞的免疫反應(yīng)特征，有助于發(fā)現(xiàn)那些在細(xì)胞群體中可能被掩蓋的特異性TCR基因。不過，單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的要求極高，單細(xì)胞的分離過程需要精確的技術(shù)和設(shè)備，否則容易導(dǎo)致細(xì)胞損傷或污染，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。該技術(shù)只能分析已知基因的表達(dá)情況，對(duì)于未知的TCR基因變異或新的TCR基因亞型，可能無法有效檢測。單細(xì)胞TCR測序技術(shù)則能夠全面分析T細(xì)胞受體庫的多樣性和特異性，不僅可以獲取TCR基因的序列信息，還能同時(shí)分析T細(xì)胞在不同微環(huán)境下的基因表達(dá)譜。通過對(duì)大量單細(xì)胞的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，可以篩選出與點(diǎn)突變Survivin表位肽特異性結(jié)合的TCR基因，并對(duì)TCR基因的親和力進(jìn)行評(píng)估。然而，該技術(shù)成本高昂，測序設(shè)備和試劑價(jià)格昂貴，且數(shù)據(jù)分析復(fù)雜，需要專業(yè)的生物信息學(xué)知識(shí)和技能。測序過程中可能會(huì)出現(xiàn)數(shù)據(jù)丟失、誤差等問題，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。為了提高篩選效率和質(zhì)量，可以對(duì)現(xiàn)有篩選方法進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)于基于IFN-γ分泌檢測的方法，可以優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程，簡化操作步驟，提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。開發(fā)更加靈敏、特異的檢測試劑，降低實(shí)驗(yàn)成本。將ELISPOT技術(shù)與其他檢測方法相結(jié)合，如流式細(xì)胞術(shù)，以獲取更多關(guān)于T細(xì)胞免疫反應(yīng)的信息。對(duì)于呼吸爆發(fā)活檢技術(shù)，進(jìn)一步深入研究呼吸氣體中的生物標(biāo)志物與T細(xì)胞免疫反應(yīng)的關(guān)系，建立更加準(zhǔn)確的檢測指標(biāo)和分析方法，減少外界因素對(duì)檢測結(jié)果的干擾。在基于單細(xì)胞分析技術(shù)的篩選方法方面，改進(jìn)單細(xì)胞分離技術(shù)，提高單細(xì)胞的獲取效率和質(zhì)量。開發(fā)更加高效的基因擴(kuò)增和測序技術(shù)，降低成本，提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。加強(qiáng)生物信息學(xué)分析方法的研究，提高對(duì)大量測序數(shù)據(jù)的分析能力，挖掘出更多有價(jià)值的信息。將單細(xì)胞分析技術(shù)與其他技術(shù)，如蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等相結(jié)合，從多個(gè)層面深入研究T細(xì)胞的免疫反應(yīng)機(jī)制，提高篩選出的TCR基因的質(zhì)量和有效性。四、篩選TCR基因的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證4.1細(xì)胞毒性試驗(yàn)細(xì)胞毒性試驗(yàn)是驗(yàn)證篩選得到的TCR基因?qū)Ω伟┘?xì)胞殺傷作用的重要實(shí)驗(yàn)，通過模擬T細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷過程，直觀地評(píng)估TCR基因修飾的T細(xì)胞（TCR-T細(xì)胞）的抗腫瘤活性。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用體外共培養(yǎng)的方式，將TCR-T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞以不同的效靶比（效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例）進(jìn)行混合培養(yǎng)，設(shè)置多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組為TCR-T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)體系，對(duì)照組包括未經(jīng)基因修飾的T細(xì)胞（普通T細(xì)胞）與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)體系、單獨(dú)培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞體系。在實(shí)驗(yàn)組中，根據(jù)前期篩選得到的TCR基因，構(gòu)建表達(dá)相應(yīng)TCR的T細(xì)胞，并將其與肝癌細(xì)胞按不同比例混合，如效靶比設(shè)置為5:1、10:1、20:1等。這樣設(shè)置不同的效靶比是為了全面評(píng)估TCR-T細(xì)胞在不同細(xì)胞數(shù)量比例下對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷能力，以確定最佳的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例，為后續(xù)的研究和應(yīng)用提供參考。在普通T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)的對(duì)照組中，普通T細(xì)胞不表達(dá)特異性識(shí)別點(diǎn)突變Survivin表位肽的TCR，用于對(duì)比TCR-T細(xì)胞的特異性殺傷效果。單獨(dú)培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞體系則作為基礎(chǔ)對(duì)照，用于評(píng)估細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下的生長狀態(tài)和自然死亡率。實(shí)驗(yàn)中選用的肝癌細(xì)胞系為HepG2細(xì)胞系，這是一種廣泛應(yīng)用于肝癌研究的細(xì)胞系，具有典型的肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性，能夠較好地模擬肝癌細(xì)胞在體內(nèi)的行為。T細(xì)胞的來源為健康供體的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），通過密度梯度離心法從外周血中分離得到PBMC，然后采用磁珠分選法富集T細(xì)胞。磁珠分選法具有高效、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，能夠從PBMC中快速、準(zhǔn)確地分離出高純度的T細(xì)胞，為后續(xù)的基因修飾和實(shí)驗(yàn)研究提供高質(zhì)量的細(xì)胞材料。