基于空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)解析原發(fā)性肝癌空間異質(zhì)性：洞察與展望一、引言1.1研究背景與意義原發(fā)性肝癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。它是指起源于肝細(xì)胞和肝內(nèi)膽管細(xì)胞的惡性腫瘤，主要包括肝細(xì)胞癌（HCC）、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌（ICC）和混合型肝癌，其中肝細(xì)胞癌約占肝癌的90%以上。原發(fā)性肝癌具有極高的發(fā)病率與死亡率，在我國，它是常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，死亡率在所有惡性腫瘤中位居前列。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年新增肝癌患者數(shù)量眾多，而我國在其中占據(jù)相當(dāng)大的比例，且多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，治療手段有限，預(yù)后效果較差。肝癌病情進(jìn)展迅速，主要與肝臟血供豐富，臨近重要的器官和組織等因素相關(guān)，這使得腫瘤容易通過血行轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致肝內(nèi)以及其他部位的轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步加大了治療難度。腫瘤異質(zhì)性是腫瘤研究中的一個(gè)關(guān)鍵問題，也是癌癥治療面臨的重大挑戰(zhàn)之一。在原發(fā)性肝癌中，這種異質(zhì)性尤為顯著，它涵蓋了腫瘤細(xì)胞在基因、表型、代謝等多方面的差異。即使在同一腫瘤組織內(nèi)，不同部位的腫瘤細(xì)胞也可能具有不同的生物學(xué)特性。腫瘤異質(zhì)性會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)治療藥物的敏感性存在差異，使得傳統(tǒng)的病理診斷方法難以準(zhǔn)確識(shí)別腫瘤的類型和亞型，進(jìn)而影響治療效果。某些腫瘤細(xì)胞可能會(huì)對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療抵抗，這也是腫瘤治療中經(jīng)常面臨的難題之一。腫瘤異質(zhì)性還與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，具有高異質(zhì)性的腫瘤通常更具侵襲性和轉(zhuǎn)移性，預(yù)后相對(duì)較差。因此，深入理解原發(fā)性肝癌的異質(zhì)性對(duì)于提高肝癌的診斷準(zhǔn)確性、優(yōu)化治療方案以及改善患者預(yù)后具有至關(guān)重要的意義?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)作為一項(xiàng)新興的前沿技術(shù)，為解決腫瘤異質(zhì)性問題提供了全新的視角和有力的工具。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)雖然能夠揭示細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的整體情況，但無法提供基因表達(dá)的空間位置信息，而空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)則突破了這一局限，它能夠在保留組織空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，對(duì)組織內(nèi)的基因表達(dá)進(jìn)行原位檢測，從而實(shí)現(xiàn)了從空間維度對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行研究。通過該技術(shù)，可以清晰地了解不同細(xì)胞類型在組織中的具體分布位置以及它們之間的相互關(guān)系，這對(duì)于深入探究腫瘤微環(huán)境中各種細(xì)胞之間的復(fù)雜相互作用機(jī)制至關(guān)重要。例如，在肝癌研究中，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)可以幫助我們確定腫瘤細(xì)胞與周圍免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等在空間上的分布特征，揭示它們之間的信號(hào)傳導(dǎo)通路和相互調(diào)控關(guān)系，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)還有助于我們理解腫瘤異質(zhì)性在空間上的表現(xiàn)形式和變化規(guī)律，為制定更加精準(zhǔn)的個(gè)性化治療策略提供科學(xué)依據(jù)。綜上所述，原發(fā)性肝癌的嚴(yán)重性和腫瘤異質(zhì)性對(duì)現(xiàn)有治療手段提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，而空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)為攻克原發(fā)性肝癌帶來了新的希望。