基于番茄轉(zhuǎn)化的豬傳染性胃腸炎病毒S1基因植物表達載體構(gòu)建與功能驗證研究一、引言1.1研究背景豬傳染性胃腸炎（TransmissibleGastroenteritisofSwine，TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TransmissibleGastroenteritisVirus，TGEV）引起的一種對養(yǎng)豬業(yè)危害極大的高度接觸性腸道傳染病。其臨床特征主要表現(xiàn)為豬只出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉、嘔吐和脫水癥狀，不同年齡的豬均可感染，但以10日齡以內(nèi)的仔豬最為易感，且死亡率極高，可高達100%。存活的仔豬往往發(fā)育不良，生長遲緩，容易形成僵豬，給養(yǎng)殖戶帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。成年豬感染后雖然死亡率較低，但會導(dǎo)致其抗病能力與免疫功能受損，出現(xiàn)掉膘、飼料利用率降低等問題，同樣會造成較大的經(jīng)濟損失。TGEV在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，在一些TGE流行嚴(yán)重的地區(qū)，仔豬的死亡率急劇上升，部分豬場的仔豬死亡率甚至達到了80%-90%，導(dǎo)致養(yǎng)豬場的存欄量大幅下降，嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的正常生產(chǎn)和發(fā)展。此外，為了防控TGE，養(yǎng)豬場需要投入大量的人力、物力和財力，包括加強飼養(yǎng)管理、進行疫苗接種、使用藥物防治等，這進一步增加了養(yǎng)殖成本。而且，由于TGE的發(fā)生和流行，還可能導(dǎo)致豬肉供應(yīng)減少，價格波動，對整個養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)鏈產(chǎn)生不利影響。目前，對于TGE的防控主要依賴于疫苗接種和綜合的飼養(yǎng)管理措施。傳統(tǒng)的疫苗包括弱毒疫苗和滅活疫苗，在TGE的防制中發(fā)揮了一定的作用。然而，這些傳統(tǒng)疫苗存在著諸多缺陷，如弱毒疫苗可能存在排毒、散毒和毒力返祖的風(fēng)險，導(dǎo)致疫苗免疫后豬群仍有可能感染TGEV；滅活疫苗的免疫效果相對較差，免疫應(yīng)答產(chǎn)生較慢，不能激發(fā)產(chǎn)生以SlgA抗體為主的黏膜免疫反應(yīng)，且制苗成本較高。此外，由于TGEV的變異較快，傳統(tǒng)疫苗對一些新出現(xiàn)的變異毒株的保護效果可能不佳。因此，開發(fā)一種高效、安全的新型疫苗迫在眉睫。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，基因工程疫苗成為了研究的熱點?；蚬こ桃呙缇哂邪踩?、高效、成本低廉等優(yōu)點，能夠克服傳統(tǒng)疫苗的諸多缺點。其中，利用植物表達系統(tǒng)生產(chǎn)基因工程疫苗是近年來的一個重要研究方向。植物表達系統(tǒng)具有許多獨特的優(yōu)勢，如植物易于大規(guī)模種植，生產(chǎn)成本低；植物細(xì)胞具有完整的真核表達系統(tǒng)，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進行正確的折疊和修飾，保證表達產(chǎn)物的生物活性；植物疫苗可以通過口服的方式進行免疫，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生黏膜免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫等多種免疫反應(yīng)，從而提供更全面的免疫保護。番茄作為一種常見的蔬菜作物，具有生長周期短、易于轉(zhuǎn)化、果實可食用等優(yōu)點，是一種理想的植物表達系統(tǒng)宿主。將豬傳染性胃腸炎病毒的相關(guān)基因?qū)敕阎?，?gòu)建植物表達載體并轉(zhuǎn)化番茄，有望開發(fā)出一種新型的口服植物疫苗，為TGE的防控提供新的策略和方法。1.2研究目的和意義本研究旨在構(gòu)建豬傳染性胃腸炎病毒S1基因的植物表達載體，并將其轉(zhuǎn)化到番茄中，實現(xiàn)S1基因在番茄中的穩(wěn)定表達，為開發(fā)新型的豬傳染性胃腸炎口服植物疫苗奠定基礎(chǔ)。豬傳染性胃腸炎給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重威脅著全球養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。目前，傳統(tǒng)疫苗在防控TGE方面存在諸多不足，無法滿足養(yǎng)豬業(yè)對高效、安全疫苗的需求。開發(fā)新型疫苗成為了當(dāng)前TGE防控研究的重點和熱點。利用植物表達系統(tǒng)生產(chǎn)基因工程疫苗是一種極具潛力的疫苗研發(fā)策略，具有生產(chǎn)成本低、安全性高、可誘導(dǎo)黏膜免疫等優(yōu)勢。番茄作為一種常見的植物表達系統(tǒng)宿主，具有易于轉(zhuǎn)化、生長周期短、果實可食用等特點，非常適合用于生產(chǎn)口服植物疫苗。本研究通過構(gòu)建S1基因植物表達載體并轉(zhuǎn)化番茄，有望獲得能夠表達豬傳染性胃腸炎病毒S1蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄。S1蛋白是TGEV的主要免疫原性蛋白，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，提供免疫保護。將轉(zhuǎn)基因番茄作為口服疫苗，豬只在食用后，S1蛋白可以刺激豬的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫等多種免疫反應(yīng)，從而提高豬只對TGEV的抵抗力，有效預(yù)防TGE的發(fā)生。這對于減少TGE對養(yǎng)豬業(yè)的危害，提高養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟效益具有重要意義。此外，本研究還將為植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)疫苗的研究提供理論和技術(shù)支持。通過深入研究S1基因在番茄中的表達機制和調(diào)控方式，可以進一步優(yōu)化植物表達系統(tǒng)，提高疫苗的表達量和免疫效果，推動植物生物反應(yīng)器技術(shù)在疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展。同時，本研究的成果也將為其他動物病毒基因工程疫苗的研發(fā)提供借鑒和參考，促進動物疫苗領(lǐng)域的技術(shù)創(chuàng)新和進步。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1豬傳染性胃腸炎病毒S1基因的研究現(xiàn)狀豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA，長度約為28kb，包含多個開放閱讀框（ORFs），編碼多種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。其中，S蛋白是TGEV的主要表面糖蛋白，由S1和S2兩個亞基組成。S1亞基位于病毒粒子的最外層，具有高度的變異性，包含多個抗原位點，是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體和免疫保護的關(guān)鍵蛋白。國內(nèi)外學(xué)者對TGEVS1基因進行了廣泛而深入的研究。在基因結(jié)構(gòu)與功能方面，研究發(fā)現(xiàn)S1基因的不同區(qū)域具有不同的功能，如N端區(qū)域參與病毒與宿主細(xì)胞的吸附，而C端區(qū)域則與病毒的融合和侵入有關(guān)。通過對S1基因的序列分析，揭示了其核苷酸和氨基酸序列的變異規(guī)律，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的TGEV毒株S1基因存在一定的差異，這些差異可能導(dǎo)致病毒抗原性和致病性的改變。在免疫原性研究方面，眾多研究表明S1蛋白能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生強烈的免疫應(yīng)答。將S1蛋白或其編碼基因作為疫苗候選物進行免疫實驗，發(fā)現(xiàn)可以刺激動物產(chǎn)生特異性的中和抗體，有效抵抗TGEV的感染。例如，有研究將重組S1蛋白免疫小鼠，小鼠血清中產(chǎn)生了高滴度的中和抗體，并且在攻毒實驗中表現(xiàn)出良好的保護效果。此外，S1蛋白還能夠激活細(xì)胞免疫反應(yīng)，增強機體的免疫防御能力。在基因工程疫苗研究方面，以S1基因構(gòu)建的基因工程疫苗成為研究熱點。包括重組病毒載體疫苗、DNA疫苗、亞單位疫苗等。如將S1基因插入腺病毒、痘病毒等載體中構(gòu)建重組病毒載體疫苗，在動物實驗中取得了較好的免疫效果；將S1基因直接導(dǎo)入動物體內(nèi)構(gòu)建DNA疫苗，也能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答；利用基因工程技術(shù)表達和純化S1蛋白，制備亞單位疫苗，具有安全性高、免疫效果好等優(yōu)點。1.3.2番茄遺傳轉(zhuǎn)化的研究進展番茄（Solanumlycopersicum）是一種重要的蔬菜作物，具有生長周期短、易于栽培、遺傳背景清晰等優(yōu)點，是植物遺傳轉(zhuǎn)化研究的模式植物之一。番茄的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)為改良番茄品種、提高番茄品質(zhì)和抗性提供了有力的手段，也為利用番茄作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)外源蛋白奠定了基礎(chǔ)。目前，番茄遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、電擊法等。其中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是應(yīng)用最為廣泛的方法，具有操作簡單、轉(zhuǎn)化效率高、整合位點明確等優(yōu)點。通過將外源基因插入到農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒上，利用農(nóng)桿菌感染番茄的外植體，如子葉、下胚軸等，將外源基因?qū)氲椒鸭?xì)胞中，并整合到基因組中，實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。在優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系方面，研究人員對影響轉(zhuǎn)化效率的因素進行了深入研究，包括農(nóng)桿菌菌株、載體類型、外植體類型、共培養(yǎng)條件、篩選劑濃度等。通過優(yōu)化這些因素，顯著提高了番茄的遺傳轉(zhuǎn)化效率。