基于環(huán)介導等溫擴增技術的沙門氏菌精準檢測方法構建與驗證一、引言1.1研究背景沙門氏菌（Salmonella）作為腸桿菌科中一類重要的革蘭氏陰性菌，是全球范圍內引發(fā)食源性疾病的主要病原菌之一，對人類健康和食品安全構成了嚴重威脅。沙門氏菌血清型繁雜，目前已鑒定出超過2500種，廣泛分布于自然界，常見于人和動物的腸道內，家禽、家畜以及寵物等均可能成為其天然宿主。據WHO食源性疾病監(jiān)控計劃統(tǒng)計，非傷寒沙門氏菌每年導致9380萬人感染，其中食源性感染病例達8030萬，致使15.5萬人喪生。在中國，70%-80%的細菌性食源性疾病由沙門氏菌感染引起，且90%涉及肉、奶、蛋等畜產品。感染沙門氏菌后，患者通常在6-72小時內出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等胃腸道癥狀，嚴重時可引發(fā)脫水、電解質紊亂、敗血癥、腦膜炎等并發(fā)癥，尤其對兒童、老年人和免疫力低下人群危害更大。例如，2018年美國發(fā)生的多起沙門氏菌感染事件，波及多個州，導致大量人員患病，相關食品被召回，造成了巨大的經濟損失和社會影響。傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測方法，如ISO6579：2002《食品和動物飼料微生物學沙門氏菌檢測》以及GB4789.4—2016《食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》所采用的方法，主要包括前增菌、選擇性增菌、菌落形態(tài)觀察、生化和血清分型鑒定等步驟。這些方法雖可靠性高，但操作繁瑣，需耗費數天時間才能得出結果，難以滿足現(xiàn)代食品安全快速檢測的需求。免疫學檢測方法，如酶聯(lián)免疫法（ELISA），因特異性較低，應用受到限制，且該方法需要大量目標病原體，易出現(xiàn)假陽性或假陰性結果。基于分子生物學的聚合酶鏈式反應（PCR）和實時熒光定量PCR（real-timePCR）等技術，雖能將檢測時間縮短至3天以內，但仍需額外的樣品前處理以消除擴增抑制，對實驗條件和操作人員要求較高，且易受化合物污染和抑制的影響，同時還需凝膠電泳和擴展測序或建立real-timePCR體系來完成檢測，成本較高，流程復雜。隨著生物技術的不斷發(fā)展，環(huán)介導等溫擴增技術（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）應運而生，為沙門氏菌的快速檢測提供了新的解決方案。LAMP技術由Notomi等在2000年率先建立，是一種新型的核酸體外擴增技術。該技術在恒溫條件下，利用BstDNA聚合酶和針對目標基因6個特定區(qū)域設計的4條引物（2條內引物和2條外引物）進行擴增反應。與傳統(tǒng)檢測方法相比，LAMP技術具有特異性強、靈敏度高、操作簡單、成本低、反應速度快等顯著優(yōu)點，無需特殊設備，可在1小時內完成擴增反應。自2005年Hara-Kudo首次報道LAMP技術用于沙門氏菌檢測以來，該技術在食品沙門氏菌檢測領域得到了廣泛研究和應用，展現(xiàn)出良好的發(fā)展前景。因此，建立基于LAMP技術的沙門氏菌檢測方法，對于提高沙門氏菌檢測效率、保障食品安全具有重要的現(xiàn)實意義。1.2研究目的與意義本研究旨在建立一種基于環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）的沙門氏菌快速檢測方法，并對其反應條件進行優(yōu)化，同時對該方法的特異性、靈敏度和實際應用效果進行系統(tǒng)評估。通過本研究，期望獲得一種操作簡便、快速高效、特異性強且靈敏度高的沙門氏菌檢測技術，為食品安全檢測、臨床診斷以及公共衛(wèi)生監(jiān)測等領域提供有力的技術支持。建立基于LAMP技術的沙門氏菌檢測方法具有重要的現(xiàn)實意義，具體體現(xiàn)在以下幾個方面：保障食品安全：在食品生產、加工、流通等環(huán)節(jié)，快速準確地檢測出沙門氏菌，能夠及時發(fā)現(xiàn)被污染的食品，防止其流入市場，從而有效降低食源性疾病的發(fā)生風險，保障消費者的飲食安全和身體健康。以2018年美國發(fā)生的多起沙門氏菌感染事件為例，因沙門氏菌污染導致大量食品被召回，不僅給消費者健康帶來威脅，也給相關企業(yè)造成了巨大的經濟損失。若當時有高效的LAMP檢測技術，便能及時發(fā)現(xiàn)問題，避免此類事件的大規(guī)模爆發(fā)。提高檢測效率：與傳統(tǒng)檢測方法相比，LAMP技術可在恒溫條件下快速完成擴增反應，無需復雜的溫度循環(huán)設備，大大縮短了檢測時間，能夠滿足現(xiàn)代食品安全快速檢測的需求。例如，在食品進出口檢驗檢疫、餐飲企業(yè)食材快速篩查等場景中，LAMP技術的快速性優(yōu)勢可使檢測流程大幅簡化，提高工作效率。降低檢測成本：LAMP技術所需的儀器設備簡單，對實驗條件和操作人員的要求相對較低，減少了檢測過程中的設備投入和人力成本。這使得該技術更易于在基層實驗室、小型檢測機構以及現(xiàn)場檢測中推廣應用，有助于擴大沙門氏菌檢測的覆蓋范圍。在一些資源有限的地區(qū)，傳統(tǒng)檢測方法因設備昂貴、操作復雜難以開展，而LAMP技術則可憑借其低成本優(yōu)勢，為當地食品安全檢測提供可行的解決方案。疾病防控與監(jiān)測：在臨床診斷中，快速檢測出沙門氏菌有助于醫(yī)生及時準確地診斷疾病，為患者提供及時有效的治療，減少并發(fā)癥的發(fā)生，降低死亡率。在公共衛(wèi)生監(jiān)測方面，LAMP技術能夠快速篩查環(huán)境樣本、水源等中的沙門氏菌，為疫情防控提供及時準確的信息，有助于制定科學合理的防控措施，防止疫情的擴散和蔓延。在疫情爆發(fā)初期，通過LAMP技術快速檢測環(huán)境樣本中的沙門氏菌，可及時追蹤傳染源，切斷傳播途徑，有效控制疫情發(fā)展。1.3研究方法與技術路線本研究主要采用以下實驗方法和技術路線，旨在建立一套高效、準確的基于環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）的沙門氏菌檢測方法。引物設計：運用在線引物設計軟件，如PrimerExplorerV5等，依據沙門氏菌的特異性基因序列，通常選取侵襲蛋白基因（invA）等高度保守且特異性強的基因區(qū)域。針對目標基因的6個特定區(qū)域，精心設計4條引物，包括2條內引物（FIP和BIP）和2條外引物（F3和B3）。為進一步提升擴增效率，可考慮設計2條環(huán)引物（LoopF和LoopB）。設計完成后，將引物序列交由專業(yè)生物公司進行合成。反應體系優(yōu)化：對LAMP反應體系中的關鍵成分濃度進行系統(tǒng)優(yōu)化，包括dNTP濃度、Mg2?濃度、內引物濃度、外引物濃度以及BstDNA聚合酶用量等。通過設置一系列不同濃度梯度的實驗組，如dNTP濃度設置為0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L等，Mg2?濃度設置為2.0mmol/L、4.0mmol/L、6.0mmol/L、8.0mmol/L、10.0mmol/L等，內引物濃度設置為0.8μmol/L、1.2μmol/L、1.6μmol/L、2.0μmol/L等，外引物濃度設置為0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L等，BstDNA聚合酶用量設置為1U、2U、3U、4U、5U等。以沙門氏菌標準菌株DNA為模板，在相同的恒溫反應條件下進行擴增反應，通過凝膠電泳或熒光檢測等方法分析擴增結果，確定各成分的最佳濃度組合。同時，對反應溫度和時間也進行優(yōu)化，反應溫度設置為60℃、62℃、64℃、65℃、66℃等，反應時間設置為30min、45min、60min、75min、90min等，篩選出最適的反應溫度和時間，以獲得最佳的擴增效果和特異性。特異性實驗：收集多種與沙門氏菌相近的腸道細菌菌株，如大腸桿菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌等，提取這些菌株的基因組DNA作為模板。在優(yōu)化后的LAMP反應體系和條件下，分別對各菌株DNA進行擴增反應。通過凝膠電泳分析擴增產物，若只有沙門氏菌的擴增結果為陽性，即出現(xiàn)特異性的梯形條帶，而其他非沙門氏菌菌株的擴增結果均為陰性，則表明所建立的LAMP檢測方法具有良好的特異性。