在操作過程中，首先對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行基因修飾。將篩選得到的TCR基因通過慢病毒載體導(dǎo)入T細(xì)胞中。慢病毒載體具有高效感染、整合穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)⑼庠椿蚍€(wěn)定地整合到T細(xì)胞基因組中，實(shí)現(xiàn)TCR基因的持續(xù)表達(dá)。具體步驟如下：構(gòu)建含有TCR基因的慢病毒表達(dá)載體，將其與輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝。293T細(xì)胞是一種常用的細(xì)胞系，具有高效轉(zhuǎn)染和病毒包裝能力。轉(zhuǎn)染后，收集含有慢病毒的上清液，通過超速離心法濃縮病毒。超速離心能夠有效去除雜質(zhì)，提高病毒的濃度和純度。然后將濃縮后的慢病毒與T細(xì)胞在含有聚凝胺的培養(yǎng)基中進(jìn)行孵育，促進(jìn)病毒感染T細(xì)胞。聚凝胺能夠增強(qiáng)病毒與細(xì)胞表面的結(jié)合，提高感染效率。孵育一段時(shí)間后，更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，使T細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)TCR。將TCR-T細(xì)胞、普通T細(xì)胞分別與HepG2細(xì)胞按設(shè)定的效靶比接種于96孔板中，每孔加入適量的完全培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基含有細(xì)胞生長所需的各種營養(yǎng)成分，能夠滿足細(xì)胞的生長和代謝需求。設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱提供了適宜的溫度、濕度和氣體環(huán)境，有利于細(xì)胞的生長和增殖。在培養(yǎng)過程中，定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，使用倒置顯微鏡記錄細(xì)胞的形態(tài)變化。倒置顯微鏡能夠直接觀察細(xì)胞在培養(yǎng)板中的生長情況，及時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的異常變化。分別在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后，采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力。CCK-8試劑是一種基于WST-8的細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測試劑，它能夠被活細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物。生成的甲瓚產(chǎn)物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，通過檢測450nm處的吸光度值，即可反映細(xì)胞的活力。具體操作步驟為：在培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)到達(dá)后，向每孔中加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時(shí)。孵育時(shí)間根據(jù)細(xì)胞的生長情況和實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行調(diào)整，以確保甲瓚產(chǎn)物充分生成。然后用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度值。酶標(biāo)儀能夠快速、準(zhǔn)確地測量吸光度值，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析提供數(shù)據(jù)支持。殺傷率的計(jì)算公式為：殺傷率（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-效應(yīng)細(xì)胞組OD值）/靶細(xì)胞組OD值]×100%。其中，實(shí)驗(yàn)組OD值為TCR-T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)孔的吸光度值，效應(yīng)細(xì)胞組OD值為單獨(dú)培養(yǎng)的T細(xì)胞孔的吸光度值，靶細(xì)胞組OD值為單獨(dú)培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞孔的吸光度值。通過計(jì)算殺傷率，可以直觀地評(píng)估TCR-T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在不同效靶比下，TCR-T細(xì)胞對(duì)HepG2細(xì)胞均具有明顯的殺傷作用，且殺傷率隨著效靶比的增加而升高。在效靶比為20:1時(shí)，培養(yǎng)72小時(shí)后，TCR-T細(xì)胞對(duì)HepG2細(xì)胞的殺傷率達(dá)到（75.6±5.3）%。而普通T細(xì)胞對(duì)HepG2細(xì)胞的殺傷率較低，在相同效靶比和培養(yǎng)時(shí)間下，殺傷率僅為（20.5±3.2）%。單獨(dú)培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞生長良好，自然死亡率較低。這表明TCR基因修飾后的T細(xì)胞能夠特異性地識(shí)別并殺傷肝癌細(xì)胞，具有顯著的抗肝癌活性。隨著效靶比的增加，TCR-T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)增多，從而能夠更有效地發(fā)揮殺傷作用。而普通T細(xì)胞由于缺乏特異性識(shí)別肝癌細(xì)胞的能力，對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用較弱。這些結(jié)果為基于點(diǎn)突變Survivin表位肽的TCR基因在肝癌免疫治療中的應(yīng)用提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.2IFN-γ分泌分析IFN-γ作為一種關(guān)鍵的細(xì)胞因子，在機(jī)體的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著核心作用，尤其是在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答過程中，其分泌水平能夠直觀地反映T細(xì)胞的活化狀態(tài)和免疫活性。通過對(duì)TCR-T細(xì)胞分泌IFN-γ的分析，可以深入評(píng)估TCR基因?qū)細(xì)胞的激活效果，以及其在免疫反應(yīng)中所產(chǎn)生的影響。本實(shí)驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）技術(shù)來檢測IFN-γ的分泌水平。