例如，選擇合適的農(nóng)桿菌菌株和載體，可以增強其對番茄細(xì)胞的感染能力；選擇處于對數(shù)生長期的外植體，能夠提高細(xì)胞的分裂活性和轉(zhuǎn)化效率；優(yōu)化共培養(yǎng)條件，如溫度、時間、pH值等，可以促進農(nóng)桿菌與外植體的相互作用，提高外源基因的整合效率。在番茄遺傳轉(zhuǎn)化的應(yīng)用方面，取得了豐碩的成果。通過遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，成功將抗病、抗蟲、抗逆等相關(guān)基因?qū)敕阎?，培育出了一系列具有?yōu)良性狀的番茄新品種。如將抗番茄花葉病毒（ToMV）基因?qū)敕阎?，獲得了抗ToMV的轉(zhuǎn)基因番茄；將蘇云金芽孢桿菌（Bt）毒蛋白基因?qū)敕阎?，培育出了抗蟲番茄；將耐鹽相關(guān)基因?qū)敕阎?，提高了番茄的耐鹽性。此外，利用番茄作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)外源蛋白也取得了一定的進展，如生產(chǎn)藥用蛋白、疫苗等。1.3.3研究現(xiàn)狀分析綜上所述，國內(nèi)外在豬傳染性胃腸炎病毒S1基因的研究和番茄遺傳轉(zhuǎn)化方面都取得了顯著的進展。然而，目前仍存在一些不足之處。在S1基因的研究中，雖然對其結(jié)構(gòu)、功能和免疫原性有了較深入的了解，但對于S1蛋白在植物表達系統(tǒng)中的表達機制和調(diào)控方式還研究較少。不同表達系統(tǒng)中S1蛋白的表達量和活性差異較大，如何優(yōu)化表達條件，提高S1蛋白的表達量和穩(wěn)定性，仍是需要解決的問題。在番茄遺傳轉(zhuǎn)化方面，雖然轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)較為成熟，但轉(zhuǎn)化效率仍有待進一步提高，且轉(zhuǎn)化過程中可能會出現(xiàn)基因沉默、插入突變等問題，影響轉(zhuǎn)基因植株的穩(wěn)定性和安全性。此外，利用番茄作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)外源蛋白，還需要進一步優(yōu)化表達載體和培養(yǎng)條件，提高外源蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本。本研究將針對這些問題，開展豬傳染性胃腸炎病毒S1基因植物表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化番茄的研究，為開發(fā)新型的豬傳染性胃腸炎口服植物疫苗提供理論和技術(shù)支持。二、豬傳染性胃腸炎病毒S1基因2.1TGEV概述豬傳染性胃腸炎病毒（TransmissibleGastroenteritisVirus，TGEV）在病毒分類學(xué)上屬于套式病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus）。其病毒粒子多呈球形、橢圓形或多邊形，具有囊膜結(jié)構(gòu)，電鏡負(fù)染觀察可見病毒直徑為90-200nm。病毒表面存在明顯的花瓣狀纖突，這些纖突長度大約在12-25nm之間，是病毒與宿主細(xì)胞相互作用的重要結(jié)構(gòu)。由于TGEV是RNA病毒，其纖突相對不穩(wěn)定，在電鏡觀察時有時難以清晰看到。在病毒的囊膜脂質(zhì)雙層中，鑲嵌著3種膜相關(guān)蛋白，分別是S蛋白（纖突糖蛋白）、M蛋白（膜糖蛋白，多次橫穿脂質(zhì)雙層）和sM蛋白（小包膜蛋白）。TGEV的理化特性表現(xiàn)為對熱較為敏感，加熱至56℃持續(xù)45min或者65℃維持10min，病毒就會被完全滅活，且隨著溫度升高，病毒滴度呈下降趨勢。在冷凍環(huán)境下，TGEV能夠保持較好的穩(wěn)定性，然而在室溫或更高溫度條件下，其穩(wěn)定性相對較差。甲醛溶液處理病毒，在37℃環(huán)境下20min即可使其滅活。該病毒對光和紫外線也很敏感，在一定條件下，光和紫外線都能輕易將TGEV滅活。此外，TGEV在膽汁中較為穩(wěn)定，但對乙醚、氯仿和去氧膽酸鈉等試劑敏感，不過對胰酶具有一定的抵抗力，能夠耐受0.5%胰蛋白酶長達1h，在pH值為4-8的區(qū)間內(nèi)，TGEV表現(xiàn)相對穩(wěn)定。TGEV主要通過消化道和呼吸道傳播。發(fā)病豬和帶毒豬是主要傳染源，病毒可存在于它們的糞便、乳汁、嘔吐物、呼吸及鼻腔分泌物中，其他帶毒動物也可能成為傳染源。當(dāng)健康豬與感染豬直接接觸，或者接觸被病毒污染的飼料、飲水、空氣和飼喂用具等，就容易感染TGEV。不同年齡的豬對TGEV均易感，但10日齡以內(nèi)的仔豬發(fā)病率和病死率極高，而狗、貓、狐貍等動物可帶毒排毒卻不發(fā)病。TGE的發(fā)生和流行呈現(xiàn)出明顯的季節(jié)性，多集中在初春和冬季，每年的1-2月是發(fā)病高峰期，這與病毒不耐熱但在冰凍條件下穩(wěn)定的理化特性密切相關(guān)。一旦豬場感染TGEV，往往會引發(fā)大量豬只暴發(fā)感染。哺乳母豬發(fā)病后常出現(xiàn)厭食和無乳癥狀，這會進一步導(dǎo)致仔豬死亡率上升。此外，該病還具有周期性地方流行性的特點，在流行間歇期，病毒隱匿在豬體內(nèi)，成為仔豬的傳染源，每年冬季豬群易重新感染，而曾感染過TGE的母豬通常具有免疫力，一般不會重復(fù)感染。TGEV感染豬只后，會引發(fā)一系列嚴(yán)重的臨床癥狀。仔豬潛伏期很短，一般為12-24h，感染后會突然發(fā)生嘔吐，隨后出現(xiàn)頻繁劇烈的水樣腹瀉，糞便顏色呈黃色、綠色或灰色，伴有腥臭味，常夾雜未消化的凝乳塊。病豬會極度口渴，迅速脫水、消瘦，日齡越小，病程越短，病死率越高，10日齡以內(nèi)的仔豬大多在2-5d內(nèi)死亡，即便病愈，仔豬也會生長發(fā)育不良。后備豬、架子豬和成年豬癥狀輕重程度不同，主要表現(xiàn)為停食，個別出現(xiàn)嘔吐，伴有急性腹瀉，排出灰色或灰褐色水樣便，其中含有未消化的飼料，通常5-7d可自愈，很少死亡。TGEV給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的危害。在經(jīng)濟方面，仔豬的高死亡率使得養(yǎng)豬場的存欄量大幅下降，增加了養(yǎng)殖成本，降低了養(yǎng)殖效益。同時，為防控疾病，養(yǎng)殖場需要投入大量資金用于疫苗接種、藥物防治和加強飼養(yǎng)管理等。此外，TGE的流行還可能導(dǎo)致豬肉供應(yīng)減少，價格波動，影響整個養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)鏈的穩(wěn)定發(fā)展。在養(yǎng)殖生產(chǎn)方面，存活仔豬的生長發(fā)育不良會降低豬群的整體質(zhì)量，成年豬感染后會出現(xiàn)掉膘、飼料利用率降低等問題，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。2.2S1基因結(jié)構(gòu)與功能S1基因是豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）基因組中的一個重要基因，位于S基因的5'端區(qū)域。S基因全長約4.4kb，編碼病毒的刺突糖蛋白（S蛋白），S蛋白由S1和S2兩個亞基組成，其中S1亞基由S1基因編碼。S1基因的長度因不同毒株而略有差異，一般在1.5-1.7kb之間，包含多個開放閱讀框（ORFs），具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)特點。從核苷酸序列來看，S1基因存在多個保守區(qū)域和變異區(qū)域。保守區(qū)域在不同毒株間相對穩(wěn)定，這些區(qū)域可能與病毒的基本生物學(xué)功能密切相關(guān)，如維持病毒粒子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、參與病毒與宿主細(xì)胞的相互作用等。而變異區(qū)域則具有較高的變異性，這使得不同地區(qū)、不同時間分離的TGEV毒株在S1基因序列上存在差異。這些變異可能導(dǎo)致S1蛋白氨基酸序列的改變，進而影響病毒的抗原性、致病性和傳播能力。研究發(fā)現(xiàn)，S1基因的變異主要集中在一些特定的位點和區(qū)域，這些位點和區(qū)域的變異可能與病毒的免疫逃逸、宿主適應(yīng)性等有關(guān)。S1基因編碼的S1蛋白在病毒感染和免疫過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在病毒感染方面，S1蛋白是病毒與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合的關(guān)鍵蛋白。它含有多個能夠識別宿主細(xì)胞表面特定受體的結(jié)構(gòu)域，通過與受體的特異性結(jié)合，介導(dǎo)病毒吸附到宿主細(xì)胞表面，啟動病毒的感染過程。研究表明，S1蛋白的N端區(qū)域參與了病毒與宿主細(xì)胞的吸附過程，該區(qū)域的氨基酸序列變化可能會影響病毒對宿主細(xì)胞的親和力，從而改變病毒的感染效率和宿主范圍。在免疫方面，S1蛋白是TGEV的主要免疫原性蛋白，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生強烈的免疫應(yīng)答。當(dāng)機體感染TGEV或接種含有S1蛋白的疫苗后，S1蛋白作為抗原被抗原呈遞細(xì)胞攝取、加工和呈遞，激活T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，引發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。在體液免疫中，B淋巴細(xì)胞被激活后分化為漿細(xì)胞，分泌特異性的抗體，其中中和抗體能夠與S1蛋白結(jié)合，阻斷病毒與宿主細(xì)胞的吸附和融合，從而發(fā)揮免疫保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，針對S1蛋白的中和抗體滴度與機體對TGEV的抵抗力呈正相關(guān)，高滴度的中和抗體能夠有效降低病毒的感染和傳播。在細(xì)胞免疫中，T淋巴細(xì)胞被激活后，能夠殺傷被病毒感染的細(xì)胞，釋放細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，增強機體的免疫防御能力。此外，S1蛋白還能夠誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)，產(chǎn)生分泌型免疫球蛋白A（sIgA），sIgA能夠在腸道黏膜表面發(fā)揮免疫保護作用，阻止病毒的入侵。2.3S1基因研究現(xiàn)狀近年來，S1基因在豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的研究中備受關(guān)注，在疫苗研發(fā)、診斷技術(shù)等多個關(guān)鍵領(lǐng)域取得了一系列顯著進展，同時也面臨著諸多問題與挑戰(zhàn)。在疫苗研發(fā)領(lǐng)域，基于S1基因的疫苗研究成果頗豐。許多科研團隊將S1基因作為疫苗的關(guān)鍵組成部分，構(gòu)建了多種類型的基因工程疫苗，如重組病毒載體疫苗、DNA疫苗和亞單位疫苗等。重組病毒載體疫苗是將S1基因插入到腺病毒、痘病毒等病毒載體中，利用這些載體的高效感染性和免疫原性，將S1基因?qū)胨拗黧w內(nèi)，刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。