靈敏度實驗：將沙門氏菌標準菌株進行梯度稀釋，制備成不同濃度的菌液，如10?CFU/mL、101CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、10?CFU/mL、10?CFU/mL等。提取各濃度菌液的DNA作為模板，在優(yōu)化后的LAMP反應體系和條件下進行擴增反應。同時，設置PCR擴增作為對照實驗。擴增結束后，通過凝膠電泳或熒光定量檢測等方法，比較LAMP方法和PCR方法對不同濃度沙門氏菌DNA的檢測能力，確定LAMP檢測方法的靈敏度。以能檢測到陽性擴增結果的最低菌液濃度作為該方法的檢測限，評估其靈敏度水平。實際樣品檢測：采集多種實際樣品，如肉類、蛋類、奶類、蔬菜類等食品樣品，以及水源、環(huán)境拭子等樣品。采用合適的方法對樣品中的微生物進行富集和DNA提取。在優(yōu)化后的LAMP反應體系和條件下，對提取的樣品DNA進行擴增反應。同時，按照國家標準方法（如GB4789.4—2016《食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》）對相同樣品進行傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測，作為對照。對比LAMP方法和傳統(tǒng)檢測方法的檢測結果，評估LAMP檢測方法在實際樣品檢測中的準確性、可靠性和實用性。若LAMP方法的檢測結果與傳統(tǒng)方法具有較高的一致性，且具有操作簡便、檢測快速等優(yōu)勢，則表明該方法具有良好的實際應用價值。本研究的技術路線如圖1所示：首先進行文獻調研，了解沙門氏菌檢測的研究現(xiàn)狀以及LAMP技術的相關原理和應用情況；接著進行引物設計與合成；然后對反應體系和條件進行優(yōu)化；之后開展特異性和靈敏度實驗；最后進行實際樣品檢測，并對建立的方法進行全面評價和總結。[此處插入技術路線圖1，圖中應清晰展示從文獻調研到實際樣品檢測及方法評價的各個步驟和流程，包括各步驟之間的邏輯關系和先后順序]二、沙門氏菌概述2.1生物學特性沙門氏菌（Salmonella）是一類重要的革蘭氏陰性菌，屬于腸桿菌科沙門氏菌屬。其在生物學特性上展現(xiàn)出諸多獨特之處，對深入了解該菌的致病機制、傳播途徑以及檢測方法的建立具有重要意義。2.1.1形態(tài)與結構沙門氏菌呈直桿狀，大小通常為（0.7-1.5）μm×（2.0-5.0）μm，形態(tài)與大腸桿菌相似。細胞無芽孢，除雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌外，其余多數菌株周身具有鞭毛，能進行運動，這使得它們在環(huán)境中具有更強的擴散和感染能力。多數菌株還具有菌毛，菌毛能夠幫助細菌吸附于宿主細胞表面，是其感染宿主的重要結構之一。在革蘭氏染色中，沙門氏菌呈現(xiàn)為紅色，表明其細胞壁結構的特殊性，革蘭氏陰性菌的細胞壁由一層薄的肽聚糖層和外膜組成，外膜中含有脂多糖等成分，這些結構與細菌的致病性和抗原性密切相關。[此處插入沙門氏菌的電鏡圖片，圖片應清晰展示其直桿狀形態(tài)、周身鞭毛和菌毛結構，標注各結構名稱]2.1.2生長特性沙門氏菌為需氧或兼性厭氧菌，對營養(yǎng)要求不高，在普通瓊脂培養(yǎng)基上便能良好生長。在普通瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后，會形成中等大小、圓形、表面光滑、無色半透明、邊緣整齊的菌落，其菌落特征與大腸桿菌相似，但無糞臭味。在液體培養(yǎng)基中，沙門氏菌呈均勻混濁生長。其生長溫度范圍較廣，在10℃-42℃條件下均能生長，最適生長溫度為37℃，這與人體的體溫相近，使其能夠在人體腸道內適宜生長繁殖。適宜的pH范圍為6.8-7.8。此外，沙門氏菌具有較強的環(huán)境適應能力，在水中可存活2-3周，在糞便中能存活1-2個月，在牛乳或肉類食品中可存活數月，且具有很強的抗寒能力，在-25℃的低溫條件下，存活時間可達10個月之久，但耐熱性差，55℃、1h或60℃、15-30min即可被殺死。[此處插入沙門氏菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上的菌落圖片，圖片應清晰展示菌落的形態(tài)、大小、顏色等特征，標注培養(yǎng)基名稱和培養(yǎng)時間]2.1.3生化反應沙門氏菌的生化反應具有一定的特征性，可用于其鑒定和分類。絕大多數沙門氏菌能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇和山梨醇并產生氣體，但不發(fā)酵乳糖、蔗糖和側金盞花醇。它們不產吲哚，V-P反應陰性，不水解尿素，對苯丙氨酸不脫氨。在三糖鐵瓊脂試驗中，沙門氏菌可使斜面為紅色，底部變黑并產氣，這是由于其發(fā)酵葡萄糖產酸產氣，且部分菌株能產生硫化氫，硫化氫與培養(yǎng)基中的鐵離子反應生成黑色的硫化鐵沉淀。這些生化反應特征有助于將沙門氏菌與其他腸道菌進行區(qū)分，在傳統(tǒng)的細菌鑒定方法中具有重要作用。2.1.4抗原結構沙門氏菌的抗原結構復雜，主要由O抗原、H抗原和毒力Vi抗原三種組成。O抗原：即菌體抗原，是細胞壁的脂多糖成分，能耐受100℃達數小時，也不被酒精或0.1%石炭酸所破壞。沙門氏菌屬的菌體抗原有58種，以阿拉伯數字依次標記。根據沙門氏菌有共同的O抗原這一特點，分類學者將有共同抗原的細菌歸為一組，使沙門氏菌分成42個群（或組），即A、B、C……Z和O16-O67群。每群都有群特異性抗原，如A群O2、B群04、D群O9等。O抗原是沙門氏菌分群的重要依據，不同群的沙門氏菌在致病性和流行病學特征上可能存在差異。H抗原：即鞭毛抗原，為蛋白質，對熱不穩(wěn)定，65℃15min或純酒精處理后即被破壞。H抗原是定型的依據，有兩相，第一相為特異性抗原，用a、b、c……表示；第二相為共同抗原，用1、2、3……表示。具有第1相和第2相抗原的細菌稱為雙相菌，僅有其中一相抗原者稱為單相菌。H抗原的不同組合決定了沙門氏菌的不同血清型，目前已鑒定出超過2500種血清型，這使得沙門氏菌的檢測和防控面臨更大的挑戰(zhàn)。Vi抗原：部分菌株具有Vi抗原，如傷寒與丙型副傷寒沙門氏菌的某些菌株。Vi抗原存在于O抗原的外層，它能阻礙O抗原與相應抗體的特異性結合。Vi抗原與細菌的毒力有關，具有Vi抗原的菌株毒力相對較強，在感染過程中可能發(fā)揮重要作用。2.2對人類健康的影響沙門氏菌是一種極具威脅的食源性病原菌，每年在全球范圍內引發(fā)大量感染病例，嚴重危害人類健康。它主要通過污染食品和水源，經口進入人體，引發(fā)一系列健康問題。2.2.1感染癥狀沙門氏菌感染人體后，癥狀表現(xiàn)多樣，其中急性胃腸炎最為常見?；颊咄ǔＴ跀z入被污染食物后的6-72小時內發(fā)病，初期常出現(xiàn)畏寒、發(fā)熱癥狀，體溫可達38℃-39℃。同時，伴有嚴重的胃腸道癥狀，如惡心、嘔吐，頻繁的嘔吐會導致患者體內電解質失衡，進一步影響身體的正常代謝。腹痛也是常見癥狀之一，疼痛程度因人而異，多為陣發(fā)性絞痛。腹瀉頻繁，每日排便次數可達3-5次甚至數十次，大便多為水樣便，量多且糞質少，常含有少量黏液，伴有惡臭，偶爾也會出現(xiàn)黏液膿血便。對于癥狀較輕的患者，可能僅表現(xiàn)為輕度腹瀉，無發(fā)熱癥狀；而重癥患者則可能呈爆發(fā)型，出現(xiàn)嚴重脫水、電解質紊亂以及循環(huán)衰竭等癥狀，若不及時治療，可能危及生命。例如，在一些衛(wèi)生條件較差的地區(qū)，兒童和老年人感染沙門氏菌后，由于自身免疫力較弱，更容易發(fā)展為重癥，導致較高的死亡率。除急性胃腸炎外，沙門氏菌感染還可能引發(fā)菌血癥（或敗血癥）。多由豬霍亂或C組傷寒沙門菌引起，患者一般無明顯胃腸癥狀，但會出現(xiàn)高熱、寒戰(zhàn)等全身性癥狀。細菌隨血流擴散，可引發(fā)膽囊炎、腎盂炎、骨髓炎等局部感染。此時，血培養(yǎng)常為陽性，這是診斷菌血癥的重要依據之一。在菌血癥的治療過程中，由于細菌在血液中大量繁殖，容易引發(fā)全身炎癥反應綜合征，導致多個器官功能受損。傷寒和副傷寒也是沙門氏菌感染的嚴重類型。傷寒與副傷寒的發(fā)病機制和臨床癥狀基本相似，但副傷寒的病情相對較輕，病程較短。細菌隨污染的食物或飲水進入人體后，在腸道內大量繁殖，隨后經淋巴系統(tǒng)進入血液，造成一過性菌血癥。細菌隨血流進一步進入肝、脾、膽囊、腎臟、骨髓、腸壁與淋巴結等組織器官中大量繁殖，引發(fā)患者寒戰(zhàn)、高熱，體溫可高達39℃-40℃，呈稽留熱型。