通過運(yùn)用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)原發(fā)性肝癌的空間異質(zhì)性進(jìn)行深入研究，有望揭示肝癌發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制，為肝癌的早期診斷、精準(zhǔn)治療以及預(yù)后評(píng)估提供創(chuàng)新性的方法和策略，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2原發(fā)性肝癌概述原發(fā)性肝癌（PrimaryLiverCancer，PLC）是指起源于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。肝細(xì)胞癌（HepatocellularCarcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌中最常見的類型，約占原發(fā)性肝癌病例的75%-85%，其主要起源于肝細(xì)胞；肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌（IntrahepaticCholangiocarcinoma，ICC）則起源于肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，約占原發(fā)性肝癌的10%-15%；混合型肝癌（CombinedHepatocellularCholangiocarcinoma，cHCC-CC）兼具肝細(xì)胞癌和肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的特征，較為罕見，占比約1%-5%。不同類型的原發(fā)性肝癌在發(fā)病機(jī)制、生物學(xué)行為、治療方法及預(yù)后等方面存在顯著差異。原發(fā)性肝癌的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)均處于較高水平。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，肝癌新發(fā)病例數(shù)約90.6萬，死亡病例數(shù)約83萬，分別位居全球惡性腫瘤發(fā)病和死亡的第6位和第3位。在我國，由于乙肝病毒感染率較高、人口老齡化以及不良生活方式等因素的影響，原發(fā)性肝癌的發(fā)病率和死亡率更為突出。中國是乙肝大國，大量的乙肝病毒攜帶者在長期的病程中，容易發(fā)展為肝硬化，進(jìn)而引發(fā)肝癌。原發(fā)性肝癌已成為我國第四位常見惡性腫瘤及第三位腫瘤致死病因，嚴(yán)重影響我國人民的生命健康和生活質(zhì)量。肝癌的發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過了最佳的手術(shù)治療時(shí)機(jī)，這也是導(dǎo)致肝癌死亡率居高不下的重要原因之一。原發(fā)性肝癌給患者、家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。從患者角度來看，肝癌的治療過程漫長且痛苦，不僅需要承受手術(shù)、化療、放療等治療手段帶來的身體不適，還面臨著高昂的醫(yī)療費(fèi)用和疾病復(fù)發(fā)的心理壓力。許多患者在患病后，生活質(zhì)量急劇下降，工作和社交活動(dòng)受到極大限制。從家庭角度，肝癌患者的治療費(fèi)用往往給家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，同時(shí)家人還需要投入大量的時(shí)間和精力照顧患者，對(duì)家庭的正常生活秩序造成嚴(yán)重影響。從社會(huì)層面，肝癌的高發(fā)病率和死亡率導(dǎo)致大量勞動(dòng)力喪失，增加了社會(huì)醫(yī)療保障體系的壓力，也對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展產(chǎn)生一定的負(fù)面影響。當(dāng)前，原發(fā)性肝癌的主要治療手段包括手術(shù)治療、介入治療、化療、放療、靶向治療和免疫治療等。手術(shù)治療是早期肝癌的首選治療方法，包括肝切除術(shù)和肝移植術(shù)。肝切除術(shù)通過切除腫瘤組織，達(dá)到根治的目的，但對(duì)于腫瘤位置特殊、肝功能較差或腫瘤較大的患者，手術(shù)難度較大，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。肝移植術(shù)則適用于肝功能嚴(yán)重受損且符合移植條件的患者，能夠徹底清除腫瘤組織和病變肝臟，但由于供體短缺、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高以及術(shù)后免疫排斥反應(yīng)等問題，限制了其廣泛應(yīng)用。介入治療主要包括肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)（TACE）和射頻消融術(shù)（RFA）等。