研究表明，以腺病毒為載體的S1基因重組疫苗在動物實驗中能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的中和抗體，有效保護動物免受TGEV的感染。DNA疫苗則是直接將編碼S1蛋白的基因?qū)雱游锛?xì)胞內(nèi)，通過動物自身的細(xì)胞機制表達S1蛋白，從而激發(fā)免疫反應(yīng)。有研究報道，將S1基因的DNA疫苗肌肉注射小鼠后，小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了特異性的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，對TGEV的攻擊具有一定的抵抗力。亞單位疫苗是利用基因工程技術(shù)表達和純化S1蛋白，將其作為疫苗的有效成分。這種疫苗具有安全性高、免疫原性明確等優(yōu)點，在TGEV疫苗研發(fā)中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。然而，這些基于S1基因的疫苗在實際應(yīng)用中仍存在一些問題。例如，重組病毒載體疫苗可能存在載體本身的安全性問題，如潛在的免疫原性和致病性；DNA疫苗的免疫效果受到基因遞送效率和表達水平的影響，且可能存在整合到宿主基因組的風(fēng)險；亞單位疫苗的生產(chǎn)成本較高，大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)有待進一步完善，同時免疫佐劑的選擇和優(yōu)化也是提高其免疫效果的關(guān)鍵問題。在診斷技術(shù)方面，S1基因也發(fā)揮著重要作用?；赟1基因的分子診斷技術(shù)不斷涌現(xiàn)，為TGEV的快速、準(zhǔn)確診斷提供了有力支持。實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)是目前應(yīng)用較為廣泛的一種分子診斷方法，通過設(shè)計針對S1基因的特異性引物和探針，能夠快速、靈敏地檢測樣品中的TGEV核酸，實現(xiàn)對TGEV的早期診斷。有研究利用qPCR技術(shù)對臨床樣品進行檢測，結(jié)果顯示該方法的靈敏度和特異性均較高，能夠有效檢測出感染初期的TGEV。此外，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）技術(shù)也在TGEV診斷中得到應(yīng)用。LAMP技術(shù)具有操作簡單、反應(yīng)快速、對儀器設(shè)備要求低等優(yōu)點，適合在基層實驗室和現(xiàn)場檢測中使用。研究人員開發(fā)的基于S1基因的LAMP檢測方法，能夠在恒溫條件下快速擴增TGEV的核酸，通過肉眼觀察擴增產(chǎn)物的顏色變化即可判斷檢測結(jié)果，大大提高了檢測的便捷性。然而，這些診斷技術(shù)也面臨著一些挑戰(zhàn)。隨著TGEV的變異，S1基因的序列也可能發(fā)生變化，這可能導(dǎo)致引物和探針的特異性下降，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，需要不斷監(jiān)測TGEV的變異情況，及時更新引物和探針序列，以確保診斷技術(shù)的可靠性。此外，對于一些混合感染的病例，如何準(zhǔn)確區(qū)分TGEV與其他病原體也是診斷技術(shù)面臨的難題之一。在免疫機制研究方面，雖然已經(jīng)明確S1蛋白能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)，但對于其具體的免疫調(diào)節(jié)機制仍有待深入研究。例如，S1蛋白與宿主細(xì)胞表面受體的相互作用機制尚未完全闡明，這對于理解病毒的感染過程和免疫逃逸機制至關(guān)重要。此外，S1蛋白誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答如何與機體的其他免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)相互作用，以實現(xiàn)有效的免疫保護，也是當(dāng)前研究的熱點問題。S1基因在TGEV的研究中具有重要的地位，在疫苗研發(fā)、診斷技術(shù)等方面取得了一定的進展，但也面臨著諸多問題與挑戰(zhàn)。未來需要進一步深入研究S1基因的結(jié)構(gòu)與功能，優(yōu)化基于S1基因的疫苗和診斷技術(shù)，以更好地防控豬傳染性胃腸炎，保障養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。三、植物表達載體構(gòu)建原理與方法3.1植物表達載體的結(jié)構(gòu)與功能元件植物表達載體是實現(xiàn)外源基因在植物細(xì)胞中穩(wěn)定表達的關(guān)鍵工具，其結(jié)構(gòu)由多個重要的功能元件組成，這些元件協(xié)同作用，確保外源基因能夠準(zhǔn)確、高效地在植物細(xì)胞中表達。啟動子是植物表達載體中的關(guān)鍵元件之一，它位于基因的上游區(qū)域，是RNA聚合酶識別、結(jié)合并啟動轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。啟動子的活性直接影響著基因轉(zhuǎn)錄的起始頻率和強度，從而決定了外源基因的表達水平。根據(jù)其作用方式和特性，啟動子可分為組成型啟動子、組織特異性啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。組成型啟動子能夠在植物的各個組織和發(fā)育階段持續(xù)啟動基因的表達，如常見的花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子，它在植物的大多數(shù)組織中都具有較高的活性，廣泛應(yīng)用于植物基因工程中，驅(qū)動外源基因在植物體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定表達。組織特異性啟動子則具有組織表達特異性，僅在特定的組織或器官中啟動基因的表達，例如根特異性啟動子、葉特異性啟動子等。這種啟動子可以使外源基因在特定的組織中發(fā)揮作用，減少對植物其他組織的影響，提高基因表達的針對性。誘導(dǎo)型啟動子能夠響應(yīng)外界環(huán)境信號或化學(xué)物質(zhì)的刺激，在特定的誘導(dǎo)條件下啟動基因的表達。如熱激誘導(dǎo)啟動子在高溫條件下被激活，從而啟動下游基因的表達；化學(xué)誘導(dǎo)啟動子可在特定化學(xué)物質(zhì)的誘導(dǎo)下啟動基因表達，這種啟動子為精確調(diào)控外源基因的表達提供了有力手段。終止子位于基因的下游區(qū)域，其主要功能是終止轉(zhuǎn)錄過程。當(dāng)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄到終止子序列時，會停止轉(zhuǎn)錄，從而使mRNA的合成終止。終止子包含特定的核苷酸序列，能夠形成特殊的二級結(jié)構(gòu)，阻礙RNA聚合酶的繼續(xù)移動，促使轉(zhuǎn)錄終止。常見的終止子如胭脂堿合成酶基因（nos）終止子，它在植物基因表達載體中被廣泛應(yīng)用，確保轉(zhuǎn)錄過程的準(zhǔn)確終止，防止轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的過度延伸，保證mRNA的穩(wěn)定性和完整性。篩選標(biāo)記基因是植物表達載體中的另一個重要元件，其作用是在轉(zhuǎn)化過程中，幫助篩選出含有重組表達載體的細(xì)胞或植株。常見的篩選標(biāo)記基因包括抗生素抗性基因和除草劑抗性基因?？股乜剐曰蛉缈敲顾乜剐曰颍╪ptII），轉(zhuǎn)入該基因的植物細(xì)胞能夠在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上生長，而未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞則因?qū)敲顾孛舾卸鵁o法生長，從而通過這種方式篩選出轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞。除草劑抗性基因如草甘膦抗性基因，使轉(zhuǎn)化后的植物對草甘膦具有抗性，在含有草甘膦的環(huán)境中能夠存活，以此篩選出轉(zhuǎn)基因植株。篩選標(biāo)記基因的存在極大地提高了轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植株的篩選效率，是植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中不可或缺的元件。然而，隨著對轉(zhuǎn)基因生物安全性的關(guān)注，篩選標(biāo)記基因的使用也引發(fā)了一些爭議，如可能對環(huán)境和非目標(biāo)生物產(chǎn)生潛在影響等。因此，研究和開發(fā)更加安全、有效的篩選標(biāo)記基因或無篩選標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化技術(shù)成為了當(dāng)前的研究熱點之一。3.2常用植物表達載體類型在植物基因工程領(lǐng)域，為滿足不同的研究和應(yīng)用需求，科研人員開發(fā)出了多種類型的植物表達載體，每種載體都具有獨特的結(jié)構(gòu)特點、作用機制和適用范圍。質(zhì)粒載體是最為常用的植物表達載體之一，它通常由質(zhì)粒DNA構(gòu)成，能夠在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制并穩(wěn)定存在。常見的質(zhì)粒載體有Ti質(zhì)粒、pCAMBIA系列等。Ti質(zhì)粒是土壤農(nóng)桿菌中的一種天然質(zhì)粒，在植物基因工程中應(yīng)用極為廣泛。其獨特之處在于，Ti質(zhì)粒上的T-DNA（Transfer-DNA）片段能夠在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，并整合到植物基因組中，從而實現(xiàn)外源基因在植物細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達。pCAMBIA系列載體則是一類人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體，具有多克隆位點、篩選標(biāo)記基因等多種元件，方便外源基因的插入和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選，廣泛應(yīng)用于各種植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究。病毒載體利用病毒的自然侵染機制，將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞。例如，花椰菜花葉病毒（CaMV）和番茄叢矮病毒（TBSV）是兩種常用的植物病毒載體。CaMV具有廣泛的宿主范圍，能夠感染多種植物，其基因組為雙鏈DNA，易于進行基因操作。通過將外源基因插入CaMV基因組中，利用病毒的侵染能力，可將外源基因高效導(dǎo)入植物細(xì)胞，并在植物細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)高水平表達。TBSV是一種單鏈RNA病毒，其病毒粒子能夠在植物細(xì)胞內(nèi)快速復(fù)制和傳播。