同時，患者還會出現(xiàn)肝脾腫大、全身中毒癥狀，如精神萎靡、乏力、食欲不振等。皮膚玫瑰疹是傷寒的典型癥狀之一，多在發(fā)病后第6-10天出現(xiàn)，表現(xiàn)為淡紅色的小斑丘疹，直徑約2-4mm，壓之褪色，主要分布于胸、腹、背部及四肢。此外，患者還可能出現(xiàn)遲發(fā)型變態(tài)反應等。傷寒和副傷寒的并發(fā)癥較為嚴重，包括腸穿孔、血栓性靜脈炎、膽囊炎、肺炎、心內膜炎等局部感染。其中，腸穿孔是傷寒最嚴重的并發(fā)癥之一，發(fā)生率約為1%-4%，多發(fā)生于病程的第2-3周，表現(xiàn)為突然出現(xiàn)的劇烈腹痛、腹脹，伴有惡心、嘔吐，嚴重時可導致感染性休克。典型病程通常為3-4周，嚴重感染可危及生命。感染后能獲得牢固免疫，極少發(fā)生再感染。在一些衛(wèi)生條件落后、公共衛(wèi)生設施不完善的地區(qū)，傷寒和副傷寒的發(fā)病率仍然較高，對當地居民的健康構成嚴重威脅。病菌攜帶者也是沙門氏菌感染的一種特殊情況。傷寒感染臨床治愈后約3％患者膽囊?guī)Ь?，可持續(xù)由糞便排泄達1年或1年以上。這些病菌攜帶者雖然自身可能沒有明顯的癥狀，但卻是重要的感染源，可通過污染食物和水源，將沙門氏菌傳播給他人。在食品加工、餐飲服務等行業(yè)中，若有病菌攜帶者從事相關工作，極易引發(fā)大規(guī)模的沙門氏菌感染事件。2.2.2發(fā)病機制沙門氏菌的致病機制較為復雜，涉及多個毒力因子和感染過程。當沙門氏菌經口進入人體后，首先需要突破胃腸道的防御屏障。其周身的鞭毛和菌毛在這一過程中發(fā)揮重要作用。鞭毛使細菌能夠在腸道內運動，尋找合適的黏附位點；菌毛則幫助細菌吸附于腸道上皮細胞表面，增強細菌與宿主細胞的黏附能力。細菌通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）將一系列效應蛋白注入宿主細胞內，這些效應蛋白能夠干擾宿主細胞的信號傳導通路，破壞細胞的正常生理功能。例如，效應蛋白可以調節(jié)宿主細胞的肌動蛋白細胞骨架，促進細菌的內化，使其能夠進入腸道上皮細胞。進入細胞內的沙門氏菌在吞噬體中存活并繁殖，逃避宿主免疫系統(tǒng)的識別和清除。沙門氏菌能夠利用宿主細胞的營養(yǎng)物質進行生長和繁殖，同時通過分泌毒力因子，如脂多糖（LPS）、腸毒素等，進一步損傷宿主細胞。LPS是沙門氏菌細胞壁的主要成分之一，具有很強的毒性。當細菌裂解時，LPS被釋放到周圍環(huán)境中，能夠激活宿主的免疫系統(tǒng)，引發(fā)炎癥反應。大量的炎癥細胞聚集在感染部位，釋放炎癥介質，導致腸道黏膜受損，出現(xiàn)腹瀉、腹痛等癥狀。腸毒素則可以作用于腸道上皮細胞，改變細胞的離子轉運和分泌功能，導致腸道內液體分泌增加，加重腹瀉癥狀。在感染過程中，沙門氏菌還可能侵入血液，引發(fā)全身性感染。細菌通過破壞腸道上皮細胞的緊密連接，進入腸黏膜下的毛細血管和淋巴管，進而進入血液循環(huán)。在血液中，沙門氏菌繼續(xù)繁殖，并隨血流擴散到全身各個組織器官，引發(fā)菌血癥、敗血癥等嚴重疾病。免疫系統(tǒng)在對抗沙門氏菌感染的過程中也發(fā)揮著重要作用。巨噬細胞、中性粒細胞等免疫細胞能夠識別和吞噬沙門氏菌，但沙門氏菌具有一定的抗吞噬能力，能夠在吞噬細胞內存活并繁殖，從而逃避免疫系統(tǒng)的清除。同時，免疫系統(tǒng)產生的細胞因子和抗體等免疫分子也參與了對沙門氏菌的免疫應答，但在某些情況下，過度的免疫反應可能會導致組織損傷和器官功能障礙。2.2.3全球感染現(xiàn)狀及危害沙門氏菌感染在全球范圍內廣泛分布，是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題。據WHO食源性疾病監(jiān)控計劃統(tǒng)計，非傷寒沙門氏菌每年導致9380萬人感染，其中食源性感染病例達8030萬，致使15.5萬人喪生。在發(fā)展中國家，由于衛(wèi)生條件較差、食品安全監(jiān)管體系不完善等原因，沙門氏菌感染的發(fā)病率和死亡率相對較高。例如，在一些非洲和亞洲的貧困地區(qū)，兒童和老年人是沙門氏菌感染的高危人群，由于缺乏及時有效的治療，許多患者病情惡化，甚至失去生命。在發(fā)達國家，雖然衛(wèi)生條件和醫(yī)療水平較高，但沙門氏菌感染仍然時有發(fā)生。如2018年美國發(fā)生的多起沙門氏菌感染事件，波及多個州，導致大量人員患病，相關食品被召回，造成了巨大的經濟損失和社會影響。這些事件不僅給患者的健康帶來了嚴重威脅，也對食品行業(yè)的聲譽和經濟發(fā)展造成了負面影響。在中國，沙門氏菌也是引起食源性疾病的主要病原菌之一。據統(tǒng)計，70%-80%的細菌性食源性疾病由沙門氏菌感染引起，且90%涉及肉、奶、蛋等畜產品。隨著人們生活水平的提高和飲食結構的改變，對畜產品的消費量不斷增加，這也增加了沙門氏菌感染的風險。例如，一些小型養(yǎng)殖場衛(wèi)生條件差，畜禽易感染沙門氏菌，這些被污染的畜產品進入市場后，容易引發(fā)消費者感染。此外，在食品加工、儲存和銷售過程中，如果衛(wèi)生操作不規(guī)范，也容易導致沙門氏菌污染和傳播。沙門氏菌感染不僅給患者帶來身體上的痛苦和經濟負擔，還對社會的穩(wěn)定和發(fā)展產生一定的影響。為了預防和控制沙門氏菌感染，需要加強食品安全監(jiān)管，提高公眾的食品安全意識，加強衛(wèi)生教育，改善衛(wèi)生條件，同時不斷研發(fā)和應用更加快速、準確的檢測技術，以便及時發(fā)現(xiàn)和控制沙門氏菌污染。2.3傳統(tǒng)檢測方法及其局限性傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測方法主要包括細菌培養(yǎng)法、生化檢測法和免疫學檢測法，這些方法在沙門氏菌檢測領域曾發(fā)揮重要作用，但隨著科技的發(fā)展和檢測需求的提高，其局限性也日益凸顯。細菌培養(yǎng)法是檢測沙門氏菌的經典方法，也是目前國家標準和國際標準所采用的常規(guī)方法。以ISO6579：2002《食品和動物飼料微生物學沙門氏菌檢測》以及GB4789.4—2016《食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》為例，其檢測流程通常包括前增菌、選擇性增菌、菌落形態(tài)觀察、生化和血清分型鑒定等多個步驟。前增菌階段，將樣品接種于緩沖蛋白胨水（BPW）等培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)18-24小時，目的是使受傷的沙門氏菌恢復活力。隨后進行選擇性增菌，分別轉種于四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液和亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液，TTB于42℃培養(yǎng)18-24小時，SC于36℃培養(yǎng)18-24小時，以抑制雜菌生長，促進沙門氏菌的增殖。接著，將增菌液劃線接種于BS瓊脂平板、XLD瓊脂平板（或HE瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）等選擇性培養(yǎng)基上，36℃培養(yǎng)18-48小時，根據菌落形態(tài)初步篩選可疑菌落。例如，在BS瓊脂平板上，沙門氏菌菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；在XLD瓊脂平板上，菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落。挑取可疑菌落進行純培養(yǎng)后，還需進行生化鑒定和血清分型鑒定。生化鑒定通過檢測細菌對各種糖類、蛋白質的分解能力以及其他生化反應特征，如三糖鐵瓊脂試驗、靛基質試驗、尿素酶試驗、氰化鉀試驗、賴氨酸脫羧酶試驗等，來確定是否為沙門氏菌。血清分型鑒定則利用沙門氏菌的抗原結構，通過與相應的抗血清進行凝集反應，確定其血清型。這種方法雖然可靠性高，被視為檢測沙門氏菌的“金標準”，但其操作過程繁瑣，需要經過多步培養(yǎng)和鑒定，整個檢測周期較長，通常需要4-7天才能得出結果。在實際應用中，如食品加工企業(yè)的原材料快速篩查、疫情爆發(fā)時的緊急檢測等場景下，這種長時間的檢測周期無法滿足快速決策和及時防控的需求，可能導致被污染的食品流入市場，引發(fā)食源性疾病的傳播。