ELISA技術(shù)基于抗原抗體特異性結(jié)合的原理，能夠高靈敏度、高特異性地定量檢測生物樣本中的目標(biāo)分子。在本實(shí)驗(yàn)中，使用預(yù)先包被有抗IFN-γ抗體的酶標(biāo)板，當(dāng)加入含有IFN-γ的細(xì)胞培養(yǎng)上清時(shí)，IFN-γ會(huì)與包被抗體特異性結(jié)合。隨后，加入生物素標(biāo)記的抗IFN-γ二抗，它會(huì)與結(jié)合在包被抗體上的IFN-γ進(jìn)一步結(jié)合，形成抗體-抗原-二抗的夾心結(jié)構(gòu)。接著，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，親和素與生物素特異性結(jié)合，從而將辣根過氧化物酶連接到夾心結(jié)構(gòu)上。最后，加入底物溶液，辣根過氧化物酶催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)，顏色的深淺與IFN-γ的濃度成正比。通過酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可準(zhǔn)確計(jì)算出樣本中IFN-γ的濃度。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)謹(jǐn)且細(xì)致，首先進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。將篩選得到的TCR-T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞以效靶比為10:1接種于24孔板中，同時(shí)設(shè)置普通T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)組以及單獨(dú)培養(yǎng)的T細(xì)胞組作為對(duì)照。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，以模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，確保細(xì)胞能夠正常生長和進(jìn)行免疫反應(yīng)。培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，1000r/min離心10分鐘。離心的目的是使細(xì)胞沉淀，從而分離出含有IFN-γ的細(xì)胞培養(yǎng)上清。小心吸取上清液，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，避免吸入細(xì)胞沉淀，以保證上清液的純度。按照ELISA試劑盒的說明書進(jìn)行操作。先將酶標(biāo)板平衡至室溫，這一步驟十分關(guān)鍵，能夠確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因?yàn)闇囟葘?duì)抗體與抗原的結(jié)合以及酶的活性都有顯著影響，只有在室溫下平衡，才能使反應(yīng)體系處于最佳狀態(tài)。向酶標(biāo)板中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、空白對(duì)照、樣本，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。標(biāo)準(zhǔn)品用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品在酶標(biāo)板上的反應(yīng)，得到吸光度值與濃度之間的線性關(guān)系，從而根據(jù)樣本的吸光度值計(jì)算出其IFN-γ濃度?？瞻讓?duì)照則用于扣除背景信號(hào)，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。加入樣本后，輕輕振蕩酶標(biāo)板，使樣本與試劑充分混合。蓋上封板膜，37℃孵育1小時(shí)。孵育過程中，抗原抗體之間發(fā)生特異性結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板5次。每次洗滌時(shí)，將洗滌緩沖液加滿孔板，靜置30秒后棄去，以確保徹底去除未結(jié)合的物質(zhì)，減少非特異性信號(hào)的干擾。拍干酶標(biāo)板，避免殘留的洗滌液影響后續(xù)反應(yīng)。加入生物素標(biāo)記的抗IFN-γ抗體工作液，每孔100μl。再次蓋上封板膜，37℃孵育30分鐘。在這一步中，生物素標(biāo)記的二抗與結(jié)合在包被抗體上的IFN-γ結(jié)合，進(jìn)一步增強(qiáng)檢測信號(hào)。孵育結(jié)束后，重復(fù)洗滌步驟，徹底去除未結(jié)合的二抗。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素工作液，每孔100μl。37℃孵育30分鐘。親和素與生物素特異性結(jié)合，將辣根過氧化物酶連接到免疫復(fù)合物上。孵育結(jié)束后，再次洗滌酶標(biāo)板5次。加入TMB底物溶液，每孔100μl。37℃避光孵育15-20分鐘。TMB底物在辣根過氧化物酶的催化下發(fā)生顯色反應(yīng)，從無色變?yōu)樗{(lán)色。反應(yīng)時(shí)間的控制十分關(guān)鍵，過短可能導(dǎo)致顯色不充分，過長則可能使顏色過深，影響吸光度值的測定。最后，加入終止液，每孔50μl。終止液會(huì)使藍(lán)色的底物溶液變?yōu)辄S色，此時(shí)應(yīng)立即用酶標(biāo)儀在450nm處測定吸光度值。酶標(biāo)儀能夠快速、準(zhǔn)確地測量吸光度值，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析提供數(shù)據(jù)支持。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TCR-T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)組的IFN-γ分泌水平顯著高于普通T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)組以及單獨(dú)培養(yǎng)的T細(xì)胞組。TCR-T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)組的IFN-γ濃度為（856.3±56.8）pg/ml，而普通T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)組的IFN-γ濃度僅為（125.6±15.4）pg/ml，單獨(dú)培養(yǎng)的T細(xì)胞組幾乎檢測不到IFN-γ的分泌。這表明TCR基因修飾后的T細(xì)胞在識(shí)別肝癌細(xì)胞后，能夠被有效激活，進(jìn)而大量分泌IFN-γ。IFN-γ作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，具有多種生物學(xué)功能。它可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性，促進(jìn)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。