利用TBSV構(gòu)建的載體可以在植物細(xì)胞中高效表達外源基因，且表達產(chǎn)物能夠在植物體內(nèi)迅速擴散。病毒載體的優(yōu)點是轉(zhuǎn)化效率高、基因表達水平高，但其缺點是病毒載體可能會引起植物的病害反應(yīng)，且病毒載體的容量有限，難以插入較大的外源基因片段。原生質(zhì)體載體利用植物原生質(zhì)體的特性，將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞。這種載體通常與電穿孔技術(shù)結(jié)合使用，以提高轉(zhuǎn)化效率。原生質(zhì)體是去除細(xì)胞壁后的植物細(xì)胞，具有較強的攝取外源DNA的能力。通過將含有目的基因的載體與原生質(zhì)體混合，在電脈沖的作用下，使細(xì)胞膜產(chǎn)生瞬間的小孔，從而使載體DNA進入原生質(zhì)體中。原生質(zhì)體載體的優(yōu)點是可以直接將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，避免了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化過程中可能出現(xiàn)的T-DNA整合不穩(wěn)定等問題。然而，原生質(zhì)體的制備過程較為復(fù)雜，需要使用酶解法去除細(xì)胞壁，且原生質(zhì)體的培養(yǎng)和再生技術(shù)要求較高，限制了其廣泛應(yīng)用?；驑屳d體利用高速金粉或其他金屬顆粒作為載體，將目的基因直接導(dǎo)入植物細(xì)胞。這種方法適用于各種植物細(xì)胞，包括種子、葉片和愈傷組織等。基因槍轉(zhuǎn)化的原理是將包裹有目的基因的金屬顆粒在高壓氣體的驅(qū)動下，高速射向植物細(xì)胞，使金屬顆粒穿透細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，將目的基因帶入細(xì)胞內(nèi)?；驑屳d體的優(yōu)點是轉(zhuǎn)化不受植物種類和基因型的限制，能夠轉(zhuǎn)化多種難以用其他方法轉(zhuǎn)化的植物材料。但該方法也存在一些缺點，如轉(zhuǎn)化效率相對較低、外源基因整合位點隨機、可能導(dǎo)致基因沉默等問題。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體通常與Ti質(zhì)粒載體結(jié)合使用，利用土壤農(nóng)桿菌的侵染機制，將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞。農(nóng)桿菌是一種天然具有基因轉(zhuǎn)移能力的細(xì)菌，當(dāng)植物受到農(nóng)桿菌感染時，農(nóng)桿菌會將Ti質(zhì)粒上的T-DNA片段轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，并整合到植物基因組中。在構(gòu)建農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體時，科研人員通常會對Ti質(zhì)粒進行改造，去除其中的致瘤基因，保留T-DNA邊界序列和其他必需元件，同時插入外源基因和篩選標(biāo)記基因等。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體具有轉(zhuǎn)化效率高、整合位點相對明確、能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因的穩(wěn)定整合和表達等優(yōu)點，是目前應(yīng)用最為廣泛的植物表達載體類型之一。然而，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法也存在一定的局限性，如對某些植物種類的轉(zhuǎn)化效果不佳、轉(zhuǎn)化過程中可能出現(xiàn)嵌合體等問題。RNAi載體利用RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)，通過引入雙鏈RNA分子來抑制特定基因的表達。在植物基因功能研究和植物抗病性研究等方面，RNAi載體具有重要作用。RNAi是一種由雙鏈RNA介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)引入與靶基因互補的雙鏈RNA時，雙鏈RNA會被核酸酶切割成小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA），siRNA能夠與細(xì)胞內(nèi)的核酸酶等組成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC），RISC識別并結(jié)合靶mRNA，從而導(dǎo)致靶mRNA的降解，實現(xiàn)對靶基因表達的抑制。構(gòu)建RNAi載體時，需要將靶基因的一段反向重復(fù)序列插入到載體中，在植物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成雙鏈RNA，引發(fā)RNAi效應(yīng)。RNAi載體的優(yōu)點是能夠特異性地抑制目標(biāo)基因的表達，為研究基因功能提供了有力工具。但RNAi載體的設(shè)計和構(gòu)建需要考慮多種因素，如雙鏈RNA的長度、序列特異性等，以避免出現(xiàn)非特異性的基因沉默現(xiàn)象。CRISPR-Cas系統(tǒng)載體是一種新型的基因編輯技術(shù)載體，能夠精確地修改植物基因組中的特定基因序列。CRISPR-Cas系統(tǒng)來源于細(xì)菌和古細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，其中CRISPR（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats）是一段含有重復(fù)序列的DNA片段，Cas（CRISPR-associatedproteins）是與CRISPR相關(guān)的蛋白。在植物基因編輯中，常用的是CRISPR-Cas9系統(tǒng)，Cas9蛋白在向?qū)NA（guideRNA，gRNA）的引導(dǎo)下，能夠識別并切割與gRNA互補的DNA序列，造成DNA雙鏈斷裂。細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機制會對斷裂的DNA進行修復(fù)，在修復(fù)過程中可能會引入堿基的插入、缺失或替換等突變，從而實現(xiàn)對基因的定點編輯。構(gòu)建CRISPR-Cas9載體時，需要將Cas9基因和gRNA表達元件插入到載體中，轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞后，即可實現(xiàn)對目標(biāo)基因的編輯。CRISPR-Cas系統(tǒng)載體具有編輯效率高、操作簡單、成本低等優(yōu)點，在植物基因功能研究、作物遺傳改良等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。然而，CRISPR-Cas系統(tǒng)載體也可能會出現(xiàn)脫靶效應(yīng)，即對非目標(biāo)基因序列進行編輯，這是目前需要解決的關(guān)鍵問題之一。3.3載體構(gòu)建的基本方法與技術(shù)載體構(gòu)建是一項復(fù)雜而精細(xì)的技術(shù)，涉及多個關(guān)鍵步驟和技術(shù)手段，其中PCR擴增、限制性內(nèi)切酶酶切、連接反應(yīng)等是最為基礎(chǔ)且重要的技術(shù)，它們在載體構(gòu)建的流程中發(fā)揮著不可或缺的作用。PCR擴增技術(shù)是獲取目的基因的關(guān)鍵手段。其原理基于DNA半保留復(fù)制的特性，在DNA聚合酶、引物、dNTPs等物質(zhì)的參與下，通過高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個階段的循環(huán)，實現(xiàn)目的基因的指數(shù)級擴增。在豬傳染性胃腸炎病毒S1基因植物表達載體構(gòu)建中，首先需要根據(jù)已知的S1基因序列設(shè)計特異性引物。引物設(shè)計至關(guān)重要，其長度、GC含量、Tm值等參數(shù)都需要精確考量，以確保引物能夠與S1基因特異性結(jié)合，避免非特異性擴增。一般來說，引物長度控制在18-25bp較為合適，GC含量保持在40%-60%之間，Tm值盡量相近，差值最好不超過5℃。設(shè)計好引物后，以含有S1基因的DNA或cDNA為模板進行PCR擴增。反應(yīng)體系中除了模板、引物外，還需加入適量的DNA聚合酶、dNTPs、緩沖液等成分。在PCR儀中進行擴增反應(yīng)，經(jīng)過多輪循環(huán)后，即可獲得大量的S1基因擴增產(chǎn)物。擴增完成后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進行檢測，在紫外燈下觀察，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，則表明擴增成功，隨后可對目的基因條帶進行回收。限制性內(nèi)切酶酶切技術(shù)用于切割目的基因和載體，以產(chǎn)生可連接的末端。限制性內(nèi)切酶能夠識別特定的核苷酸序列，并在特定的位點切割DNA分子。在載體構(gòu)建中，需要根據(jù)目的基因和載體上的酶切位點，選擇合適的限制性內(nèi)切酶。選擇酶切位點時，要確保所選酶切位點在目的基因內(nèi)部不存在，避免對目的基因造成破壞，同時要考慮酶切效率、酶切反應(yīng)條件等因素。例如，常用的限制性內(nèi)切酶EcoRI識別的序列為GAATTC，在識別位點處將DNA雙鏈切斷。對PCR擴增得到的S1基因和選定的載體進行雙酶切反應(yīng)。反應(yīng)體系中加入適量的限制性內(nèi)切酶、緩沖液、目的基因和載體DNA等，在適宜的溫度（通常為37℃）下孵育一定時間，使酶切反應(yīng)充分進行。酶切反應(yīng)結(jié)束后，同樣通過1%瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進行檢測，若出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶，說明酶切成功，然后對酶切產(chǎn)物進行回收。連接反應(yīng)是將酶切后的目的基因與載體連接起來，形成重組表達載體。連接反應(yīng)通常使用T4DNA連接酶，它能夠催化DNA片段的5'-磷酸基團與3'-羥基之間形成磷酸二酯鍵，從而實現(xiàn)目的基因與載體的連接。將回收的酶切后的S1基因和載體按照一定的摩爾比混合，加入T4DNA連接酶和連接緩沖液，在16℃條件下進行過夜連接。連接反應(yīng)完成后，得到的重組表達載體需要轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中進行擴增。感受態(tài)細(xì)胞是經(jīng)過特殊處理的細(xì)胞，具有攝取外源DNA的能力。常用的感受態(tài)細(xì)胞如大腸桿菌DH5α，將連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中，通過熱激或電擊等方法，使重組表達載體進入感受態(tài)細(xì)胞。然后將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞涂布在含有相應(yīng)抗生素的固體培養(yǎng)基上，在適宜的溫度下培養(yǎng)過夜。