TACE通過將化療藥物和栓塞劑注入肝動(dòng)脈，阻斷腫瘤的血供，使腫瘤細(xì)胞缺血壞死，同時(shí)發(fā)揮化療作用，是中晚期肝癌的重要治療手段之一。然而，TACE治療后容易出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，且對(duì)肝功能有一定的損害。RFA則利用射頻電流產(chǎn)生的熱量使腫瘤組織凝固性壞死，適用于直徑較小的肝癌，但對(duì)于靠近大血管或重要臟器的腫瘤，治療效果可能受到限制。化療和放療在肝癌治療中也有一定的應(yīng)用，但由于肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性較低，且化療和放療的副作用較大，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，限制了其在臨床中的廣泛應(yīng)用。靶向治療和免疫治療是近年來肝癌治療領(lǐng)域的重要進(jìn)展，通過針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特定靶點(diǎn)或激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來攻擊腫瘤細(xì)胞，具有較好的療效和安全性。然而，部分患者對(duì)靶向治療和免疫治療可能存在耐藥性，且治療費(fèi)用較高，也給患者帶來了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。這些傳統(tǒng)治療手段在原發(fā)性肝癌的治療中都存在一定的局限性，難以滿足所有患者的治療需求，因此，探索新的治療方法和策略具有重要的臨床意義。1.3腫瘤異質(zhì)性與原發(fā)性肝癌腫瘤異質(zhì)性是指腫瘤細(xì)胞在生長過程中，由于基因突變、細(xì)胞間相互作用、微環(huán)境影響等多種因素，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞在基因、表型、代謝等方面呈現(xiàn)出顯著差異的特性。這種異質(zhì)性不僅存在于不同患者的腫瘤之間（瘤間異質(zhì)性），也存在于同一腫瘤內(nèi)部的不同區(qū)域（瘤內(nèi)異質(zhì)性）。腫瘤異質(zhì)性使得腫瘤細(xì)胞在生物學(xué)行為上表現(xiàn)出多樣性，包括增殖能力、侵襲能力、轉(zhuǎn)移能力以及對(duì)治療的反應(yīng)等方面的差異。例如，某些腫瘤細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的增殖能力，導(dǎo)致腫瘤快速生長；而另一些腫瘤細(xì)胞則可能具有更高的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，容易擴(kuò)散到其他組織和器官，增加患者的治療難度和預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)。腫瘤異質(zhì)性還會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)治療藥物的敏感性不同，部分腫瘤細(xì)胞可能對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性，使得治療效果不佳，腫瘤復(fù)發(fā)率升高。在原發(fā)性肝癌中，腫瘤異質(zhì)性表現(xiàn)得尤為復(fù)雜和顯著。從基因?qū)用鎭砜?，原發(fā)性肝癌存在大量的基因突變和染色體異常，這些遺傳變異在不同患者以及同一患者腫瘤的不同部位存在差異。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞中常見的基因突變包括TP53、CTNNB1、AXIN1等，這些基因突變在不同患者中的發(fā)生率和突變類型各不相同。同一腫瘤內(nèi)部也可能存在多個(gè)具有不同基因突變特征的腫瘤細(xì)胞亞群，它們之間相互競爭、相互協(xié)作，共同影響腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。從表型層面分析，原發(fā)性肝癌細(xì)胞在形態(tài)、大小、分化程度等方面存在明顯差異。一些肝癌細(xì)胞可能表現(xiàn)為高分化狀態(tài)，形態(tài)與正常肝細(xì)胞相似，生長相對(duì)緩慢；而另一些肝癌細(xì)胞則可能呈現(xiàn)低分化狀態(tài)，形態(tài)不規(guī)則，生長迅速，侵襲性強(qiáng)。原發(fā)性肝癌的腫瘤微環(huán)境也具有高度異質(zhì)性，腫瘤微環(huán)境中包含免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞成分，以及細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子、趨化因子等多種生物活性物質(zhì)。這些成分在腫瘤組織中的分布和功能狀態(tài)存在差異，與腫瘤細(xì)胞之間形成復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，影響腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中可表現(xiàn)為不同的極化狀態(tài)，M1型巨噬細(xì)胞具有抗腫瘤活性，能夠殺傷腫瘤細(xì)胞；而M2型巨噬細(xì)胞則具有促腫瘤作用，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和血管生成。