T/SZTCMXXX—XXXX前言 錯(cuò)誤！未定義書簽。 錯(cuò)誤！未定義書簽。2規(guī)范性引用文件 錯(cuò)誤！未定義書簽。3術(shù)語(yǔ)和定義 錯(cuò)誤！未定義書簽。4原理 5試劑和耗材制備 6儀器和設(shè)備 7檢驗(yàn)步驟 8結(jié)果判定 9質(zhì)量控制 T/SZTCMXXX—XXXX本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由深圳市藥品檢驗(yàn)研究院（深圳市醫(yī)療器械檢測(cè)中心）提出。本文件由深圳市中藥協(xié)會(huì)歸口。本文件起草單位：深圳市藥品檢驗(yàn)研究院、廣州中醫(yī)藥大學(xué)、中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所、長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)、華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司、深圳市中藥協(xié)會(huì)本文件主要起草人：T/SZTCMXXX—XXXX1哈蟆油中東北林蛙源性成分檢測(cè)快速PCR法本文件規(guī)定了哈蟆油中東北林蛙源性成分的快速PCR檢測(cè)方法。本文件適用于東北林蛙源性成分的鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法《中華人民共和國(guó)藥典》（2025年版一部和四部）3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1哈蟆油RanaeOviductus蛙科動(dòng)物東北林蛙RanadybowskiiGünther雌蛙的干燥輸卵管。3.2濾紙純化法filterpaperpurificationmethod一種利用濾紙作為過(guò)濾介質(zhì)，通過(guò)物理阻隔實(shí)現(xiàn)物質(zhì)分離的方法，可用于快速提取中藥材DNA。3.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）polymerasechainreaction一種用于擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，即DNA片段的特異性體外擴(kuò)增過(guò)程，其特異性依賴于與目的DNA片段兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。3.4瓊脂糖凝膠電泳agarosegelelectrophoresis一種以瓊脂糖為支持介質(zhì)，用于分離大分子核酸的電泳技術(shù)，具有分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，通過(guò)凝膠孔徑差異實(shí)現(xiàn)DNA片段分離。3.5核酸熒光染料nucleicacidfluorescentdye一種對(duì)雙鏈DNA（dsDNA）具有高度選擇性結(jié)合并發(fā)光的生物試劑，可用于dsDNA的熒光檢測(cè)和定量。3.6陽(yáng)性對(duì)照Positivecontrol使用對(duì)照樣品代替檢驗(yàn)樣品同法DNA提取、靶核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)過(guò)程，用于證明鑒定過(guò)程可獲得目標(biāo)核酸片段的操作。3.7陰性對(duì)照Negativecontrol使用常見(jiàn)偽品藥材代替檢驗(yàn)樣品同法DNA提取、靶核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)過(guò)程，用于確認(rèn)檢測(cè)系統(tǒng)能夠滿足哈蟆油鑒別的操作。T/SZTCMXXX—XXXX23.8空白對(duì)照Blankcontrol以水代替檢驗(yàn)樣品同法DNA提取、靶核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)過(guò)程，用以證明提取過(guò)程中沒(méi)有核酸污染的操作。4原理哈蟆油中東北林蛙源性成分快速PCR鑒定應(yīng)采用抽取有代表性的供試品與對(duì)照樣品比較的驗(yàn)證方式，即依據(jù)東北林蛙特異性DNA位點(diǎn)差異，使用SNP（單核苷酸多態(tài)性）標(biāo)記法進(jìn)行鑒定。利用濾紙純化法提取哈蟆油DNA，以哈蟆油DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。5試劑和耗材制備實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682無(wú)菌超純水的要求。5.1動(dòng)物裂解緩沖液含有1.5mol·L-1鹽酸胍（GuHCl）、100mmol·L-1氯化鈉（NaCl）、1%聚山梨酯-20（Tween-20）、50mmol·L-1三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）（pH8.0)、5mmol·L-1乙二胺四乙酸（EDTA）：在300mL50℃左右超純水中溶解71.65gGuHCl，冷卻至室溫后依次加入25mL1mol·L-1Tris-HCl（pH8.0)、0.73gEDTA，攪拌溶解后加超純水定容至500mL，過(guò)濾除菌分裝使用。5.2清洗緩沖液含有10mmol·L-1三羥甲基氨基甲烷（TrispH8.0）、0.1%聚山梨酯-20（Tween-20在800mL超純水中依次加入10mL1mol·L-1Tris（pH8.0)、1mLTween-20，攪拌溶解后加超純水定容至1000mL，過(guò)濾除菌分裝使用。