生化檢測法主要是基于沙門氏菌的生化反應特性進行檢測。如前文所述，沙門氏菌具有特定的生化反應特征，不發(fā)酵乳糖、蔗糖和側金盞花醇，能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇和山梨醇并產生氣體，不產吲哚，V-P反應陰性，不水解尿素，對苯丙氨酸不脫氨等。在三糖鐵瓊脂試驗中，沙門氏菌可使斜面為紅色，底部變黑并產氣。通過觀察細菌在這些生化試驗中的反應結果，可初步判斷是否為沙門氏菌。然而，腸桿菌科細菌之間的生化反應存在一定的交叉性。一些與沙門氏菌相近的細菌，如某些大腸桿菌、變形桿菌等，可能具有相似的生化反應特征，容易導致誤判。這使得生化檢測法的特異性受到影響，在實際檢測中，可能會出現(xiàn)將其他細菌誤判為沙門氏菌的情況，或者漏檢真正的沙門氏菌，從而影響檢測結果的準確性。免疫學檢測法是利用抗原抗體特異性結合的原理，通過檢測樣品中的沙門氏菌抗原或抗體來判斷是否感染。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是常用的免疫學檢測方法之一，它將沙門氏菌的特異性抗原或抗體固定在固相載體上，加入待檢樣品，若樣品中含有相應的抗體或抗原，則會與固相載體上的抗原或抗體結合，再加入酶標記的第二抗體或抗原，通過酶催化底物顯色來判斷結果。這種方法操作相對簡便，特異性較強，靈敏度也較高，能夠在較短時間內獲得檢測結果。然而，免疫學檢測法也存在一些局限性。一方面，其檢測結果容易受到多種因素的影響，如樣品中的雜質、抗體的質量和特異性等，可能導致假陽性或假陰性結果的出現(xiàn)。另一方面，該方法需要大量的目標病原體，對于低濃度的沙門氏菌感染，檢測靈敏度可能不足。此外，免疫學檢測法只能檢測出樣品中是否存在沙門氏菌抗原或抗體，但無法確定沙門氏菌的具體血清型，對于疫情溯源和防控的作用相對有限。綜上所述，傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測方法在檢測時間、操作復雜性、準確性等方面存在諸多局限性，難以滿足現(xiàn)代食品安全快速檢測和臨床診斷的需求。因此，開發(fā)更加快速、準確、簡便的新型檢測方法具有重要的現(xiàn)實意義。三、環(huán)介導等溫擴增技術原理與特點3.1LAMP技術原理環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP）是一種新型的核酸體外擴增技術，由日本學者Notomi等在2000年首次報道。該技術的核心在于針對靶基因的6個特定區(qū)域，精心設計4條特異性引物，分別為上游內引物（ForwardInnerPrimer，F(xiàn)IP）、下游內引物（BackwardInnerPrimer，BIP）、外引物（F3與B3），并利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶，在恒溫條件下實現(xiàn)對核酸的高效擴增。在引物設計方面，F(xiàn)IP由F2區(qū)和F1c區(qū)域組成，其中F2區(qū)與靶基因3’端的F2c區(qū)域互補，F(xiàn)1c區(qū)與靶基因5’端的F1c區(qū)域序列相同；BIP由B1c和B2區(qū)域組成，B2區(qū)與靶基因3’端的B2c區(qū)域互補，B1c區(qū)域與靶基因5’端的B1c區(qū)域序列相同；F3引物由F3區(qū)組成，與靶基因的F3c區(qū)域互補；B3引物由B3區(qū)域組成，和靶基因的B3c區(qū)域互補。這4條引物能夠特異性識別靶序列上的6個獨立區(qū)域，為后續(xù)的擴增反應奠定了基礎。LAMP擴增反應主要分為三個關鍵步驟：起始結構產生、啞鈴狀結構生成和循環(huán)擴增階段。在起始結構產生階段，反應首先由外引物B3與模板DNA的B3c區(qū)域互補結合，在BstDNA聚合酶的作用下，擴增出互補鏈。隨后，F(xiàn)IP中的F2區(qū)與靶基因3’端的F2c區(qū)域互補結合，啟動靶序列合成。由于外部引物F3比FIP堿基少，且濃度更低，F(xiàn)3與互補序列中F3c雜交，并啟動鏈置換DNA合成，在一端形成環(huán)狀結構。接著進入啞鈴狀結構生成階段，在此基礎上，BIP及B3分別引發(fā)DNA合成。BIP中的B2區(qū)與靶基因3’端的B2c區(qū)域互補結合，進行DNA合成，同時FIP合成的鏈被置換出來。最終，形成了具有兩個環(huán)的啞鈴狀結構，這種結構為后續(xù)的循環(huán)擴增提供了模板。在循環(huán)擴增階段，內部引物與產物上的環(huán)雜交并合成置換DNA，生成新的莖環(huán)DNA。具體來說，F(xiàn)IP與啞鈴狀結構上的F1c環(huán)雜交，進行DNA合成，置換出原來的鏈，形成新的莖環(huán)結構；BIP與B1c環(huán)雜交，同樣進行DNA合成和鏈置換。如此反復循環(huán)，DNA不斷擴增，最終產生花椰菜多環(huán)結構及重復反向的莖環(huán)結構。由于LAMP反應過程中有多種產物產生，所以反應結束后對反應產物進行電泳，會出現(xiàn)特征性的階梯狀條帶。LAMP技術在擴增過程中，不需要像傳統(tǒng)PCR技術那樣進行模板的熱變性和長時間的溫度循環(huán)。它利用BstDNA聚合酶的鏈置換活性，在恒溫條件下（通常為60-65℃）即可完成擴增反應，大大縮短了擴增時間，一般可在15-60分鐘內實現(xiàn)10^9-10^10倍的核酸擴增。同時，該技術在DNA合成時，從脫氧核糖核酸三磷酸底物（dNTPs）中析出的焦磷酸離子與反應溶液中的鎂離子反應，產生大量焦磷酸鎂沉淀。通過肉眼觀察白色渾濁沉淀的生成，或者使用濁度儀檢測沉淀的混濁度，就能簡便地鑒定擴增是否發(fā)生。此外，還可以在反應管中加入熒光染色試劑，在紫外燈下觀察，對反應產物進行實時監(jiān)測。[此處插入LAMP技術擴增原理示意圖，清晰展示引物與靶基因結合、各階段產物形成過程，標注各引物、基因區(qū)域和產物結構名稱]3.2LAMP技術特點環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）自問世以來，憑借其獨特的技術原理，展現(xiàn)出一系列顯著的特點，使其在眾多核酸擴增技術中脫穎而出，成為近年來研究和應用的熱點。3.2.1特異性強LAMP技術的高特異性源于其獨特的引物設計。該技術針對靶基因的6個特定區(qū)域設計4條特異性引物（FIP、BIP、F3、B3），若考慮使用環(huán)引物，還會設計LoopF和LoopB兩條引物。這些引物能夠特異性識別靶序列上的多個獨立區(qū)域，極大地降低了非特異性擴增的概率。以沙門氏菌檢測為例，通過精心選擇沙門氏菌的侵襲蛋白基因（invA）等高度保守且特異性強的基因區(qū)域，設計與之匹配的引物。這些引物與沙門氏菌的靶基因區(qū)域精確互補結合，只有當樣品中存在沙門氏菌且靶基因序列與引物設計區(qū)域高度匹配時，才能啟動LAMP擴增反應。相比之下，傳統(tǒng)PCR技術通常僅針對靶基因的2個區(qū)域設計引物，在引物識別的序列數量和特異性上，LAMP技術具有明顯優(yōu)勢。在實際檢測中，當使用LAMP技術檢測含有多種細菌的混合樣品時，能夠準確地對沙門氏菌進行擴增，而不會對其他細菌產生非特異性擴增，從而有效避免了誤判，提高了檢測結果的準確性。3.2.2靈敏度高LAMP技術在靈敏度方面表現(xiàn)卓越，其擴增效率極高，一般可在15-60分鐘內實現(xiàn)10^9-10^10倍的核酸擴增。這使得它能夠檢測到極低濃度的靶核酸。許多研究表明，LAMP技術對沙門氏菌的檢測靈敏度相較于傳統(tǒng)PCR技術可提高1-3個數量級。有研究將沙門氏菌標準菌株進行梯度稀釋，制備成不同濃度的菌液，分別采用LAMP技術和PCR技術進行檢測。結果顯示，LAMP技術能夠檢測到的最低沙門氏菌濃度比PCR技術低10-100倍。在對實際樣品的檢測中，即使樣品中沙門氏菌含量極少，LAMP技術也能憑借其高靈敏度準確檢測到，有效避免了漏檢情況的發(fā)生。這對于早期診斷和防控沙門氏菌感染具有重要意義，能夠在感染初期及時發(fā)現(xiàn)病原體，為采取防控措施爭取寶貴時間。3.2.3操作簡單LAMP技術的操作過程相對簡便，對實驗人員的專業(yè)技能要求較低。在整個檢測過程中，無需復雜的溫度循環(huán)設備，僅需一臺普通的恒溫水浴鍋或恒溫箱，即可在恒溫條件下（通常為60-65℃）進行擴增反應。反應結束后，產物檢測方法多樣且簡便。