原發(fā)性肝癌的空間異質(zhì)性是其腫瘤異質(zhì)性的重要表現(xiàn)形式之一，指腫瘤細(xì)胞在肝臟組織空間分布上的差異以及由此導(dǎo)致的生物學(xué)特性的不同。在肝臟腫瘤組織中，腫瘤細(xì)胞并非均勻分布，而是形成多個(gè)具有不同特征的腫瘤細(xì)胞亞群，它們在空間上相互分隔或交織存在。腫瘤的邊緣區(qū)域和中心區(qū)域的腫瘤細(xì)胞往往具有不同的生物學(xué)行為。腫瘤邊緣區(qū)域的細(xì)胞通常具有更高的增殖活性和侵襲能力，更容易與周圍正常組織發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移；而腫瘤中心區(qū)域的細(xì)胞可能由于缺氧、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等因素，生長相對(duì)緩慢，且更容易發(fā)生壞死。腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等在空間分布上也存在異質(zhì)性，這會(huì)影響腫瘤細(xì)胞與周圍細(xì)胞之間的相互作用以及腫瘤的免疫逃逸機(jī)制。在腫瘤的某些區(qū)域，免疫細(xì)胞可能能夠有效地識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞，形成免疫監(jiān)視狀態(tài)；而在另一些區(qū)域，腫瘤細(xì)胞可能通過分泌免疫抑制因子等方式，抑制免疫細(xì)胞的功能，實(shí)現(xiàn)免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。原發(fā)性肝癌的空間異質(zhì)性對(duì)治療產(chǎn)生了多方面的深遠(yuǎn)影響。在診斷方面，傳統(tǒng)的病理活檢通常只能獲取腫瘤組織的一小部分樣本，難以全面反映腫瘤的空間異質(zhì)性。這可能導(dǎo)致對(duì)腫瘤類型、分級(jí)和分期的判斷不準(zhǔn)確，從而影響后續(xù)治療方案的制定。例如，若活檢部位恰好取到了腫瘤中分化較好、惡性程度較低的區(qū)域，可能會(huì)低估腫瘤的真實(shí)惡性程度，使患者錯(cuò)過更積極有效的治療時(shí)機(jī)。在治療方面，由于腫瘤細(xì)胞的空間異質(zhì)性，不同區(qū)域的腫瘤細(xì)胞對(duì)治療藥物的敏感性不同。一些腫瘤細(xì)胞可能對(duì)化療藥物、靶向藥物或免疫治療藥物敏感，而另一些則可能耐藥。這就導(dǎo)致在治療過程中，即使使用了有效的治療藥物，也可能無法完全清除所有腫瘤細(xì)胞，殘留的耐藥細(xì)胞可能會(huì)成為腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源?？臻g異質(zhì)性還會(huì)影響放療的效果，因?yàn)榉暖焺┝康姆植夹枰鶕?jù)腫瘤的具體位置和范圍進(jìn)行精確規(guī)劃，而腫瘤的空間異質(zhì)性使得準(zhǔn)確確定放療靶區(qū)變得更加困難，可能導(dǎo)致部分腫瘤細(xì)胞接受的放療劑量不足，影響治療效果。在治療策略的選擇上，了解原發(fā)性肝癌的空間異質(zhì)性有助于制定更加精準(zhǔn)的個(gè)性化治療方案。對(duì)于空間異質(zhì)性較高的腫瘤，可能需要采用聯(lián)合治療的方式，結(jié)合多種治療手段，如手術(shù)、化療、靶向治療、免疫治療等，以針對(duì)不同區(qū)域的腫瘤細(xì)胞，提高治療效果。還可以通過空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)，深入研究腫瘤細(xì)胞在空間上的基因表達(dá)特征和分子機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物，為開發(fā)更有效的治療藥物和治療方法提供依據(jù)。1.4空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)及其應(yīng)用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)是一項(xiàng)新興的生物學(xué)技術(shù)，它打破了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的局限，將基因表達(dá)研究與組織的空間位置信息相結(jié)合，為深入理解生物過程提供了全新的視角。該技術(shù)的原理基于原位捕獲和測序技術(shù)，能夠在完整的組織切片上對(duì)RNA分子進(jìn)行定位和測序，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的空間分布進(jìn)行分析。其基本流程包括組織切片制備、RNA捕獲與逆轉(zhuǎn)錄、文庫構(gòu)建以及測序分析等步驟。在組織切片制備階段，需要將新鮮的組織樣本切成薄片，并固定在特殊的載玻片上，以保持組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性。