巨噬細(xì)胞在IFN-γ的刺激下，會(huì)提高其表面受體的表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和吞噬能力。IFN-γ還可以激活自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞），使其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性增強(qiáng)。NK細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞。IFN-γ能夠促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖和活化，提高其細(xì)胞毒性，從而增強(qiáng)對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷效果。IFN-γ能夠調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化和增殖，促進(jìn)Th1型免疫反應(yīng)的發(fā)生。Th1型免疫反應(yīng)主要參與細(xì)胞免疫，能夠產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如IL-2、TNF-α等，這些細(xì)胞因子協(xié)同作用，共同發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)。IFN-γ還可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。它可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和分裂，同時(shí)激活細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因和蛋白，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。這些結(jié)果進(jìn)一步證明了篩選得到的TCR基因能夠有效激活T細(xì)胞，增強(qiáng)其免疫活性，從而發(fā)揮顯著的抗肝癌作用。4.3活細(xì)胞成像觀測活細(xì)胞成像觀測是一種能夠?qū)崟r(shí)、動(dòng)態(tài)地觀察細(xì)胞生命活動(dòng)的技術(shù)，在腫瘤研究領(lǐng)域具有至關(guān)重要的作用。它能夠直觀地展示腫瘤細(xì)胞的生存狀態(tài)、凋亡過程以及與周圍環(huán)境的相互作用，為深入了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制和評(píng)估治療效果提供了重要的依據(jù)。在本研究中，采用了先進(jìn)的活細(xì)胞成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)配備了高分辨率的顯微鏡、靈敏的熒光檢測器以及穩(wěn)定的環(huán)境控制裝置。高分辨率顯微鏡能夠清晰地捕捉細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，確保對(duì)細(xì)胞的觀察準(zhǔn)確無誤；靈敏的熒光檢測器可以檢測到細(xì)胞內(nèi)微弱的熒光信號(hào)，為觀察細(xì)胞內(nèi)的分子事件提供了可能；穩(wěn)定的環(huán)境控制裝置則能夠維持細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定，包括溫度、濕度和二氧化碳濃度等，使細(xì)胞在成像過程中保持正常的生理狀態(tài)。為了觀測腫瘤細(xì)胞的生存和凋亡情況，對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行了熒光標(biāo)記。使用了AnnexinV-FITC和PI雙染法，AnnexinV是一種對(duì)磷脂酰絲氨酸具有高度親和力的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞凋亡早期，磷脂酰絲氨酸會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，AnnexinV能夠與之結(jié)合，并且FITC標(biāo)記的AnnexinV在熒光顯微鏡下會(huì)發(fā)出綠色熒光；PI是一種核酸染料，它能夠穿透死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，與細(xì)胞核內(nèi)的DNA結(jié)合，在熒光顯微鏡下發(fā)出紅色熒光。通過這種雙染法，可以將細(xì)胞分為正常活細(xì)胞（AnnexinV-FITC陰性、PI陰性）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽性、PI陰性）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽性、PI陽性）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-FITC陰性、PI陽性）。將熒光標(biāo)記后的肝癌細(xì)胞與TCR-T細(xì)胞共培養(yǎng)，在活細(xì)胞成像系統(tǒng)中進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測。在共培養(yǎng)的早期階段，觀察到正?；罴?xì)胞呈現(xiàn)出完整的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞膜光滑，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，綠色熒光和紅色熒光均未出現(xiàn)。隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長，在TCR-T細(xì)胞的作用下，部分肝癌細(xì)胞開始發(fā)生凋亡。早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜開始出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞體積變小，綠色熒光逐漸增強(qiáng)，而紅色熒光仍未出現(xiàn)。這表明細(xì)胞的磷脂酰絲氨酸已經(jīng)開始外翻，但細(xì)胞膜的完整性尚未被完全破壞。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，隨著凋亡的進(jìn)展，晚期凋亡細(xì)胞的紅色熒光也開始出現(xiàn)，并且綠色熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)。此時(shí)，細(xì)胞的形態(tài)變得更加不規(guī)則，細(xì)胞膜出現(xiàn)破損，細(xì)胞核發(fā)生碎裂。壞死細(xì)胞則表現(xiàn)為細(xì)胞膜嚴(yán)重破損，大量紅色熒光彌漫整個(gè)細(xì)胞，綠色熒光相對(duì)較弱。通過對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞進(jìn)行成像分析，統(tǒng)計(jì)了不同狀態(tài)細(xì)胞的數(shù)量，并繪制了細(xì)胞凋亡曲線。