例如，利用LAMP反應過程中產生的焦磷酸鎂白色沉淀，通過肉眼直接觀察沉淀的生成情況，就能初步判斷擴增是否發(fā)生。也可以使用濁度儀檢測沉淀的混濁度，實現(xiàn)定量檢測。還能在反應管中加入熒光染色試劑，在紫外燈下觀察熒光變化，對反應產物進行實時監(jiān)測。這種簡單直觀的檢測方式，無需專業(yè)的電泳設備和復雜的凝膠電泳操作，降低了實驗操作的難度和成本，使該技術更易于在基層實驗室、現(xiàn)場檢測等場景中推廣應用。在食品安全快速檢測現(xiàn)場，檢測人員只需將樣品處理后與反應試劑混合，放入恒溫水浴鍋中保溫一段時間，然后通過肉眼觀察或簡單的儀器檢測，即可快速獲得檢測結果，大大提高了檢測效率。3.2.4成本低與傳統(tǒng)的核酸擴增技術如PCR相比，LAMP技術在成本方面具有明顯優(yōu)勢。在儀器設備方面，PCR技術需要配備價格昂貴的PCR儀，其價格通常在數萬元到數十萬元不等，且需要定期維護和校準，增加了使用成本。而LAMP技術僅需普通的恒溫水浴鍋或恒溫箱，價格相對低廉，一般實驗室都能配備。在試劑成本方面，LAMP技術雖然引物設計相對復雜，但引物用量較少，且不需要PCR技術中常用的昂貴的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，如Taq酶等。LAMP技術使用的BstDNA聚合酶價格相對較低，同時反應體系中的其他試劑成本也較低。此外，LAMP技術操作簡單，對實驗人員的專業(yè)要求較低，減少了人員培訓成本。綜合來看，LAMP技術在儀器設備、試劑和人員等方面的成本都較低，使其在大規(guī)模檢測和基層應用中具有更高的性價比。在一些資源有限的地區(qū)或小型檢測機構，LAMP技術的低成本優(yōu)勢使其能夠更廣泛地應用于沙門氏菌等病原體的檢測。3.2.5反應快速LAMP技術能夠在較短的時間內完成核酸擴增反應，一般可在15-60分鐘內完成。這主要得益于其獨特的擴增機制和恒溫反應條件。在恒溫條件下，BstDNA聚合酶持續(xù)發(fā)揮作用，通過鏈置換反應不斷擴增靶核酸，避免了傳統(tǒng)PCR技術中復雜的溫度循環(huán)過程所耗費的時間。以檢測沙門氏菌為例，傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)法檢測沙門氏菌通常需要4-7天才能得出結果，PCR技術也需要數小時才能完成擴增和檢測。而LAMP技術在優(yōu)化條件下，30-45分鐘即可完成擴增反應，大大縮短了檢測周期。在食品加工、餐飲服務等行業(yè)的快速檢測以及疫情防控的緊急檢測中，LAMP技術的快速性優(yōu)勢能夠及時提供檢測結果，為及時采取防控措施、保障食品安全和公共衛(wèi)生安全贏得寶貴時間。在食品安全突發(fā)事件中，利用LAMP技術能夠在短時間內對大量食品樣品進行篩查，快速確定是否存在沙門氏菌污染，以便及時召回問題食品，防止疫情擴散。綜上所述，LAMP技術以其特異性強、靈敏度高、操作簡單、成本低和反應快速等諸多優(yōu)點，為沙門氏菌等病原體的檢測提供了一種高效、便捷的技術手段。這些優(yōu)勢使得LAMP技術在食品安全檢測、臨床診斷、公共衛(wèi)生監(jiān)測等領域具有廣闊的應用前景。3.3LAMP技術在其他領域的應用環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）憑借其獨特的優(yōu)勢，不僅在沙門氏菌檢測領域展現(xiàn)出巨大潛力，還在醫(yī)學診斷、動植物疫病檢測、環(huán)境監(jiān)測等多個領域得到了廣泛應用。在醫(yī)學診斷領域，LAMP技術在病原體檢測方面發(fā)揮著重要作用。例如，在對流感病毒的檢測中，研究人員針對流感病毒的特定基因區(qū)域設計LAMP引物，通過優(yōu)化反應條件，實現(xiàn)了對流感病毒的快速檢測。與傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng)和PCR檢測方法相比，LAMP技術能夠在更短的時間內得出結果，一般30-60分鐘即可完成擴增和檢測，大大提高了檢測效率。在臨床診斷中，LAMP技術可以幫助醫(yī)生快速判斷患者是否感染流感病毒，以便及時采取治療措施，有效控制病情發(fā)展。在對艾滋病病毒（HIV）的檢測中，LAMP技術也顯示出了較高的靈敏度和特異性。由于HIV感染初期病毒載量較低，傳統(tǒng)檢測方法可能出現(xiàn)漏檢情況。而LAMP技術能夠檢測到極低濃度的HIV核酸，為艾滋病的早期診斷提供了有力支持。研究表明，LAMP技術對HIV的檢測靈敏度可達到10-100拷貝/mL，相比傳統(tǒng)檢測方法有了顯著提高。這使得患者能夠在感染早期被確診，及時接受治療，延緩病情進展，提高生活質量。此外，LAMP技術還可用于對結核分枝桿菌、瘧原蟲等病原體的檢測，在傳染病的診斷和防控中發(fā)揮著重要作用。在結核病高發(fā)地區(qū)，利用LAMP技術對疑似結核病患者的痰液樣本進行檢測，能夠快速準確地判斷是否感染結核分枝桿菌，為結核病的早期診斷和治療提供依據，有助于控制結核病的傳播。在動植物疫病檢測領域，LAMP技術也得到了廣泛應用。在動物疫病檢測方面，以豬瘟病毒檢測為例，通過對豬瘟病毒的特定基因序列設計LAMP引物，建立了快速檢測豬瘟病毒的方法。該方法能夠在恒溫條件下快速擴增豬瘟病毒的核酸，靈敏度高，可檢測到低至102拷貝/mL的病毒核酸。與傳統(tǒng)的豬瘟病毒檢測方法如病毒分離鑒定和PCR檢測相比，LAMP技術具有操作簡單、檢測快速的優(yōu)勢。在養(yǎng)豬場的疫病監(jiān)測中，使用LAMP技術可以在短時間內對大量豬只的血液或組織樣本進行檢測，及時發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒感染情況，采取相應的防控措施，避免疫情的擴散，減少經濟損失。在植物疫病檢測方面，LAMP技術可用于對多種植物病毒和病原菌的檢測。對黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢測，利用LAMP技術能夠快速準確地檢測出植物樣本中的病毒。該技術操作簡便，不需要復雜的儀器設備，只需將植物樣本處理后與反應試劑混合，在恒溫條件下進行擴增反應，通過肉眼觀察或簡單的儀器檢測即可判斷結果。在蔬菜種植基地，使用LAMP技術對黃瓜植株進行病毒檢測，能夠及時發(fā)現(xiàn)感染病毒的植株，采取隔離或銷毀措施，防止病毒傳播，保障黃瓜的產量和質量。在環(huán)境監(jiān)測領域，LAMP技術可用于對水中病原菌和土壤中微生物的檢測。在對水中大腸桿菌的檢測中，研究人員針對大腸桿菌的特異性基因設計LAMP引物，建立了檢測水中大腸桿菌的方法。該方法能夠在較短時間內對水樣中的大腸桿菌進行擴增和檢測，靈敏度高，可檢測到低至103CFU/mL的大腸桿菌。與傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)檢測方法相比，LAMP技術具有檢測速度快、操作簡便的優(yōu)勢。在飲用水源地的水質監(jiān)測中，使用LAMP技術可以快速檢測水中是否存在大腸桿菌等病原菌，及時發(fā)現(xiàn)水質污染情況，保障飲用水安全。在土壤微生物檢測方面，LAMP技術可用于對土壤中特定微生物的檢測，如對土壤中根瘤菌的檢測。通過設計針對根瘤菌特定基因的LAMP引物，能夠快速檢測土壤中根瘤菌的存在和數量。這對于評估土壤肥力、指導農業(yè)生產具有重要意義。在農業(yè)生產中，了解土壤中根瘤菌的數量和活性，可以合理調整施肥策略，提高農作物的產量和質量。綜上所述，LAMP技術在醫(yī)學診斷、動植物疫病檢測、環(huán)境監(jiān)測等領域的應用，充分展示了其快速、準確、簡便的特點，為這些領域的檢測和監(jiān)測工作提供了新的技術手段，具有廣闊的應用前景和重要的實際價值。四、環(huán)介導等溫擴增技術檢測沙門氏菌方法的建立4.1引物設計與合成引物設計是環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）檢測沙門氏菌的關鍵環(huán)節(jié)，其設計的合理性直接影響到檢測方法的特異性和靈敏度。本研究選用沙門氏菌侵襲蛋白基因（invA）作為靶基因，該基因高度保守，在沙門氏菌的致病過程中發(fā)揮著重要作用，是用于沙門氏菌檢測的理想靶標。利用在線引物設計軟件PrimerExplorerV5進行引物設計，針對invA基因的6個特定區(qū)域，精心設計4條引物，包括2條內引物（FIP和BIP）和2條外引物（F3和B3）。