隨后，利用帶有空間位置信息的寡核苷酸探針與組織切片中的RNA分子進(jìn)行雜交，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)RNA的原位捕獲。捕獲后的RNA分子在原位進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，形成cDNA，并進(jìn)一步構(gòu)建成測序文庫。通過高通量測序技術(shù)對(duì)文庫進(jìn)行測序，獲得大量的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，再利用生物信息學(xué)分析方法對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，最終得到基因在組織中的空間表達(dá)圖譜?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了多個(gè)階段。早期的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)主要依賴于熒光原位雜交（FISH）等方法，這些方法能夠在組織切片上對(duì)少數(shù)特定基因的表達(dá)進(jìn)行定位，但通量較低，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)全基因組的分析。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，基于微陣列技術(shù)的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法逐漸興起，它能夠在一張芯片上同時(shí)檢測多個(gè)基因的表達(dá)，但空間分辨率相對(duì)較低。近年來，基于測序技術(shù)的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)取得了重大突破，如10xGenomics公司的Visium空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)、華大基因的Stereo-seq技術(shù)等，這些技術(shù)不僅具有較高的通量，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)全基因組的分析，而且在空間分辨率上也有了顯著提高，能夠達(dá)到亞細(xì)胞水平的分辨率。這些技術(shù)的出現(xiàn)，使得空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究得到了迅速發(fā)展，為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究提供了強(qiáng)大的工具。在腫瘤研究領(lǐng)域，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。它可以幫助研究人員深入了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，揭示腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間的相互作用關(guān)系。通過對(duì)腫瘤組織進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組分析，可以發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在空間上的異質(zhì)性分布，以及不同區(qū)域腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)特征和生物學(xué)行為差異。這有助于識(shí)別腫瘤的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)基因和信號(hào)通路，為腫瘤的精準(zhǔn)治療提供新的靶點(diǎn)和策略。在乳腺癌研究中，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)揭示了腫瘤邊緣區(qū)域和中心區(qū)域的腫瘤細(xì)胞在基因表達(dá)和代謝途徑上的顯著差異，發(fā)現(xiàn)腫瘤邊緣區(qū)域的細(xì)胞具有更高的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，并且與腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞存在更密切的相互作用。這為乳腺癌的治療提供了新的思路，提示針對(duì)腫瘤邊緣區(qū)域的細(xì)胞和相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行干預(yù)可能是一種有效的治療策略?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在腫瘤診斷和預(yù)后評(píng)估方面也具有重要價(jià)值。它可以通過分析腫瘤組織的空間轉(zhuǎn)錄組特征，為腫瘤的診斷和分型提供更準(zhǔn)確的依據(jù)。傳統(tǒng)的腫瘤診斷主要依賴于病理形態(tài)學(xué)觀察和免疫組化等方法，這些方法存在一定的局限性，難以準(zhǔn)確反映腫瘤的分子特征和異質(zhì)性。