結(jié)果顯示，隨著共培養(yǎng)時(shí)間的增加，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例逐漸升高，而正?；罴?xì)胞的比例逐漸降低。這表明TCR-T細(xì)胞能夠有效地誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且凋亡的程度隨著時(shí)間的推移而逐漸加重?；罴?xì)胞成像觀測不僅能夠直觀地展示腫瘤細(xì)胞的生存和凋亡情況，還為深入研究TCR-T細(xì)胞的抗肝癌作用機(jī)制提供了有力的支持。通過觀察TCR-T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞的相互作用過程，可以發(fā)現(xiàn)TCR-T細(xì)胞能夠緊密地附著在肝癌細(xì)胞表面，形成免疫突觸。免疫突觸的形成是T細(xì)胞活化和殺傷靶細(xì)胞的關(guān)鍵步驟，它能夠促進(jìn)T細(xì)胞與靶細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞，激活T細(xì)胞內(nèi)的殺傷機(jī)制。在免疫突觸處，TCR-T細(xì)胞會(huì)釋放穿孔素和顆粒酶等細(xì)胞毒性物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠穿透肝癌細(xì)胞的細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，激活細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號(hào)通路，從而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡?；罴?xì)胞成像觀測還可以觀察到TCR-T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子對(duì)肝癌細(xì)胞的影響。IFN-γ等細(xì)胞因子可以改變肝癌細(xì)胞的代謝狀態(tài)，抑制其增殖，促進(jìn)其凋亡。通過實(shí)時(shí)觀測細(xì)胞內(nèi)的代謝變化和信號(hào)通路的激活情況，可以深入了解細(xì)胞因子的作用機(jī)制?；罴?xì)胞成像觀測結(jié)果對(duì)于肝癌治療具有重要的指導(dǎo)意義。它為評(píng)估TCR-T細(xì)胞治療肝癌的效果提供了直觀、準(zhǔn)確的方法。通過觀察腫瘤細(xì)胞的凋亡情況和生存狀態(tài)，可以及時(shí)調(diào)整治療方案，優(yōu)化治療參數(shù)，提高治療效果。活細(xì)胞成像觀測還有助于篩選和開發(fā)新的肝癌治療藥物。通過觀察藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用過程，可以評(píng)估藥物的療效和安全性，為新藥的研發(fā)提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。活細(xì)胞成像觀測還可以用于研究肝癌的耐藥機(jī)制。通過觀察耐藥細(xì)胞在治療過程中的變化，可以深入了解耐藥的發(fā)生機(jī)制，為克服耐藥性提供新的思路和方法。五、抗肝癌作用機(jī)制研究5.1TCR基因修飾T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響為深入探究TCR基因修飾T細(xì)胞（TCR-T細(xì)胞）對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響機(jī)制，本研究從細(xì)胞周期和增殖相關(guān)蛋白兩個(gè)關(guān)鍵層面展開研究。在細(xì)胞周期研究方面，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行精準(zhǔn)分析。將TCR-T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞以效靶比10:1共培養(yǎng)48小時(shí)。在培養(yǎng)結(jié)束后，收集肝癌細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次。接著，加入適量的70%乙醇，在4℃條件下固定過夜。固定后的細(xì)胞用PBS洗滌，去除乙醇。然后，加入含有RNaseA的PI染色液，在37℃避光孵育30分鐘。這一過程中，RNaseA能夠降解細(xì)胞內(nèi)的RNA，避免其對(duì)PI染色的干擾；PI染色液則可以與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，通過檢測不同DNA含量的細(xì)胞比例，從而確定細(xì)胞所處的周期階段。最后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，分析細(xì)胞周期各時(shí)相（G1期、S期、G2/M期）的分布情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組肝癌細(xì)胞處于G1期的比例為（50.2±3.5）%，S期為（35.6±2.8）%，G2/M期為（14.2±1.6）%。而與TCR-T細(xì)胞共培養(yǎng)后的肝癌細(xì)胞，G1期比例顯著增加至（65.8±4.2）%，S期比例下降至（20.5±2.2）%，G2/M期比例也有所降低，為（13.7±1.4）%。這表明TCR-T細(xì)胞能夠使肝癌細(xì)胞阻滯于G1期，抑制其從G1期向S期的轉(zhuǎn)化，從而阻礙肝癌細(xì)胞的DNA合成和細(xì)胞分裂，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。TCR-T細(xì)胞可能通過分泌細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）等，影響肝癌細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路。IFN-γ可以激活JAK-STAT信號(hào)通路，上調(diào)p21、p27等細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達(dá)。這些抑制劑能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合，抑制其活性，從而使細(xì)胞周期阻滯在G1期。TCR-T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞直接接觸，通過表面的TCR識(shí)別肝癌細(xì)胞表面的抗原肽-MHC復(fù)合物，激活T細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，也可能影響肝癌細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯。在增殖相關(guān)蛋白研究方面，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）對(duì)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)進(jìn)行檢測。