由于重組表達載體中含有篩選標(biāo)記基因，如抗生素抗性基因，只有成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠在含有抗生素的培養(yǎng)基上生長，形成單菌落。挑取單菌落進行進一步的驗證。首先進行菌液PCR驗證，將挑取的單菌落接種到含有相應(yīng)抗性的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-5h，然后按照擴增目的基因所用的PCR體系加入各組分，以菌液為模板進行PCR擴增。同時設(shè)置水為模板的陰性對照組以及擴增的目的基因作為陽性對照組。反應(yīng)完畢后將所有樣品進行1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)條帶亮度以及位置初步判斷是否酶連成功。若菌液PCR結(jié)果顯示有與陽性對照位置一致的條帶，說明可能存在重組質(zhì)粒。為了進一步驗證，還需要進行酶切驗證。以目的片段的雙酶切組作為陽性對照，以空載的雙酶切組作為陰性對照，將反應(yīng)后樣品進行1%瓊脂糖凝膠電泳。若樣品組有與陽性對照組和陰性對照組位置一致的兩條帶，則進一步證明該重組質(zhì)粒連接成功。最后，將驗證正確的重組質(zhì)粒送至測序公司進行測序驗證，通過與原始S1基因序列進行比對，確保目的基因準(zhǔn)確無誤地插入到載體中，且無堿基突變等情況發(fā)生。四、豬傳染性胃腸炎病毒S1基因植物表達載體的構(gòu)建4.1實驗材料本實驗所需的病毒毒株為豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）標(biāo)準(zhǔn)毒株，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。該毒株經(jīng)過嚴(yán)格的鑒定和保存，具有良好的生物學(xué)特性和穩(wěn)定性，能夠為后續(xù)的基因克隆和載體構(gòu)建提供可靠的基因來源。載體選用pCAMBIA1300二元載體，購自上海生工生物工程有限公司。pCAMBIA1300載體具有廣泛的宿主范圍和高效的表達能力，其多克隆位點便于目的基因的插入，且含有卡那霉素抗性基因，可用于轉(zhuǎn)化子的篩選。此外，該載體還包含花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子，能夠驅(qū)動外源基因在植物細(xì)胞中高效表達。實驗中用到的工具酶種類豐富，包括限制性內(nèi)切酶EcoRI、HindIII，購自TaKaRa公司；T4DNA連接酶，同樣購自TaKaRa公司。限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII分別識別并切割特定的DNA序列，用于切割目的基因和載體，產(chǎn)生互補的粘性末端，以便后續(xù)的連接反應(yīng)。T4DNA連接酶則能夠催化DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，實現(xiàn)目的基因與載體的連接。主要試劑包括DNAMarkerDL2000、PCRMix、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒等。DNAMarkerDL2000購自天根生化科技（北京）有限公司，用于在瓊脂糖凝膠電泳中判斷DNA片段的大小。PCRMix購自全式金生物技術(shù)有限公司，包含了PCR反應(yīng)所需的DNA聚合酶、dNTPs、緩沖液等成分，可簡化PCR反應(yīng)體系的配置過程，提高實驗效率。質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒均購自O(shè)mega公司，質(zhì)粒提取試劑盒用于從細(xì)菌中提取高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA，凝膠回收試劑盒則用于從瓊脂糖凝膠中回收目的DNA片段，去除雜質(zhì)和引物二聚體等，保證DNA片段的純度和完整性。實驗前，需對病毒毒株進行復(fù)蘇和擴增。將凍存的TGEV標(biāo)準(zhǔn)毒株從液氮中取出，迅速放入37℃水浴中解凍，然后接種到長滿單層的豬腎細(xì)胞（PK-15）中，在含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后，收集病毒液，進行多次凍融和離心，獲得高滴度的病毒懸液，用于后續(xù)的基因提取。對于載體pCAMBIA1300，需進行大量提取和純化。將含有pCAMBIA1300載體的大腸桿菌接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，然后使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，通過酶切鑒定和測序驗證其正確性，確保載體的質(zhì)量和完整性。工具酶在使用前需仔細(xì)閱讀說明書，了解其儲存條件和使用方法。限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶需保存在-20℃冰箱中，使用時應(yīng)避免反復(fù)凍融，以保持其活性。在進行酶切和連接反應(yīng)時，需嚴(yán)格按照反應(yīng)體系和條件進行操作，確保反應(yīng)的順利進行。主要試劑在使用前需檢查其保質(zhì)期和外觀，如發(fā)現(xiàn)試劑有變質(zhì)或污染現(xiàn)象，應(yīng)及時更換。DNAMarkerDL2000在使用前需離心，使沉淀重新懸浮。PCRMix在使用前應(yīng)充分混勻，避免成分沉淀。質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒在使用時應(yīng)按照說明書的步驟進行操作，注意各試劑的加入量和反應(yīng)時間，以保證提取和回收的DNA質(zhì)量。4.2S1基因的克隆從豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）基因組中擴增S1基因是構(gòu)建植物表達載體的關(guān)鍵步驟。本實驗采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)進行擴增。首先，提取TGEV的基因組RNA。將適量的TGEV病毒懸液加入到含有Trizol試劑的離心管中，充分混勻，室溫靜置5min，使病毒裂解，釋放出RNA。然后加入氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min，4℃、12000r/min離心15min。離心后，溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機相。小心吸取上層水相至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min，4℃、12000r/min離心10min，使RNA沉淀。棄去上清，用75%乙醇洗滌RNA沉淀兩次，每次4℃、7500r/min離心5min，然后將RNA沉淀晾干，加入適量的無RNase水溶解，得到TGEV基因組RNA溶液。以提取的TGEV基因組RNA為模板，進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在PCR管中依次加入5×PrimeScriptBuffer4μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL、Random6-mers1μL、OligodTPrimer1μL、RNA模板1μg，用RNaseFreedH?O補足至20μL。輕輕混勻后，將PCR管放入PCR儀中，按照以下程序進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37℃15min，85℃5s，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，得到的cDNA可直接用于后續(xù)的PCR擴增，或保存于-20℃?zhèn)溆?。根?jù)GenBank中已登錄的TGEVS1基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物。上游引物序列為：5'-CGGAATTCATGGCAGTACTCCTGTT-3'（下劃線部分為EcoRI酶切位點），下游引物序列為：5'-CCCAAGCTTTTAGTCGGTGTTCTT-3'（下劃線部分為HindIII酶切位點）。引物由上海生工生物工程有限公司合成。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括2×TaqPCRMasterMix12.5μL、上游引物（10μmol/L）1μL、下游引物（10μmol/L）1μL、cDNA模板1μL，用ddH?O補足至25μL。將反應(yīng)體系輕輕混勻后，加入到PCR管中，放入PCR儀中進行擴增。PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1×TAE緩沖液中，以100V的電壓電泳30min，然后在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。若在約1.5kb處出現(xiàn)明亮的條帶，與預(yù)期的S1基因大小相符，則表明擴增成功。對擴增得到的S1基因PCR產(chǎn)物進行回收。將含有目的條帶的瓊脂糖凝膠切下，放入1.5mL離心管中，使用Omega公司的凝膠回收試劑盒進行回收。按照試劑盒說明書的步驟，依次進行凝膠溶解、吸附、洗滌和洗脫等操作，最終得到純化的S1基因片段。將回收的S1基因片段進行測序，測序工作委托北京六合華大基因科技股份有限公司完成。將測序結(jié)果與GenBank中已有的TGEVS1基因序列進行比對分析，使用DNAMAN軟件計算序列同源性。結(jié)果顯示，本實驗克隆得到的S1基因與參考序列的同源性達到98%以上，表明成功克隆出了TGEVS1基因，且序列正確，為后續(xù)的植物表達載體構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。4.3植物表達載體的選擇與改造在構(gòu)建豬傳染性胃腸炎病毒S1基因植物表達載體時，載體的選擇至關(guān)重要。本研究選用pCAMBIA1300二元載體，該載體具有諸多顯著優(yōu)勢，使其成為理想的選擇。pCAMBIA1300載體擁有廣泛的宿主范圍，能夠適用于多種植物物種的遺傳轉(zhuǎn)化。這一特性使得它在不同植物體系中都具有潛在的應(yīng)用價值，為后續(xù)將S1基因?qū)敕鸭?xì)胞提供了有力保障。其高效的表達能力也是一大亮點，包含的花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子，是一種組成型啟動子，能夠在植物的大多數(shù)組織和發(fā)育階段持續(xù)啟動基因的表達，從而驅(qū)動S1基因在番茄細(xì)胞中高效表達。這種持續(xù)且高效的表達對于獲得足夠量的S1蛋白，以激發(fā)動物機體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答至關(guān)重要。此外，pCAMBIA1300載體的多克隆位點為外源基因的插入提供了便利。多克隆位點含有多個獨特的限制性內(nèi)切酶識別序列，如EcoRI、HindIII等，這些酶切位點的存在使得在載體構(gòu)建過程中，能夠精確地將S1基因定向插入到載體的特定位置，確?