而空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)能夠從基因表達(dá)層面揭示腫瘤的本質(zhì)特征，為腫瘤的精準(zhǔn)診斷提供有力支持?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)還可以通過構(gòu)建基因表達(dá)特征模型，對(duì)腫瘤患者的預(yù)后進(jìn)行預(yù)測，幫助醫(yī)生制定更合理的治療方案。在肺癌研究中，利用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)分析腫瘤組織的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了一組與肺癌患者預(yù)后密切相關(guān)的基因特征，基于這些特征構(gòu)建的預(yù)后預(yù)測模型具有較高的準(zhǔn)確性，能夠有效地預(yù)測肺癌患者的生存情況。與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)相比，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢。傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)通常是對(duì)整個(gè)組織樣本進(jìn)行勻漿處理后進(jìn)行分析，這樣會(huì)丟失基因表達(dá)的空間位置信息，無法反映組織內(nèi)不同細(xì)胞類型之間的空間關(guān)系和相互作用。而空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)能夠保留組織的空間結(jié)構(gòu)，直觀地展示基因在組織中的表達(dá)位置和分布情況，為研究組織的功能和疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了更全面、更準(zhǔn)確的信息?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)還可以對(duì)稀有細(xì)胞群體進(jìn)行研究，因?yàn)樗軌蛟诮M織切片上直接定位和分析這些細(xì)胞的基因表達(dá)，而傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)由于對(duì)樣本進(jìn)行勻漿處理，可能會(huì)導(dǎo)致稀有細(xì)胞群體的信號(hào)被掩蓋。在腫瘤研究中，腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等稀有細(xì)胞群體對(duì)腫瘤的發(fā)展和治療反應(yīng)具有重要影響，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)能夠幫助我們更好地了解這些細(xì)胞的功能和作用機(jī)制。二、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)原理與方法2.1技術(shù)原理空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)旨在實(shí)現(xiàn)在組織切片上同時(shí)獲取基因表達(dá)信息和空間位置信息，從而深入解析生物樣本中細(xì)胞間的相互關(guān)系以及基因表達(dá)的空間特異性。其核心原理是通過特定的技術(shù)手段，將組織切片中的RNA分子與帶有空間位置信息的標(biāo)簽進(jìn)行關(guān)聯(lián)，進(jìn)而在測序后能夠?qū)⒒虮磉_(dá)數(shù)據(jù)映射回組織切片的原始位置。在空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)中，基于空間條形碼（spatialbarcode）的方法應(yīng)用較為廣泛，以10xGenomics的Visium空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)為例，該技術(shù)使用的載玻片上有特定的捕獲區(qū)域，每個(gè)捕獲區(qū)域包含數(shù)千個(gè)被條形碼標(biāo)記的點(diǎn)（barcodedspots）。當(dāng)組織切片放置在載玻片上進(jìn)行透化處理后，細(xì)胞內(nèi)的mRNA會(huì)釋放出來，并與捕獲區(qū)域中的帶有空間條形碼、唯一分子標(biāo)識(shí)符（UMI）和poly（dT）的寡核苷酸探針結(jié)合。這些寡核苷酸探針能夠特異性地捕獲mRNA的poly(A)尾，隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將mRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。在這個(gè)過程中，每個(gè)cDNA分子都帶上了對(duì)應(yīng)的空間條形碼信息，該信息標(biāo)記了其在組織切片中的原始位置。之后對(duì)這些cDNA進(jìn)行文庫構(gòu)建和高通量測序，得到大量的基因表達(dá)序列數(shù)據(jù)。