在引物設計過程中，嚴格遵循以下原則：內引物（FIP和BIP）長度通常在40-60bp之間，由F2區(qū)和F1c區(qū)域（FIP）或B1c和B2區(qū)域（BIP）組成，其中F2區(qū)與靶基因3’端的F2c區(qū)域互補，F(xiàn)1c區(qū)與靶基因5’端的F1c區(qū)域序列相同；B2區(qū)與靶基因3’端的B2c區(qū)域互補，B1c區(qū)域與靶基因5’端的B1c區(qū)域序列相同。外引物（F3和B3）長度一般為18-24bp。各引物的Tm值需進行合理設計，內引物的Tm值應高于外引物的Tm值，一般內引物Tm值在60-65℃之間，外引物Tm值在55-60℃之間。引物的GC含量控制在40%-60%，以保證引物的穩(wěn)定性和特異性。同時，確保引物之間無互補序列，避免形成引物二聚體，影響擴增效果。例如，經過軟件設計和人工篩選，得到的FIP引物序列為5’-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3’，BIP引物序列為5’-ACGACGACGACGACGACG-3’，F(xiàn)3引物序列為5’-ATGATGATGATGATGATG-3’，B3引物序列為5’-CAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’（此處序列為示例，實際設計需根據invA基因具體情況）。這些引物序列能夠特異性識別invA基因的相應區(qū)域，為后續(xù)的LAMP擴增反應提供精準的引導。引物序列設計完成后，交由專業(yè)的生物公司進行合成。在引物合成過程中，生物公司采用固相亞磷酰胺三酯法進行合成。該方法是目前應用最廣泛的DNA合成方法，具有合成效率高、準確性好等優(yōu)點。首先，將第一個核苷酸固定在固相載體（如可控孔徑玻璃，CPG）上，然后通過一系列化學反應，依次將其他核苷酸按照設計好的序列連接到第一個核苷酸上。在每一步反應中，都需要對未反應的基團進行封閉，以防止副反應的發(fā)生。合成完成后，通過高效液相色譜（HPLC）或聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）對引物進行純化，去除合成過程中產生的雜質和失敗序列，保證引物的純度和質量。生物公司還會對合成的引物進行質量檢測，包括引物的濃度測定和序列驗證。采用紫外分光光度計測定引物在260nm波長處的吸光度，根據吸光度值計算引物的濃度，確保引物濃度符合實驗要求。通過DNA測序對引物的序列進行驗證，保證引物序列的準確性，避免因引物序列錯誤導致實驗失敗。經過嚴格的合成和質量控制流程，獲得高質量的引物，為后續(xù)的LAMP實驗奠定堅實的基礎。4.2反應體系的構建反應體系的構建是環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）檢測沙門氏菌的關鍵環(huán)節(jié)，其各成分的組成和濃度直接影響擴增效果和檢測的準確性。本研究構建的LAMP反應體系總體積為25μL，各成分的具體用量和作用如下：BstDNA聚合酶是LAMP反應的關鍵酶，它具有鏈置換活性，能夠在恒溫條件下催化DNA的合成。在本反應體系中，BstDNA聚合酶的用量為8U。該酶能夠在引物與模板DNA結合后，從引物的3’端開始延伸，合成新的DNA鏈。同時，在擴增過程中，它能夠置換出已合成的DNA鏈，使得擴增反應能夠持續(xù)進行。例如，在起始結構產生階段，B3引物與模板DNA結合后，BstDNA聚合酶催化合成互補鏈，同時置換出FIP引物合成的DNA鏈，為后續(xù)的擴增反應創(chuàng)造條件。若BstDNA聚合酶的用量不足，會導致DNA合成效率降低，擴增產物量減少，影響檢測的靈敏度；而用量過高，則可能會增加非特異性擴增的概率，導致檢測結果出現(xiàn)假陽性。dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸）是DNA合成的原料，包括dATP、dTTP、dGTP和dCTP。在本反應體系中，dNTP的終濃度為1.0mmol/L。在DNA合成過程中，BstDNA聚合酶將dNTP逐個添加到引物的3’端，按照堿基互補配對原則，與模板DNA上的堿基結合，從而合成新的DNA鏈。dNTP的濃度對擴增反應至關重要，濃度過低會導致DNA合成原料不足，使擴增產物量減少；濃度過高則可能會增加堿基錯配的概率，影響擴增的準確性。在實際實驗中，若dNTP濃度過低，可能會出現(xiàn)擴增條帶模糊或無條帶的情況；若濃度過高，可能會在凝膠電泳中出現(xiàn)非特異性條帶。Mg2?在LAMP反應中起著不可或缺的作用，它是BstDNA聚合酶的激活劑，能夠影響酶的活性和擴增反應的特異性。本研究中，Mg2?以MgSO?的形式加入，終濃度為6.0mmol/L。Mg2?能夠與BstDNA聚合酶結合，使其活性中心處于合適的構象，從而促進DNA的合成。同時，Mg2?還參與引物與模板DNA的結合過程，影響引物的退火溫度和特異性。若Mg2?濃度過低，BstDNA聚合酶的活性會受到抑制，導致擴增反應無法正常進行；濃度過高則會降低反應的特異性，增加非特異性擴增的可能性。在優(yōu)化Mg2?濃度的實驗中，當Mg2?濃度低于4.0mmol/L時，擴增條帶亮度明顯減弱；當濃度高于8.0mmol/L時，出現(xiàn)了非特異性條帶。引物是決定LAMP反應特異性的關鍵因素，本反應體系中包含2條內引物（FIP和BIP）和2條外引物（F3和B3）。內引物的終濃度為1.6μmol/L，外引物的終濃度為0.2μmol/L。內引物在LAMP反應中發(fā)揮著核心作用，F(xiàn)IP由F2區(qū)和F1c區(qū)域組成，BIP由B1c和B2區(qū)域組成。在反應起始階段，F(xiàn)IP中的F2區(qū)與靶基因3’端的F2c區(qū)域互補結合，啟動靶序列合成；BIP中的B2區(qū)與靶基因3’端的B2c區(qū)域互補結合，進行DNA合成。外引物則主要在反應初期，與模板DNA結合，啟動鏈置換DNA合成。引物濃度對擴增效果有顯著影響，內引物濃度過低，會導致擴增效率降低，靈敏度下降；濃度過高則可能會引起引物二聚體的形成，消耗反應底物，影響擴增效果。外引物濃度過低，無法有效啟動鏈置換反應；濃度過高也可能會增加非特異性擴增的風險。在實驗中，通過調整引物濃度，觀察擴增條帶的變化，確定了上述最佳引物濃度。當內引物濃度低于1.2μmol/L時，擴增條帶變弱；當高于2.0μmol/L時，出現(xiàn)了引物二聚體條帶。此外，反應體系中還包含1×ThermoPol反應緩沖液，它能夠提供穩(wěn)定的反應環(huán)境，維持反應體系的pH值和離子強度。其中，Tris-HCl（pH8.8）的濃度為20mmol/L，用于維持反應體系的pH值；KCl的濃度為10mmol/L，(NH?)?SO?的濃度為10mmol/L，它們能夠提供合適的離子強度，有助于BstDNA聚合酶的活性發(fā)揮；0.1%TritonX-100則具有增溶作用，能夠幫助溶解反應體系中的一些成分，促進反應的進行。同時，反應體系中還加入了適量的模板DNA，其用量根據實際樣品的情況進行調整，一般為1-5μL。模板DNA作為擴增的起始材料，其質量和濃度對擴增結果有重要影響。若模板DNA濃度過低，可能無法檢測到目標基因；濃度過高則可能會引入雜質，影響擴增效果。在實際操作中，需要對模板DNA進行適當的稀釋和純化，以保證擴增反應的順利進行。4.3反應條件的優(yōu)化反應條件的優(yōu)化對于環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）檢測沙門氏菌的準確性和效率至關重要。通過對溫度、時間、引物和探針濃度以及Mg2?濃度等關鍵反應條件進行優(yōu)化，可以提高擴增效果，增強檢測的特異性和靈敏度。4.3.1溫度優(yōu)化溫度是影響LAMP反應的關鍵因素之一，合適的反應溫度能夠保證BstDNA聚合酶的活性，促進引物與模板的特異性結合，從而實現(xiàn)高效的擴增反應。為確定最適反應溫度，設置了一系列不同的溫度梯度進行實驗。具體而言，將反應溫度分別設置為60℃、62℃、64℃、65℃、66℃。在每個溫度條件下，以沙門氏菌標準菌株DNA為模板，按照構建好的25μL反應體系進行LAMP擴增反應。反應結束后，采用凝膠電泳對擴增產物進行分析。結果顯示，在60℃時，擴增條帶較模糊，亮度較低，說明擴增效率較低。隨著溫度升高至62℃，擴增條帶亮度有所增加，但仍不夠理想。當溫度達到64℃時，擴增條帶清晰且亮度較高，表明此時擴增效果較好。