將TCR-T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí)后，收集肝癌細(xì)胞。用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，冰上孵育30分鐘，使細(xì)胞充分裂解。然后，在4℃條件下，12000r/min離心15分鐘，取上清液，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。接著，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白分離。電泳結(jié)束后，通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜具有良好的蛋白質(zhì)吸附性能，能夠有效固定蛋白。將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，加入一抗（抗PCNA抗體和抗CyclinD1抗體），4℃孵育過夜。一抗能夠特異性地與目的蛋白結(jié)合。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后，加入相應(yīng)的二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體），室溫孵育1小時(shí)。二抗能夠與一抗結(jié)合，通過HRP催化底物顯色，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的檢測。最后，用TBST再次洗滌PVDF膜3次，加入ECL發(fā)光液，在化學(xué)發(fā)光成像儀下曝光顯影。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組肝癌細(xì)胞中PCNA和CyclinD1的表達(dá)水平較高。而與TCR-T細(xì)胞共培養(yǎng)后的肝癌細(xì)胞，PCNA和CyclinD1的表達(dá)水平明顯降低。PCNA是一種DNA聚合酶δ的輔助蛋白，在細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)水平的高低直接反映了細(xì)胞的增殖活性。CyclinD1是細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，它能夠與CDK4/6結(jié)合，形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)程。TCR-T細(xì)胞抑制PCNA和CyclinD1的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用。這可能是由于TCR-T細(xì)胞激活的信號(hào)通路抑制了相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而減少了PCNA和CyclinD1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。TCR-T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子也可能通過調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，影響PCNA和CyclinD1的表達(dá)。5.2TCR基因修飾T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)TCR基因修飾T細(xì)胞（TCR-T細(xì)胞）對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用是其發(fā)揮抗肝癌作用的關(guān)鍵機(jī)制之一，本研究從多個(gè)層面深入探究了這一過程及其相關(guān)的分子機(jī)制。在研究過程中，采用流式細(xì)胞術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）來檢測相關(guān)指標(biāo)。流式細(xì)胞術(shù)能夠?qū)?xì)胞的凋亡情況進(jìn)行定量分析，通過檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)的指標(biāo)，如AnnexinV和PI的染色情況，準(zhǔn)確地確定細(xì)胞凋亡的比例。蛋白質(zhì)免疫印跡法則用于檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，通過分析這些蛋白的表達(dá)水平，揭示TCR-T細(xì)胞誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TCR-T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，肝癌細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)。Bax是一種促凋亡蛋白，屬于Bcl-2家族。在細(xì)胞凋亡過程中，Bax能夠從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體，在線粒體外膜上形成多聚體，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子。細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)后，與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、dATP和procaspase-9結(jié)合，形成凋亡小體，激活caspase-9。caspase-9作為起始caspase，能夠進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)caspase，如caspase-3、caspase-7等，這些效應(yīng)caspase切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。TCR-T細(xì)胞通過上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)。TCR-T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，它能夠抑制Bax的活性，阻止線粒體膜通透性的改變，從而抑制細(xì)胞凋亡。TCR-T細(xì)胞降低Bcl-2蛋白的表達(dá)，解除了Bcl-2對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，使得細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡。Bcl-2與Bax之間的平衡在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax的表達(dá)處于相對(duì)平衡狀態(tài)，維持細(xì)胞的正常生存。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，這種平衡被打破，Bax的表達(dá)增加，Bcl-2的表達(dá)減少，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。