通過對(duì)測序數(shù)據(jù)中空間條形碼的識(shí)別和分析，就可以將每個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)映射回組織切片上的相應(yīng)位置，從而繪制出基因表達(dá)的空間圖譜。另一種典型技術(shù)是華大基因的Stereo-seq技術(shù)，它基于DNA納米球（DNB）陣列實(shí)現(xiàn)空間轉(zhuǎn)錄組分析。在該技術(shù)中，將組織切片與含有空間條形碼的DNB陣列進(jìn)行雜交，組織中的mRNA與DNB上的探針結(jié)合。通過一系列的原位擴(kuò)增、連接等反應(yīng)，形成帶有空間位置信息的cDNA文庫。Stereo-seq技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)超高分辨率的空間轉(zhuǎn)錄組分析，其DNB陣列的高密度排列使得空間分辨率可達(dá)到亞細(xì)胞水平，能夠更精確地揭示基因表達(dá)在空間上的細(xì)微差異?；谠浑s交（insituhybridization）的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)也是重要的技術(shù)路線之一。該技術(shù)利用標(biāo)記有熒光染料或放射性同位素的DNA或RNA探針，與組織切片中的目標(biāo)mRNA進(jìn)行雜交。首先對(duì)樣本進(jìn)行固定和切片處理，以保持細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性。然后將標(biāo)記好的探針與切片中的mRNA進(jìn)行雜交反應(yīng)，探針會(huì)與互補(bǔ)的mRNA序列結(jié)合。通過檢測熒光信號(hào)或放射性信號(hào)的位置和強(qiáng)度，就可以確定目標(biāo)基因在組織中的表達(dá)位置和表達(dá)水平。如單分子熒光原位雜交（smFISH）技術(shù)，能夠在單細(xì)胞分辨率下對(duì)特定基因的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行精確定位和計(jì)數(shù)。它通過設(shè)計(jì)針對(duì)目標(biāo)基因的多個(gè)熒光標(biāo)記探針，每個(gè)探針與目標(biāo)mRNA的不同區(qū)域結(jié)合，從而增強(qiáng)熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)mRNA分子的檢測。這種技術(shù)可以同時(shí)檢測多個(gè)基因的表達(dá)，并且能夠直觀地展示基因在細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位情況?；谠粶y序（insitusequencing）的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)則是在細(xì)胞或組織原位直接對(duì)RNA分子進(jìn)行測序。其基本原理是將RNA分子固定在組織切片上，通過一系列的化學(xué)反應(yīng)將RNA分子轉(zhuǎn)化為cDNA，并在原位進(jìn)行測序反應(yīng)。例如STARmap技術(shù)，它通過設(shè)計(jì)特殊的引物和測序策略，在組織切片上實(shí)現(xiàn)對(duì)RNA分子的直接測序。該技術(shù)能夠在細(xì)胞水平上獲得高分辨率的轉(zhuǎn)錄組信息，同時(shí)保留了組織的空間結(jié)構(gòu)，可用于研究細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化以及細(xì)胞間的通訊機(jī)制。不同的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在空間分辨率、檢測通量、檢測靈敏度等方面存在差異?；诳臻g條形碼的技術(shù)通常具有較高的通量，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)全轉(zhuǎn)錄組的分析，但空間分辨率相對(duì)較低，一般在幾十微米級(jí)別?；谠浑s交的技術(shù)具有較高的空間分辨率，能夠達(dá)到單細(xì)胞甚至亞細(xì)胞水平的分辨率，但檢測通量有限，通常只能檢測少數(shù)特定基因?；谠粶y序的技術(shù)則在空間分辨率和檢測通量之間取得了一定的平衡，能夠在細(xì)胞水平上對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行測序分析，但技術(shù)復(fù)雜度較高，成本也相對(duì)較高。在實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)研究目的和樣本特點(diǎn)選擇合適的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)。2.2主要技術(shù)平臺(tái)及特點(diǎn)目前，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，涌現(xiàn)出了多種技術(shù)平臺(tái)，這些平臺(tái)在原理、分辨率、通量、成本等方面各具特點(diǎn)，適用于不同的研究需求。