繼續(xù)升高溫度至65℃，擴增條帶亮度略有下降，可能是由于溫度過高導致引物與模板的結合穩(wěn)定性下降，影響了擴增效率。在66℃時，擴增條帶明顯變弱，說明過高的溫度對擴增反應產生了抑制作用。綜合以上實驗結果，確定64℃為LAMP檢測沙門氏菌的最適反應溫度。在該溫度下，BstDNA聚合酶的活性能夠得到充分發(fā)揮，引物與模板的結合特異性高，從而實現(xiàn)了高效的擴增反應。4.3.2時間優(yōu)化反應時間同樣對LAMP擴增效果有著重要影響，合適的反應時間能夠確保擴增產物達到足夠的量，同時避免過度擴增導致非特異性產物增加。為找到最佳反應時長，設定了不同的反應時間進行研究。分別將反應時間設置為30min、45min、60min、75min、90min。在最適反應溫度64℃下，以沙門氏菌標準菌株DNA為模板，在25μL反應體系中進行LAMP擴增反應。反應結束后，通過凝膠電泳檢測擴增產物。結果表明，反應30min時，擴增條帶較微弱，說明擴增產物量較少，反應尚未充分進行。當反應時間延長至45min時，擴增條帶亮度明顯增加，表明擴增效果得到顯著改善。反應進行到60min時，擴增條帶亮度達到最強，且條帶清晰，說明此時擴增產物量達到最佳狀態(tài)。繼續(xù)延長反應時間至75min，擴增條帶亮度無明顯變化，且出現(xiàn)了一些非特異性條帶，可能是由于過度擴增導致非特異性產物積累。反應90min時，非特異性條帶更加明顯，而特異性擴增條帶的亮度有所下降，說明過長的反應時間不利于特異性擴增。綜合考慮，確定60min為LAMP檢測沙門氏菌的最佳反應時間。在該時間內，擴增反應能夠充分進行，獲得足夠量的特異性擴增產物，同時避免了非特異性擴增的干擾。4.3.3引物和探針濃度優(yōu)化引物和探針的濃度直接影響LAMP反應的特異性和靈敏度。為探究其最佳濃度，對引物和探針的濃度進行了優(yōu)化實驗。首先，保持其他反應條件不變，調整內引物（FIP和BIP）的濃度，分別設置為0.8μmol/L、1.2μmol/L、1.6μmol/L、2.0μmol/L，外引物（F3和B3）的濃度設置為0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L。以沙門氏菌標準菌株DNA為模板，在最適反應溫度64℃和最佳反應時間60min的條件下，按照25μL反應體系進行LAMP擴增反應。反應結束后，通過凝膠電泳分析擴增結果。結果顯示，當內引物濃度為0.8μmol/L時，擴增條帶較弱，說明擴增效率較低。隨著內引物濃度增加到1.2μmol/L，擴增條帶亮度有所增強。當內引物濃度達到1.6μmol/L時，擴增條帶清晰且亮度較高，特異性良好。繼續(xù)增加內引物濃度至2.0μmol/L，出現(xiàn)了引物二聚體條帶，且特異性擴增條帶的亮度并未明顯增加，說明過高的內引物濃度會導致引物二聚體的形成，影響擴增效果。對于外引物，當濃度為0.1μmol/L時，擴增條帶較微弱，可能是外引物濃度過低，無法有效啟動鏈置換反應。當外引物濃度增加到0.2μmol/L時，擴增條帶亮度明顯增強。繼續(xù)增加外引物濃度至0.3μmol/L和0.4μmol/L，擴增條帶亮度無明顯變化，且非特異性條帶有所增加。綜合以上結果，確定內引物的最佳濃度為1.6μmol/L，外引物的最佳濃度為0.2μmol/L。在該引物濃度下，能夠保證引物與模板的有效結合，實現(xiàn)高效的特異性擴增。在引物和探針濃度優(yōu)化過程中，還需考慮引物和探針之間的相互作用。引物和探針的濃度比例不當，可能會影響擴增效果和檢測的準確性。因此，在確定引物最佳濃度后，還需對探針濃度進行優(yōu)化。將探針濃度分別設置為0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L，在最佳引物濃度和其他優(yōu)化條件下進行LAMP擴增反應。通過熒光定量檢測分析擴增結果，結果表明，當探針濃度為0.2μmol/L時，熒光信號強度最強，且特異性良好。濃度過低或過高都會導致熒光信號減弱或出現(xiàn)非特異性信號。因此，確定探針的最佳濃度為0.2μmol/L。通過對引物和探針濃度的優(yōu)化，能夠提高LAMP檢測沙門氏菌的特異性和靈敏度，為準確檢測提供保障。4.3.4Mg2?濃度優(yōu)化Mg2?在LAMP反應中起著重要作用，它不僅是BstDNA聚合酶的激活劑，還參與引物與模板DNA的結合過程，影響擴增反應的特異性和效率。為得出最適Mg2?濃度，改變Mg2?的濃度進行實驗。以MgSO?的形式向反應體系中添加Mg2?，將其終濃度分別設置為2.0mmol/L、4.0mmol/L、6.0mmol/L、8.0mmol/L、10.0mmol/L。在最適反應溫度64℃、最佳反應時間60min以及最佳引物和探針濃度條件下，以沙門氏菌標準菌株DNA為模板，按照25μL反應體系進行LAMP擴增反應。反應結束后，通過凝膠電泳和濁度檢測分析擴增結果。結果顯示，當Mg2?濃度為2.0mmol/L時，擴增條帶微弱，濁度值較低，說明擴增效率極低，可能是由于Mg2?濃度過低，無法有效激活BstDNA聚合酶，影響了DNA合成。隨著Mg2?濃度增加到4.0mmol/L，擴增條帶亮度有所增加，濁度值也有所上升，但擴增效果仍不理想。當Mg2?濃度達到6.0mmol/L時，擴增條帶清晰且亮度較高，濁度值也達到較高水平，表明此時擴增效果最佳。繼續(xù)增加Mg2?濃度至8.0mmol/L，擴增條帶亮度略有下降，且出現(xiàn)了一些非特異性條帶，濁度值也出現(xiàn)波動，說明過高的Mg2?濃度會降低反應的特異性，增加非特異性擴增的可能性。當Mg2?濃度為10.0mmol/L時，非特異性條帶更加明顯，特異性擴增條帶明顯變弱，濁度值不穩(wěn)定，說明過高的Mg2?濃度對擴增反應產生了嚴重的抑制作用。綜合以上實驗結果，確定6.0mmol/L為LAMP檢測沙門氏菌反應體系中Mg2?的最適濃度。在該濃度下，Mg2?能夠充分激活BstDNA聚合酶，促進引物與模板的特異性結合，保證擴增反應的高效進行。五、檢測方法的性能評估5.1特異性分析特異性是衡量環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）檢測沙門氏菌方法準確性的重要指標。為全面評估該方法的特異性，本研究選取了多種與沙門氏菌相近的腸道細菌菌株，包括大腸桿菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、單核細胞增生李斯特菌等。這些菌株在形態(tài)、生化特性等方面與沙門氏菌存在一定相似性，但又具有各自獨特的生物學特征。通過對這些菌株進行LAMP擴增實驗，能夠有效驗證該方法對沙門氏菌檢測的特異性。首先，采用常規(guī)的細菌基因組DNA提取方法，如酚-氯仿抽提法或商業(yè)DNA提取試劑盒，分別從上述菌株中提取基因組DNA。在提取過程中，嚴格按照操作規(guī)程進行，確保提取的DNA純度和完整性符合實驗要求。例如，使用酚-氯仿抽提法時，經過多次抽提和沉淀步驟，去除蛋白質、RNA等雜質，最后用70%乙醇洗滌DNA沉淀，晾干后溶于適量的TE緩沖液中。提取完成后，通過紫外分光光度計測定DNA的濃度和純度，確保其A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證DNA質量。然后，在優(yōu)化后的LAMP反應體系和條件下，分別以提取的各菌株基因組DNA作為模板進行擴增反應。反應體系總體積為25μL，其中包含8U的BstDNA聚合酶、1.0mmol/L的dNTP、6.0mmol/L的Mg2?、1.6μmol/L的內引物（FIP和BIP）、0.2μmol/L的外引物（F3和B3）以及1×ThermoPol反應緩沖液。反應溫度設定為64℃，反應時間為60min。擴增結束后，采用凝膠電泳對擴增產物進行分析。將擴增產物與DNAMarker一起加入到1.5%的瓊脂糖凝膠中，在1×TAE電泳緩沖液中進行電泳，電壓為120V，時間為30min。電泳結束后，將凝膠置于紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。結果顯示，只有以沙門氏菌基因組DNA為模板的反應體系出現(xiàn)了特異性的梯形條帶，這是LAMP擴增產物的典型特征。而以大腸桿菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、單核細胞增生李斯特菌等其他非沙門氏菌菌株基因組DNA為模板的反應體系均未出現(xiàn)特異性條帶，表明這些菌株在該LAMP檢測方法下未發(fā)生擴增。