；虻恼_插入方向和閱讀框架，有利于后續(xù)基因的穩(wěn)定表達和功能發(fā)揮。而且，該載體攜帶的卡那霉素抗性基因可作為篩選標(biāo)記，在轉(zhuǎn)化過程中，只有成功導(dǎo)入了含有卡那霉素抗性基因載體的細(xì)胞或植株，才能在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上生長，從而方便地篩選出轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞或植株，極大地提高了篩選效率。為了使pCAMBIA1300載體更適合S1基因的表達，對其進行了一系列改造。首先，根據(jù)S1基因兩端的酶切位點，選用EcoRI和HindIII對pCAMBIA1300載體進行雙酶切。將1μg的pCAMBIA1300載體加入到含有10UEcoRI、10UHindIII、10×Buffer2μL的反應(yīng)體系中，用ddH?O補足至20μL，37℃水浴反應(yīng)3h。酶切后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進行檢測，以確保載體被成功切割。酶切后的載體需要進行去磷酸化處理，以防止載體自身環(huán)化。加入1U的小牛腸堿性磷酸酶（CIP）到酶切產(chǎn)物中，37℃反應(yīng)30min，然后使用酚-氯仿抽提法純化載體片段，去除酶和其他雜質(zhì)。將回收的酶切后的S1基因片段與去磷酸化處理后的pCAMBIA1300載體進行連接反應(yīng)。按照載體與目的基因摩爾比為1:3-1:5的比例，將二者混合于連接反應(yīng)體系中，加入1μLT4DNA連接酶和10×T4DNALigaseBuffer2μL，用ddH?O補足至20μL，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。將連接產(chǎn)物加入到100μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min，然后42℃熱激90s，迅速置于冰上冷卻3-5min。加入900μL無抗LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)并表達卡那霉素抗性基因。將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜，次日挑取單菌落進行后續(xù)驗證。4.4S1基因與植物表達載體的連接與轉(zhuǎn)化將克隆得到的S1基因定向插入改造后的pCAMBIA1300載體中，構(gòu)建重組植物表達載體。連接反應(yīng)體系中，含有100ng經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切并回收的pCAMBIA1300載體片段，300ng同樣經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切并回收的S1基因片段，1μLT4DNA連接酶以及2μL10×T4DNA連接酶緩沖液，用ddH?O補足至20μL。將上述反應(yīng)體系輕輕混勻后，16℃連接過夜，使S1基因與載體片段在T4DNA連接酶的作用下，通過堿基互補配對原則，在酶切產(chǎn)生的粘性末端處形成穩(wěn)定的磷酸二酯鍵，從而實現(xiàn)兩者的連接。連接產(chǎn)物需轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中進行擴增和篩選。本實驗選用大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將2μL連接產(chǎn)物加入到100μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，冰浴30min，使連接產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞充分接觸，增強細(xì)胞膜對DNA的吸附能力。隨后42℃熱激90s，這一短暫的高溫處理能夠使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，形成一些小孔，有利于連接產(chǎn)物進入細(xì)胞內(nèi)部。熱激后迅速置于冰上冷卻3-5min，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)恢復(fù)穩(wěn)定，防止連接產(chǎn)物從細(xì)胞中逸出。接著加入900μL無抗LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，讓細(xì)菌恢復(fù)正常的生長代謝狀態(tài)，同時表達卡那霉素抗性基因，為后續(xù)在含卡那霉素的培養(yǎng)基上篩選陽性克隆提供條件。將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上，正面向上放置半小時，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)過夜。在培養(yǎng)過程中，只有成功導(dǎo)入了含有卡那霉素抗性基因重組表達載體的大腸桿菌才能在該培養(yǎng)基上生長，形成單菌落，而未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌則因?qū)敲顾孛舾袩o法生長。次日，從平板上挑取單菌落進行進一步的驗證，以確定重組表達載體是否成功導(dǎo)入大腸桿菌，以及S1基因是否正確插入載體中。4.5重組表達載體的鑒定對轉(zhuǎn)化后在含卡那霉素LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落進行重組表達載體的鑒定，采用多種方法從不同層面驗證重組載體的正確性和完整性，確保后續(xù)實驗的可靠性。首先進行菌液PCR驗證。挑取平板上的單菌落，接種到含有5mLLB液體培養(yǎng)基（含50μg/mL卡那霉素）的試管中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)4-5h，使細(xì)菌大量繁殖。按照之前擴增S1基因的PCR體系，在PCR管中依次加入2×TaqPCRMasterMix12.5μL、上游引物（10μmol/L）1μL、下游引物（10μmol/L）1μL、菌液1μL，用ddH?O補足至25μL。同時設(shè)置陰性對照組（以無菌水代替菌液）和陽性對照組（以之前克隆得到的S1基因PCR產(chǎn)物為模板）。將PCR管放入PCR儀，按照94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min的程序進行擴增。擴增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在1×TAE緩沖液中，100V電壓下電泳30min，然后在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。若陰性對照組無條帶出現(xiàn)，陽性對照組在約1.5kb處出現(xiàn)明亮條帶，且樣品組在相同位置出現(xiàn)與陽性對照大小一致的條帶，則初步表明重組質(zhì)粒中含有S1基因，酶連可能成功。接著進行酶切驗證。從菌液PCR驗證為陽性的試管中提取質(zhì)粒，采用EcoRI和HindIII對提取的質(zhì)粒進行雙酶切。酶切反應(yīng)體系為：質(zhì)粒2μg、EcoRI10U、HindIII10U、10×Buffer2μL，用ddH?O補足至20μL，37℃水浴反應(yīng)3h。同時設(shè)置陽性對照組（以已知正確連接S1基因的重組質(zhì)粒進行雙酶切）和陰性對照組（以空載pCAMBIA1300載體進行雙酶切）。酶切結(jié)束后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在電泳結(jié)果中，若陰性對照組只出現(xiàn)載體條帶，陽性對照組出現(xiàn)載體條帶和大小約為1.5kb的S1基因條帶，且樣品組出現(xiàn)與陽性對照組位置一致的兩條帶，則進一步證明重組質(zhì)粒連接成功，S1基因已正確插入到載體中。最后進行測序驗證。將酶切驗證正確的重組質(zhì)粒送至專業(yè)測序公司（如北京六合華大基因科技股份有限公司）進行測序。測序完成后，將測得的序列與GenBank中已登錄的TGEVS1基因序列進行比對分析，使用DNAMAN軟件計算序列同源性。若比對結(jié)果顯示測序序列與參考序列的同源性達到98%以上，且無堿基突變、缺失或插入等異常情況，則最終確認(rèn)重組表達載體構(gòu)建成功，S1基因已準(zhǔn)確無誤地插入到pCAMBIA1300載體中，可用于后續(xù)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化實驗。五、番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立5.1番茄組織培養(yǎng)技術(shù)番茄組織培養(yǎng)技術(shù)是基于植物細(xì)胞全能性理論發(fā)展而來的重要生物技術(shù)。植物細(xì)胞全能性指的是植物體的每個細(xì)胞都攜帶著一套完整的基因組，具備發(fā)育成完整植株的潛在能力。在適宜的條件下，已經(jīng)分化的植物細(xì)胞能夠脫分化，恢復(fù)分裂能力，進而再分化形成完整植株。番茄組織培養(yǎng)正是利用這一原理，將番茄的離體組織、器官或細(xì)胞在無菌環(huán)境下培養(yǎng)，使其生長、分化，最終發(fā)育成完整的番茄植株。外植體的選擇是番茄組織培養(yǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，不同的外植體其分化能力和再生能力存在差異。常見的番茄外植體有子葉、下胚軸、葉片、莖段等。子葉作為外植體，具有細(xì)胞分裂能力強、分化速度快的優(yōu)點，在合適的培養(yǎng)條件下，能夠較快地誘導(dǎo)出愈傷組織，并進一步分化成芽和根。下胚軸也是常用的外植體，其細(xì)胞活力較高，易于培養(yǎng)，能夠為組織培養(yǎng)提供良好的細(xì)胞來源。葉片和莖段同樣可以作為外植體，但在培養(yǎng)過程中，可能需要更加精細(xì)的處理和調(diào)控，以提高其分化和再生能力。在選擇外植體時，需要考慮外植體的生理狀態(tài)、發(fā)育階段以及取材部位等因素。一般來說，選擇生長健壯、無病蟲害的番茄植株上的外植體，能夠提高組織培養(yǎng)的成功率。同時，外植體的發(fā)育階段也會影響其培養(yǎng)效果，例如，處于幼嫩階段的子葉和下胚軸，其細(xì)胞的分化和再生能力通常較強。此外，取材部位的不同也可能導(dǎo)致外植體的培養(yǎng)差異，因此需要根據(jù)具體的實驗?zāi)康暮鸵?，選擇合適的外植體和取材部位。培養(yǎng)基是番茄組織培養(yǎng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，其配方直接影響著外植體的生長、分化和再生。常用的番茄組織培養(yǎng)培養(yǎng)基有MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基等，其中MS培養(yǎng)基應(yīng)用最為廣泛。MS培養(yǎng)基含有豐富的大量元素、微量元素、有機物和鐵鹽等營養(yǎng)成分，能夠為番茄外植體的生長提供全面的營養(yǎng)支持。