5.3DNA聚合酶預(yù)混液檢測(cè)用DNA聚合酶應(yīng)無(wú)3’→5’核酸外切酶活性。本方法采用的DNA聚合酶預(yù)混液為商品化的DNA聚合酶預(yù)混液，于-20℃下保存，使用時(shí)置于冰上操作。5.4檢測(cè)用引物對(duì)序列RDF：5’-GGACGACCAGATCTACAATGTTATCGTCACT-3’。RDR：5’-ACCTGCTCCAGCTTCAACTGTAGAGGAGGCT-3’。按照引物說(shuō)明書，用無(wú)菌超純水將上述引物溶解至10μmol·L-1，置4℃保存。5.51×TAE（三羥甲基氨基甲烷-冰醋酸-乙二胺四乙酸二鈉）電泳緩沖液取20mL50×TAE電泳緩沖液，加無(wú)菌超純水定容至1000mL。5.6濾紙條用剪刀將濾紙裁剪成44mm×2mm的長(zhǎng)方形濾紙條，將其一端浸入加熱融化的石蠟中，使其晾干后形成40mm×2mm的疏水區(qū)，放入密封袋中干燥保存。6儀器和設(shè)備T/SZTCMXXX—XXXX6.1研磨設(shè)備至少能勻漿20mL的勻漿機(jī)，或至少能研磨20mg的研磨設(shè)備。6.2電子天平最大稱量值至少應(yīng)為1g，可讀性精度至少應(yīng)為1mg。6.3連續(xù)可調(diào)微量移液槍應(yīng)包括0.1μL～2.5μL、0.5μL～10.0μL、10μL～100μL、100μL～1000μL規(guī)格，并包括配套的一次性吸頭。6.4渦旋設(shè)備能渦旋1.5mL和2mL離心管。6.5恒溫加熱設(shè)備溫度范圍應(yīng)包含室溫至100℃。6.6離心設(shè)備能離心200μLPCR管、1.5mL和2mL離心管。6.7核酸檢測(cè)儀波長(zhǎng)范圍應(yīng)包含200nm～400nm，檢測(cè)樣品量至少應(yīng)為0.1μL，檢測(cè)精度應(yīng)不低于2ng·μL-1。6.8保溫設(shè)備應(yīng)包含4℃與-20℃溫區(qū)。6.9PCR儀使用前應(yīng)進(jìn)行溫度校準(zhǔn)。6.10電泳儀電源應(yīng)為具有穩(wěn)壓器的直流電源，電壓100V～500V。6.11凝膠成像系統(tǒng)系統(tǒng)應(yīng)包含密封暗箱、攝像頭、白光和紫外光（UV）254nm、302nm、365nm光源，UV保護(hù)擋板。7檢測(cè)步驟7.1取樣按照《中華人民共和國(guó)藥典》（2025年版四部）藥材和飲片取樣法（通則0211）進(jìn)行取樣。去除藥材和飲片表面附著物，依次使用75%乙醇和無(wú)菌超純水擦拭表面后晾干。7.2粉碎將供試品置于乳缽、勻漿機(jī)或球磨粉碎儀中充分研磨粉碎，必要時(shí)加適量液氮研磨。T/SZTCMXXX—XXXX47.3DNA提取稱取經(jīng)預(yù)處理的供試品25mg置于2.0mL離心管中；加入500μL裂解緩沖液裂解樣品7s，將濾紙條核酸結(jié)合區(qū)浸入裂解液中3s以吸附核酸，再將濾紙條轉(zhuǎn)移至1750μL清洗緩沖液中3s以清洗表面雜質(zhì)，最后將濾紙條轉(zhuǎn)移至配制好的PCR擴(kuò)增體系中3s，以洗脫核酸。每個(gè)供試品應(yīng)設(shè)置兩份平行樣。注：使用濾紙純化法提取的哈蟆油DNA應(yīng)隨提隨用，且無(wú)法調(diào)整和檢測(cè)DNA濃度。7.4PCR擴(kuò)增7.4.1PCR反應(yīng)體系在200μL的PCR管中進(jìn)行，反應(yīng)總體積為50μL，包括DNA聚合酶預(yù)混液25μL，鑒別引物各1μL（10μmol·L-1）,無(wú)菌超純水補(bǔ)足。在體系中洗脫核酸后，將反應(yīng)液充分混勻，瞬時(shí)離心。分別另取對(duì)照藥材和無(wú)菌超純水，同法上述模板DNA檢查PCR反應(yīng)操作，作為陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。7.4.2PCR反應(yīng)參數(shù)PCR反應(yīng)參數(shù)為：98℃變性10s，68℃退火延伸20s，30次循環(huán)。7.5瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)稱取瓊脂糖約0.42g，加入1×TAE電泳緩沖液35mL，加熱至完全溶解，冷卻至65℃左右加入核酸凝膠染色劑（SYBRGreen）1.5μL，充分混勻，小心地倒入內(nèi)槽板上，使膠液緩慢展開(kāi)，直到整個(gè)玻璃板表面形成無(wú)泡均勻膠層，插入梳子，室溫下靜置直至凝膠完全凝固。垂直拔出梳子，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中，添加1×TAE電泳緩沖液至沒(méi)過(guò)膠面約3mm處。在Parafilm上將擴(kuò)增產(chǎn)物5μL與Loadingbuffer混合后加入點(diǎn)樣孔中。調(diào)節(jié)電壓至120V,電泳約20min。將凝膠轉(zhuǎn)移至紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察。8結(jié)果判定在陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果符合規(guī)定的情況下，若供試品凝膠電泳圖譜中，在100~250bp之間出現(xiàn)與哈蟆油對(duì)照藥材相同的單一DNA條帶則判定測(cè)試結(jié)果為陽(yáng)性，否則為陰性。9質(zhì)量控制檢測(cè)結(jié)果應(yīng)來(lái)自同一實(shí)驗(yàn)室供試品的兩份平行樣。當(dāng)一