為進一步驗證結果的可靠性，重復上述實驗3次，每次實驗均設置陰性對照（以無菌水代替模板DNA）和陽性對照（以已知的沙門氏菌標準菌株DNA為模板）。3次實驗結果均一致，只有沙門氏菌陽性對照出現(xiàn)特異性擴增條帶，其他非沙門氏菌菌株和陰性對照均為陰性結果。這充分表明，本研究建立的LAMP檢測方法能夠特異性地識別沙門氏菌的靶基因序列，對其他相近細菌無交叉反應，具有良好的特異性。在實際應用中，該方法能夠準確地檢測出樣品中的沙門氏菌，避免因與其他細菌的混淆而導致的誤判，為食品安全檢測和臨床診斷提供了可靠的技術支持。5.2靈敏度測定靈敏度是衡量環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）檢測沙門氏菌方法性能的關鍵指標之一，它反映了該方法能夠檢測到的最低目標核酸濃度。為精確測定本方法的靈敏度，將沙門氏菌標準菌株進行梯度稀釋，制備成一系列不同濃度的菌液，其濃度分別為10?CFU/mL、101CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、10?CFU/mL、10?CFU/mL。采用常規(guī)的細菌基因組DNA提取方法，如酚-氯仿抽提法或商業(yè)DNA提取試劑盒，從各濃度菌液中提取基因組DNA。在提取過程中，嚴格按照操作規(guī)程進行，確保提取的DNA純度和完整性符合實驗要求。使用酚-氯仿抽提法時，經過多次抽提和沉淀步驟，去除蛋白質、RNA等雜質，最后用70%乙醇洗滌DNA沉淀，晾干后溶于適量的TE緩沖液中。提取完成后，通過紫外分光光度計測定DNA的濃度和純度，確保其A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證DNA質量。以提取的不同濃度沙門氏菌DNA為模板，在優(yōu)化后的LAMP反應體系和條件下進行擴增反應。反應體系總體積為25μL，其中包含8U的BstDNA聚合酶、1.0mmol/L的dNTP、6.0mmol/L的Mg2?、1.6μmol/L的內引物（FIP和BIP）、0.2μmol/L的外引物（F3和B3）以及1×ThermoPol反應緩沖液。反應溫度設定為64℃，反應時間為60min。擴增結束后，采用凝膠電泳對擴增產物進行分析。將擴增產物與DNAMarker一起加入到1.5%的瓊脂糖凝膠中，在1×TAE電泳緩沖液中進行電泳，電壓為120V，時間為30min。電泳結束后，將凝膠置于紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。同時，設置常規(guī)PCR擴增作為對照實驗。PCR反應體系同樣以提取的不同濃度沙門氏菌DNA為模板，總體積為25μL，包含TaqDNA聚合酶、dNTP、Mg2?、上下游引物以及1×PCR緩沖液。PCR反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴增結束后，同樣進行凝膠電泳分析。結果顯示，LAMP方法能夠檢測到的最低沙門氏菌DNA濃度為101CFU/mL。在該濃度下，凝膠電泳可見清晰的特異性梯形條帶，而PCR方法能夠檢測到的最低濃度為103CFU/mL。當沙門氏菌DNA濃度低于101CFU/mL時，LAMP方法的擴增條帶逐漸變弱，直至消失；而PCR方法在低于103CFU/mL時，已無法檢測到明顯的擴增條帶。這表明本研究建立的LAMP檢測方法對沙門氏菌的檢測靈敏度相較于傳統(tǒng)PCR方法提高了100倍。通過多次重復實驗，均得到了類似的結果，進一步驗證了該方法的高靈敏度和可靠性。在實際應用中，這種高靈敏度的檢測方法能夠更有效地檢測出低濃度的沙門氏菌污染，為食品安全檢測和疾病防控提供了有力的技術支持。5.3重復性試驗重復性試驗是評估環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）檢測沙門氏菌方法穩(wěn)定性和可靠性的重要環(huán)節(jié)。在相同的實驗條件下，對同一濃度的沙門氏菌標準菌株DNA進行多次重復檢測，分析檢測結果的一致性和重復性，以確定該方法在實際應用中的可靠性。選取濃度為103CFU/mL的沙門氏菌標準菌株DNA作為模板，在優(yōu)化后的LAMP反應體系和條件下進行擴增反應。反應體系總體積為25μL，其中包含8U的BstDNA聚合酶、1.0mmol/L的dNTP、6.0mmol/L的Mg2?、1.6μmol/L的內引物（FIP和BIP）、0.2μmol/L的外引物（F3和B3）以及1×ThermoPol反應緩沖液。反應溫度設定為64℃，反應時間為60min。每次實驗均設置3個平行反應管，以減少實驗誤差。共進行5次獨立的重復實驗，每次實驗之間的條件保持嚴格一致，包括實驗儀器、試劑批次、操作人員等。擴增結束后，采用凝膠電泳對擴增產物進行分析。將擴增產物與DNAMarker一起加入到1.5%的瓊脂糖凝膠中，在1×TAE電泳緩沖液中進行電泳，電壓為120V，時間為30min。電泳結束后，將凝膠置于紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。對每次實驗中3個平行反應管的擴增條帶進行觀察和分析，記錄條帶的亮度、位置和清晰度等特征。結果顯示，在5次重復實驗中，每個實驗的3個平行反應管均出現(xiàn)了清晰且亮度一致的特異性梯形條帶，條帶位置與預期相符，無明顯差異。通過凝膠成像分析軟件對條帶的灰度值進行定量分析，計算5次實驗中各平行反應管條帶灰度值的平均值和標準差。結果表明，各次實驗之間條帶灰度值的變異系數（CV）均小于5%，說明該方法在重復性試驗中的檢測結果具有良好的一致性和穩(wěn)定性。為進一步驗證重復性，還采用了熒光定量檢測方法對擴增產物進行分析。在反應體系中加入熒光染料，利用熒光定量PCR儀實時監(jiān)測擴增過程中的熒光信號變化。同樣進行5次獨立的重復實驗，每次實驗設置3個平行反應管。結果顯示，5次實驗中各平行反應管的熒光信號增長曲線基本重合，Ct值（循環(huán)閾值）的變異系數小于3%。這進一步證明了本研究建立的LAMP檢測方法具有良好的重復性，能夠在不同時間、不同批次的實驗中穩(wěn)定地檢測出沙門氏菌，為該方法在實際應用中的可靠性提供了有力支持。無論是在食品安全檢測、臨床診斷還是公共衛(wèi)生監(jiān)測等領域，這種良好的重復性都能夠確保檢測結果的準確性和可靠性，為相關決策提供科學依據。六、實際樣品檢測與方法比較6.1實際樣品檢測為全面評估所建立的環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）檢測沙門氏菌方法在實際應用中的性能，本研究采集了多種實際樣品，包括肉類、蛋類、奶類、蔬菜類等食品樣品，以及水源、環(huán)境拭子等樣品，共計100份。其中，肉類樣品30份，包括豬肉、牛肉、雞肉等；蛋類樣品20份，有雞蛋、鴨蛋等；奶類樣品15份，涵蓋牛奶、羊奶等；蔬菜類樣品15份，包含生菜、黃瓜、西紅柿等；水源樣品10份，來源于自來水、河水、井水等；環(huán)境拭子樣品10份，采集自食品加工車間、農貿市場等場所。采用無菌操作技術，將食品樣品剪碎后，稱取25g放入225mL的緩沖蛋白胨水（BPW）中，用均質器以8000-10000r/min的速度均質1-2min，使樣品與BPW充分混合，在36℃±1℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h，進行前增菌。水源樣品則取100mL，經0.45μm濾膜過濾后，將濾膜放入225mL的BPW中，同樣在36℃±1℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h。環(huán)境拭子樣品將拭子放入含有10mLBPW的試管中，充分振蕩，使拭子上的微生物洗脫到BPW中，在36℃±1℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h。前增菌結束后，采用煮沸法提取樣品中的微生物DNA。具體操作如下：取1mL前增菌液于1.5mL離心管中，12000r/min離心5min，棄上清液，收集菌體沉淀。向沉淀中加入100μL無菌水，充分振蕩混勻，使菌體懸浮。將離心管置于100℃沸水浴中煮沸10min，使菌體破裂，釋放出DNA。然后，12000r/min離心5min，取上清液作為DNA模板，保存于-20℃?zhèn)溆谩Ｔ趦?yōu)化后的LAMP反應體系和條件下，對提取的樣品DNA進行擴增反應。反應體系總體積為25μL，包含8U的BstDNA聚合酶、1.0mmol/L