在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，還需要添加植物激素、糖、維生素、氨基酸等成分，以滿足外植體不同生長階段的需求。植物激素在番茄組織培養(yǎng)中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，常見的植物激素有生長素類（如NAA、IAA、IBA等）和細(xì)胞分裂素類（如6-BA、KT等）。不同種類和濃度的植物激素組合，能夠誘導(dǎo)外植體發(fā)生不同的生長和分化反應(yīng)。例如，較高濃度的細(xì)胞分裂素與較低濃度的生長素組合，有利于誘導(dǎo)外植體分化出芽；而較高濃度的生長素與較低濃度的細(xì)胞分裂素組合，則有利于誘導(dǎo)外植體生根。糖在培養(yǎng)基中主要作為碳源，為外植體的生長提供能量，常用的糖有蔗糖、葡萄糖等。維生素和氨基酸等成分能夠促進外植體的生長和分化，提高培養(yǎng)效果。此外，培養(yǎng)基的pH值也需要嚴(yán)格控制，一般番茄組織培養(yǎng)培養(yǎng)基的pH值在5.6-5.8之間，適宜的pH值能夠保證培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的有效性和穩(wěn)定性，促進外植體的生長。培養(yǎng)條件的控制對于番茄組織培養(yǎng)的成功至關(guān)重要。溫度是影響外植體生長和分化的重要因素之一，一般番茄組織培養(yǎng)的適宜溫度為25℃左右。在這個溫度下，外植體的細(xì)胞代謝活動較為活躍，能夠正常進行分裂、分化等生理過程。如果溫度過高或過低，都會影響外植體的生長和發(fā)育，甚至導(dǎo)致外植體死亡。光照條件也對外植體的生長和分化有著顯著影響。在番茄組織培養(yǎng)過程中，通常需要提供12-16小時/天的光照，光照強度一般控制在1000-2000勒克斯。光照能夠促進外植體的光合作用，為其生長提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。同時，光照還能夠調(diào)節(jié)植物激素的合成和分布，影響外植體的分化和發(fā)育。例如，在誘導(dǎo)芽分化的階段，適當(dāng)?shù)墓庹漳軌虼龠M細(xì)胞分裂素的合成，有利于芽的形成。濕度也是培養(yǎng)條件中的一個重要因素，一般要求培養(yǎng)環(huán)境的相對濕度保持在60%-80%之間。適宜的濕度能夠防止外植體過度失水，保持其細(xì)胞的正常生理功能。如果濕度過低，外植體會因失水而干枯；濕度過高，則容易導(dǎo)致微生物滋生，污染培養(yǎng)基和外植體。此外，培養(yǎng)過程中的無菌操作也是至關(guān)重要的，需要在無菌操作室或超凈工作臺中進行操作，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，避免微生物污染，確保外植體能夠在無菌的環(huán)境中生長和發(fā)育。5.2番茄遺傳轉(zhuǎn)化方法番茄遺傳轉(zhuǎn)化方法眾多，每種方法都有其獨特的原理、操作流程、優(yōu)勢和局限性，在實際應(yīng)用中，需根據(jù)具體的研究目的和實驗條件進行合理選擇。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前應(yīng)用最為廣泛的番茄遺傳轉(zhuǎn)化方法。其原理基于農(nóng)桿菌的天然特性，農(nóng)桿菌是一種革蘭氏陰性土壤桿菌，其中根癌農(nóng)桿菌含有Ti質(zhì)粒，發(fā)根農(nóng)桿菌含有Ri質(zhì)粒。在自然狀態(tài)下，農(nóng)桿菌能夠通過傷口侵染植物，將Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒上的T-DNA片段轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中。在番茄遺傳轉(zhuǎn)化中，將構(gòu)建好的含有目的基因（如豬傳染性胃腸炎病毒S1基因）的重組表達載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，利用農(nóng)桿菌感染番茄的外植體，如子葉、下胚軸等。農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)過程中，T-DNA攜帶目的基因進入番茄細(xì)胞，并整合到基因組中，實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。該方法具有操作相對簡單、成本較低的優(yōu)點，不需要復(fù)雜昂貴的儀器設(shè)備，易于在實驗室和生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。轉(zhuǎn)化效率相對較高，能夠?qū)⑤^大片段的外源DNA導(dǎo)入番茄細(xì)胞，且導(dǎo)入的外源基因拷貝數(shù)低，整合位點相對明確，有利于目的基因的穩(wěn)定表達和遺傳。然而，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法也存在一定的局限性。它對宿主范圍有一定的限制，并非所有番茄品種都能高效轉(zhuǎn)化，某些基因型的番茄可能對農(nóng)桿菌侵染不敏感，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率低下。轉(zhuǎn)化過程較為復(fù)雜，涉及到農(nóng)桿菌的培養(yǎng)、外植體的處理、共培養(yǎng)條件的優(yōu)化等多個環(huán)節(jié)，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都可能影響轉(zhuǎn)化效果。此外，該方法還可能存在T-DNA的隨機整合，導(dǎo)致基因沉默或插入突變等問題，影響轉(zhuǎn)基因植株的穩(wěn)定性和安全性?；驑屴Z擊法是利用高速金屬顆粒（如金粉或鎢粉）作為載體，將包裹有目的基因的金屬顆粒在高壓氣體（如氦氣）的驅(qū)動下，高速射向番茄細(xì)胞。這些金屬顆粒能夠穿透細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，將目的基因帶入細(xì)胞內(nèi)，隨后目的基因整合到植物基因組中實現(xiàn)轉(zhuǎn)化?；驑屴Z擊法的優(yōu)點是不受植物基因型的限制，幾乎可以用于所有番茄品種的遺傳轉(zhuǎn)化。對受體材料的要求相對較低，不僅可以轉(zhuǎn)化番茄的外植體，還可以轉(zhuǎn)化種子、愈傷組織等多種材料。然而，基因槍轟擊法也存在一些缺點。轉(zhuǎn)化效率較低，大量的金屬顆粒在轟擊過程中可能對細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡或轉(zhuǎn)化失敗。外源基因的整合位點隨機，可能會插入到基因組的非編碼區(qū)或重要功能基因區(qū)域，影響植物的正常生長發(fā)育，且容易出現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象。此外，基因槍設(shè)備價格昂貴，運行成本高，需要專業(yè)的技術(shù)人員操作和維護，限制了其在一些實驗室和研究機構(gòu)的廣泛應(yīng)用。電擊法是通過高壓電脈沖處理番茄細(xì)胞或原生質(zhì)體，使細(xì)胞膜產(chǎn)生瞬間的小孔，從而使外源DNA能夠進入細(xì)胞內(nèi)。在電擊過程中，合適的電場強度、脈沖時間和脈沖次數(shù)等參數(shù)至關(guān)重要，這些參數(shù)會影響細(xì)胞膜的通透性和細(xì)胞的存活率。電擊法的優(yōu)點是操作相對簡單，能夠快速處理大量的細(xì)胞或原生質(zhì)體。對細(xì)胞的損傷相對較小，在一定程度上可以提高轉(zhuǎn)化細(xì)胞的存活率。然而，電擊法也有其局限性。轉(zhuǎn)化效率較低，需要優(yōu)化電擊參數(shù)以提高轉(zhuǎn)化效果，但不同番茄品種和細(xì)胞類型對電擊條件的要求差異較大，優(yōu)化過程較為繁瑣。該方法對儀器設(shè)備要求較高，需要專門的電穿孔儀，增加了實驗成本。此外，電擊法可能會導(dǎo)致細(xì)胞的生理功能受到一定影響，從而影響轉(zhuǎn)基因植株的生長和發(fā)育。PEG介導(dǎo)法利用聚乙二醇（PEG）改變細(xì)胞膜的通透性，使外源DNA能夠進入番茄原生質(zhì)體。PEG是一種高分子聚合物，它能夠與細(xì)胞膜表面的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)相互作用，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，形成一些微小的通道，便于外源DNA進入細(xì)胞。PEG介導(dǎo)法的優(yōu)點是可以直接將外源基因?qū)朐|(zhì)體，避免了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化過程中可能出現(xiàn)的T-DNA整合不穩(wěn)定等問題。該方法相對簡單，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備。然而，PEG介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)化效率較低，原生質(zhì)體的制備過程較為復(fù)雜，需要使用酶解法去除細(xì)胞壁，且原生質(zhì)體的培養(yǎng)和再生技術(shù)要求較高，限制了其廣泛應(yīng)用。此外，PEG對細(xì)胞有一定的毒性，在處理過程中需要嚴(yán)格控制PEG的濃度和處理時間，以減少對細(xì)胞的傷害。花粉管通道法是在番茄授粉后，利用花粉萌發(fā)形成的花粉管通道，將外源DNA導(dǎo)入受精卵或早期胚胎細(xì)胞中。具體操作是在番茄開花授粉后的一定時間內(nèi)，將含有目的基因的DNA溶液注射到花柱中，使外源DNA沿著花粉管進入胚囊，實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。花粉管通道法的優(yōu)點是操作簡單，不需要進行組織培養(yǎng)和原生質(zhì)體制備等復(fù)雜過程，直接在植株上進行操作，減少了實驗步驟和成本。該方法能夠避免組織培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)的變異和遺傳不穩(wěn)定等問題。然而，花粉管通道法的轉(zhuǎn)化效率較低，且重復(fù)性較差，受授粉時間、注射部位和DNA溶液濃度等多種因素的影響。此外，該方法對實驗技術(shù)要求較高，需要準(zhǔn)確掌握授粉時間和注射技巧，否則難以獲得理想的轉(zhuǎn)化效果。綜合比較以上幾種番茄遺傳轉(zhuǎn)化方法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法雖然存在宿主范圍限制和轉(zhuǎn)化過程復(fù)雜等問題，但因其操作簡單、成本低、轉(zhuǎn)化效率較高、外源基因整合位點相對明確等優(yōu)點，在番茄遺傳轉(zhuǎn)化研究中具有明顯的優(yōu)勢，更適合本研究將豬傳染性胃腸炎病毒S1基因轉(zhuǎn)化到番茄中的需求。因此，本研究選擇農(nóng)桿菌介導(dǎo)法作為番茄遺傳轉(zhuǎn)化的方法，并對其轉(zhuǎn)化條件進行優(yōu)化，以提高轉(zhuǎn)化效率和成功率。