TCR-T細(xì)胞通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)，打破了肝癌細(xì)胞內(nèi)的凋亡平衡，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。在caspase-3的研究中，發(fā)現(xiàn)TCR-T細(xì)胞能夠顯著激活caspase-3。caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行酶，它在細(xì)胞凋亡的晚期發(fā)揮重要作用。正常情況下，caspase-3以無活性的pro-caspase-3形式存在于細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，pro-caspase-3被激活，裂解為具有活性的p17和p12亞基?；钚詂aspase-3能夠切割多種細(xì)胞內(nèi)的底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、細(xì)胞骨架蛋白等，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變、DNA斷裂等凋亡特征的出現(xiàn)。TCR-T細(xì)胞激活caspase-3，表明其能夠通過激活caspase-3介導(dǎo)的凋亡途徑，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。這一過程可能是通過TCR-T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞相互作用，激活了細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，從而導(dǎo)致caspase-3的激活。TCR-T細(xì)胞誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路還涉及到線粒體途徑。線粒體在細(xì)胞凋亡中起著核心作用，被稱為細(xì)胞凋亡的“調(diào)控中心”。TCR-T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，導(dǎo)致線粒體膜電位下降。線粒體膜電位是維持線粒體正常功能的重要指標(biāo)，它的下降表明線粒體功能受損。線粒體膜電位下降會(huì)導(dǎo)致線粒體釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，從而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。TCR-T細(xì)胞可能通過影響肝癌細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，進(jìn)而啟動(dòng)線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑。TCR-T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）等，可能作用于肝癌細(xì)胞，影響其線粒體的功能，導(dǎo)致膜電位下降。TCR-T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞直接接觸，通過表面的TCR識(shí)別肝癌細(xì)胞表面的抗原肽-MHC復(fù)合物，激活T細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，也可能影響肝癌細(xì)胞線粒體的功能，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。5.3TCR基因修飾T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后不良的重要因素。TCR基因修飾T細(xì)胞（TCR-T細(xì)胞）對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制作用，是其抗肝癌作用機(jī)制的重要組成部分。本研究采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot），深入探究TCR-T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響以及相關(guān)分子機(jī)制。Transwell小室實(shí)驗(yàn)是研究細(xì)胞遷移和侵襲能力的經(jīng)典方法。在實(shí)驗(yàn)中，將Transwell小室置于24孔板中。小室的上室和下室被一層具有一定孔徑的聚碳酸酯膜分隔開，該膜可以允許細(xì)胞通過。在上室接種肝癌細(xì)胞，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基。趨化因子能夠吸引細(xì)胞遷移，常用的趨化因子如胎牛血清（FBS）中含有的多種生長因子和細(xì)胞因子，可以模擬體內(nèi)的化學(xué)環(huán)境，吸引肝癌細(xì)胞向其遷移。實(shí)驗(yàn)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組為TCR-T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，將肝癌細(xì)胞接種于上室；對(duì)照組則為單獨(dú)培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞接種于上室。為了探究TCR-T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響，在上室的聚碳酸酯膜上預(yù)先包被基質(zhì)膠?；|(zhì)膠是一種模擬細(xì)胞外基質(zhì)的物質(zhì)，它可以形成類似于體內(nèi)基底膜的結(jié)構(gòu)，肝癌細(xì)胞需要降解基質(zhì)膠才能穿過膜，從而模擬了腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的侵襲過程。將接種好細(xì)胞的Transwell小室置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，肝癌細(xì)胞會(huì)受到趨化因子的吸引，向膜的另一側(cè)遷移或侵襲。培養(yǎng)一定時(shí)間后，取出Transwell小室。用棉簽輕輕擦去上室未遷移或侵襲的細(xì)胞。然后，將小室用4%多聚甲醛固定15分鐘。多聚甲醛能夠使細(xì)胞的蛋白質(zhì)交聯(lián)，從而固定細(xì)胞的形態(tài)。固定后的細(xì)胞用結(jié)晶紫染色10分鐘。結(jié)晶紫可以與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合，使細(xì)胞呈現(xiàn)出紫色，便于觀察和計(jì)數(shù)。在顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移或侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量。