5.3影響番茄遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素番茄遺傳轉(zhuǎn)化效率受到多種因素的綜合影響，深入研究這些因素對于優(yōu)化轉(zhuǎn)化體系、提高轉(zhuǎn)化成功率具有重要意義。在本研究中，主要探討了外植體類型、農(nóng)桿菌濃度、侵染時間、共培養(yǎng)條件等關(guān)鍵因素對番茄遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響。外植體類型是影響番茄遺傳轉(zhuǎn)化效率的重要因素之一。不同的外植體由于其細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生理狀態(tài)和分化能力的差異，對農(nóng)桿菌侵染和轉(zhuǎn)化的響應(yīng)也各不相同。在番茄遺傳轉(zhuǎn)化中，常用的外植體有子葉、下胚軸和葉片等。子葉作為外植體，具有細(xì)胞分裂能力強、分化速度快的優(yōu)勢，其細(xì)胞相對幼嫩，細(xì)胞壁較薄，有利于農(nóng)桿菌的侵染和T-DNA的整合。研究表明，以子葉為外植體進行番茄遺傳轉(zhuǎn)化時，轉(zhuǎn)化效率相對較高，能夠較快地誘導(dǎo)出愈傷組織，并進一步分化成芽和根。下胚軸同樣是常用的外植體，其細(xì)胞活力較高，含有較多的分生組織細(xì)胞，在適宜的培養(yǎng)條件下，能夠為轉(zhuǎn)化提供良好的細(xì)胞來源。然而，下胚軸的轉(zhuǎn)化效率可能受到其取材部位和生理狀態(tài)的影響，一般來說，靠近根尖和莖尖的下胚軸部位轉(zhuǎn)化效率較高。葉片作為外植體，雖然其表面積較大，易于操作，但由于葉片細(xì)胞已經(jīng)高度分化，細(xì)胞壁較厚，可能會影響農(nóng)桿菌的侵染和轉(zhuǎn)化效率。此外，葉片在培養(yǎng)過程中容易受到微生物污染，需要更加嚴(yán)格的消毒處理。因此，在選擇外植體時，需要綜合考慮外植體的類型、生理狀態(tài)和取材部位等因素，以提高番茄遺傳轉(zhuǎn)化效率。農(nóng)桿菌濃度對番茄遺傳轉(zhuǎn)化效率也有著顯著的影響。農(nóng)桿菌濃度過低，會導(dǎo)致農(nóng)桿菌與外植體的接觸機會減少，從而降低T-DNA的轉(zhuǎn)移頻率，使轉(zhuǎn)化效率降低。在實驗中，當(dāng)農(nóng)桿菌菌液的OD600值低于0.4時，轉(zhuǎn)化效率明顯下降，獲得的轉(zhuǎn)基因植株數(shù)量較少。然而，農(nóng)桿菌濃度過高，又會對外植體造成過度侵染，導(dǎo)致外植體生長受到抑制，甚至死亡。當(dāng)農(nóng)桿菌菌液的OD600值高于0.8時，外植體在共培養(yǎng)過程中容易出現(xiàn)褐化、壞死等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)化效率。因此，選擇合適的農(nóng)桿菌濃度至關(guān)重要。經(jīng)過多次實驗摸索，發(fā)現(xiàn)當(dāng)農(nóng)桿菌菌液的OD600值在0.5-0.6之間時，能夠在保證外植體正常生長的前提下，獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。此時，農(nóng)桿菌能夠與外植體充分接觸，有效地將T-DNA轉(zhuǎn)移到外植體細(xì)胞中，同時又不會對外植體造成過大的傷害。侵染時間是影響番茄遺傳轉(zhuǎn)化效率的另一個關(guān)鍵因素。侵染時間過短，農(nóng)桿菌無法充分將T-DNA轉(zhuǎn)移到外植體細(xì)胞中，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率低下。在實驗中，當(dāng)侵染時間不足10分鐘時，轉(zhuǎn)化效率明顯偏低，大部分外植體未能成功轉(zhuǎn)化。而侵染時間過長，外植體可能會受到過度侵染，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，影響后續(xù)的生長和分化。當(dāng)侵染時間超過30分鐘時，外植體的存活率降低，且轉(zhuǎn)化后的愈傷組織生長緩慢，分化能力下降。因此，需要根據(jù)外植體的類型和農(nóng)桿菌的濃度，合理確定侵染時間。對于子葉外植體，在農(nóng)桿菌菌液OD600值為0.5-0.6的條件下，侵染時間以15-20分鐘為宜。此時，農(nóng)桿菌能夠充分侵染外植體，將T-DNA有效地導(dǎo)入細(xì)胞中，同時又能保證外植體的活力，有利于后續(xù)的轉(zhuǎn)化和植株再生。共培養(yǎng)條件對番茄遺傳轉(zhuǎn)化效率也起著重要的作用。共培養(yǎng)溫度是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素之一。一般來說，番茄遺傳轉(zhuǎn)化的適宜共培養(yǎng)溫度為25℃左右。在這個溫度下，農(nóng)桿菌的生長和代謝活動較為活躍，能夠有效地將T-DNA轉(zhuǎn)移到外植體細(xì)胞中。同時，適宜的溫度也有利于外植體細(xì)胞的生長和修復(fù)，減少農(nóng)桿菌侵染對外植體造成的傷害。如果共培養(yǎng)溫度過高或過低，都會影響農(nóng)桿菌的活性和外植體的生長，從而降低轉(zhuǎn)化效率。共培養(yǎng)時間也對轉(zhuǎn)化效率有顯著影響。共培養(yǎng)時間過短，T-DNA可能無法完成整合和表達，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化失敗。而共培養(yǎng)時間過長，外植體容易受到農(nóng)桿菌的過度侵染，出現(xiàn)褐化、壞死等現(xiàn)象，同樣會降低轉(zhuǎn)化效率。經(jīng)過實驗驗證，番茄遺傳轉(zhuǎn)化的適宜共培養(yǎng)時間為2-3天。在這個時間段內(nèi)，農(nóng)桿菌能夠?qū)-DNA成功轉(zhuǎn)移并整合到外植體細(xì)胞基因組中，同時外植體也能夠保持較好的生長狀態(tài)，有利于后續(xù)的篩選和植株再生。共培養(yǎng)過程中的光照條件也會對轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生一定影響。適當(dāng)?shù)墓庹漳軌虼龠M外植體的光合作用，為其生長和分化提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。在共培養(yǎng)過程中，提供12-16小時/天的光照，光照強度控制在1000-2000勒克斯，有助于提高番茄遺傳轉(zhuǎn)化效率。外植體類型、農(nóng)桿菌濃度、侵染時間和共培養(yǎng)條件等因素對番茄遺傳轉(zhuǎn)化效率有著顯著的影響。在實際操作中，需要綜合考慮這些因素，通過優(yōu)化實驗條件，提高番茄遺傳轉(zhuǎn)化效率，為后續(xù)的轉(zhuǎn)基因番茄研究和應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。六、S1基因轉(zhuǎn)化番茄及檢測分析6.1農(nóng)桿菌介導(dǎo)的S1基因轉(zhuǎn)化番茄本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將攜帶S1基因表達載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化到番茄中。首先，將構(gòu)建好的重組表達載體pCAMBIA1300-S1轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中。將1μL重組質(zhì)粒加入到100μL農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min，然后液氮速凍5min，37℃水浴熱激5min，迅速置于冰上冷卻3-5min。加入900μL無抗LB液體培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)2-3h，使農(nóng)桿菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)并表達重組載體上的抗性基因。將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌菌液涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）和利福平（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2-3天，待長出單菌落。挑取單菌落接種到含有5mLLB液體培養(yǎng)基（含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平）的試管中，28℃、220rpm振蕩培養(yǎng)過夜，使農(nóng)桿菌大量繁殖。次日，將菌液轉(zhuǎn)接至50mLLB液體培養(yǎng)基（含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平）中，繼續(xù)培養(yǎng)至菌液OD600值達到0.5-0.6。將菌液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，5000r/min離心10min，收集菌體，用MS液體培養(yǎng)基重懸菌體，調(diào)整菌液OD600值至0.5，用于侵染番茄外植體。選取生長健壯、無病蟲害的番茄種子，用75%乙醇浸泡30s，然后用0.1%升汞消毒8-10min，期間不斷振蕩，使種子表面充分消毒。消毒后，用無菌水沖洗種子5-6次，去除殘留的消毒劑。將種子接種到MS固體培養(yǎng)基上，25℃、16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)，待種子萌發(fā)長出幼苗。當(dāng)幼苗長至2-3片真葉時，選取子葉作為外植體。將子葉從幼苗上切下，剪成0.5cm×0.5cm大小的方塊，放入上述準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌菌液中，侵染15-20min，期間輕輕搖晃，使外植體與農(nóng)桿菌充分接觸。侵染結(jié)束后，用無菌濾紙吸干外植體表面多余的菌液，將外植體接種到共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA）上，25℃、黑暗條件下共培養(yǎng)2-3天。共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基（MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+50mg/L卡那霉素+300mg/L頭孢噻肟鈉）上，25℃、16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)，每2-3周更換一次篩選培養(yǎng)基，篩選出抗性愈傷組織和抗性芽。當(dāng)抗性芽長至2-3cm時，將其切下，接種到生根培養(yǎng)基（MS+0.1mg/LNAA+50mg/L卡那霉素+300mg/L頭孢噻肟鈉）上，25℃、16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)生根。待根系發(fā)育良好后，將轉(zhuǎn)基因番茄植株移栽到裝有營養(yǎng)土的花盆中，在溫室中