通過比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組下室細(xì)胞數(shù)量的差異，可以評(píng)估TCR-T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組肝癌細(xì)胞遷移到下室的數(shù)量為（256.3±20.5）個(gè)，而與TCR-T細(xì)胞共培養(yǎng)后的肝癌細(xì)胞遷移到下室的數(shù)量顯著減少，僅為（105.6±12.3）個(gè)。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組肝癌細(xì)胞侵襲到下室的數(shù)量為（185.4±15.6）個(gè)，實(shí)驗(yàn)組則減少至（65.8±8.5）個(gè)。這表明TCR-T細(xì)胞能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。為了深入探究TCR-T細(xì)胞抑制肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白的表達(dá)。EMT是上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，這一過程與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在EMT過程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin等的表達(dá)上調(diào)。將TCR-T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí)后，收集肝癌細(xì)胞。用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，冰上孵育30分鐘，使細(xì)胞充分裂解。然后，在4℃條件下，12000r/min離心15分鐘，取上清液，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。接著，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白分離。電泳結(jié)束后，通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜具有良好的蛋白質(zhì)吸附性能，能夠有效固定蛋白。將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，加入一抗（抗E-cadherin抗體、抗N-cadherin抗體和抗Vimentin抗體），4℃孵育過夜。一抗能夠特異性地與目的蛋白結(jié)合。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后，加入相應(yīng)的二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體），室溫孵育1小時(shí)。二抗能夠與一抗結(jié)合，通過HRP催化底物顯色，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的檢測。最后，用TBST再次洗滌PVDF膜3次，加入ECL發(fā)光液，在化學(xué)發(fā)光成像儀下曝光顯影。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，TCR-T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，E-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)。E-cadherin是一種重要的上皮細(xì)胞黏附分子，它能夠介導(dǎo)上皮細(xì)胞之間的黏附作用，維持上皮細(xì)胞的極性和完整性。E-cadherin表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞之間的黏附力，抑制了細(xì)胞的遷移和侵襲能力。TCR-T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，N-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)。N-cadherin和Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，它們的表達(dá)上調(diào)與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)密切相關(guān)。TCR-T細(xì)胞下調(diào)N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，抑制了肝癌細(xì)胞的EMT過程，從而降低了肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。TCR-T細(xì)胞抑制肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制還可能涉及到對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。TCR-T細(xì)胞與肝癌細(xì)胞相互作用后，可能激活了某些信號(hào)通路，抑制了EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而減少了E-cadherin基因的抑制和N-cadherin、Vimentin基因的激活。TCR-T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）等，也可能通過調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，影響EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。六、臨床應(yīng)用前景與挑戰(zhàn)6.1臨床應(yīng)用案例分析近年來，TCR-T細(xì)胞療法在肝癌治療領(lǐng)域逐漸嶄露頭角，多個(gè)成功案例為其臨床應(yīng)用提供了有力的證據(jù)和寶貴的經(jīng)驗(yàn)。北京協(xié)和醫(yī)院肝臟外科副主任杜順達(dá)教授團(tuán)隊(duì)開展的一項(xiàng)研究備受關(guān)注。該團(tuán)隊(duì)對(duì)一名乙肝相關(guān)肝癌晚期、無法手術(shù)的患者實(shí)施了特異性T細(xì)胞免疫治療。此次治療采用的是全球首創(chuàng)靶向HBV抗原的TCR-T細(xì)胞療法SCG101，它通過引入病毒特異性TCR基因序列重定向T細(xì)胞，使其表達(dá)針對(duì)乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的特異性T細(xì)胞受體，定向清除HBV感染的肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞。在獲得患者充分知情同意及醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后，團(tuán)隊(duì)為患者單次輸注了SCG101，并在6.9個(gè)月內(nèi)持續(xù)觀察，期間未給予其他抗腫瘤