以下將對(duì)幾種主流的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行詳細(xì)介紹和對(duì)比分析。10xGenomicsVisium是目前應(yīng)用較為廣泛的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)平臺(tái)之一。該平臺(tái)基于空間條形碼技術(shù)，其載玻片上有特定的捕獲區(qū)域，每個(gè)捕獲區(qū)域包含數(shù)千個(gè)被條形碼標(biāo)記的點(diǎn)（barcodedspots）。每個(gè)spot直徑為55μm，spot與spot中心之間的距離為100μm，每個(gè)spot含有獨(dú)一無二的空間位置條形碼來標(biāo)記空間位置信息，且連接著UMI和poly（dT）來捕獲靶區(qū)域內(nèi)的RNA。Visium的主要優(yōu)勢在于其通量較高，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)全轉(zhuǎn)錄組的分析，一次實(shí)驗(yàn)可以檢測組織切片上數(shù)千個(gè)基因的表達(dá)情況。它的實(shí)驗(yàn)流程相對(duì)簡單，兼容新鮮冷凍組織和福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織樣本，這使得研究人員可以利用已有的臨床樣本進(jìn)行研究，擴(kuò)大了樣本來源。該平臺(tái)還配套了完善的數(shù)據(jù)分析軟件，如SpaceRanger和LoupeBrowser，方便研究人員進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和可視化分析。Visium的空間分辨率相對(duì)較低，每個(gè)spot可能包含多個(gè)細(xì)胞，無法達(dá)到單細(xì)胞分辨率，這在一定程度上限制了對(duì)細(xì)胞異質(zhì)性的研究。其測序成本也相對(duì)較高，對(duì)于大規(guī)模的研究可能會(huì)產(chǎn)生較高的費(fèi)用。華大基因的Stereo-seq技術(shù)是基于DNA納米球（DNB）陣列實(shí)現(xiàn)空間轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù)平臺(tái)。該技術(shù)將組織切片與含有空間條形碼的DNB陣列進(jìn)行雜交，組織中的mRNA與DNB上的探針結(jié)合，通過一系列的原位擴(kuò)增、連接等反應(yīng)，形成帶有空間位置信息的cDNA文庫。Stereo-seq技術(shù)的突出特點(diǎn)是具有超高分辨率，其DNB陣列的高密度排列使得空間分辨率可達(dá)到亞細(xì)胞水平，能夠精確地揭示基因表達(dá)在空間上的細(xì)微差異。這使得研究人員可以在單細(xì)胞甚至亞細(xì)胞層面研究基因表達(dá)的空間分布，對(duì)于深入理解細(xì)胞間的相互作用和組織發(fā)育機(jī)制具有重要意義。Stereo-seq還能夠進(jìn)行無偏的轉(zhuǎn)錄組探索，檢測廣泛的轉(zhuǎn)錄本，包括非編碼RNA、細(xì)菌RNA和病毒RNA等。該技術(shù)也存在一些局限性，例如其技術(shù)復(fù)雜度較高，實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求較高。由于需要較高的測序深度才能達(dá)到較好的覆蓋范圍，導(dǎo)致其測序成本相對(duì)較高。NanoStringGeoMx?DSP是NanoString公司推出的空間組學(xué)平臺(tái)。與其他平臺(tái)不同的是，它可以使用ROI（RegionofInterest）圈選指定區(qū)域，并可檢測區(qū)域內(nèi)的RNA和蛋白。該平臺(tái)針對(duì)RNA有全轉(zhuǎn)錄組研究產(chǎn)品（WTA）和專門針對(duì)腫瘤的產(chǎn)品（CTA）；針對(duì)蛋白有很多的panel可以組合，包含腫瘤免疫方向和神經(jīng)方向。GeoMx?DSP的優(yōu)勢在于其具有較強(qiáng)的針對(duì)性，可以對(duì)感興趣的特定區(qū)域進(jìn)行深入分析，減少不必要的檢測，提高檢測效率。它能夠同時(shí)檢測RNA和蛋白，實(shí)現(xiàn)多組學(xué)數(shù)據(jù)的整合分析，為研究細(xì)胞的功能和調(diào)控機(jī)制提供更全面的信息。該平臺(tái)的樣本兼容性較好，可以處理新鮮冷凍組織、FFPE組織以及各種臨床樣本。然而，GeoMx?DSP的通量相對(duì)較低，無法實(shí)現(xiàn)對(duì)全組織的高通量分析。其檢測的基因和蛋白數(shù)量也受到panel的限制，靈活性相對(duì)較差。NanoStringCosMx?SMI是NanoString公司的單細(xì)胞空間原位分子成像平臺(tái)。該平臺(tái)結(jié)合了超高分辨率成像技術(shù)和多靶標(biāo)檢測能力，能夠?qū)M織切片中1000種RNA和64種蛋白質(zhì)分子（2024年上半年可提升至6000個(gè)基因和120種蛋白）進(jìn)行單細(xì)胞和亞細(xì)胞分辨率的原位成像。CosMx?SMI的最大特點(diǎn)是能夠在單細(xì)胞和亞細(xì)胞分辨率下對(duì)多種分子進(jìn)行原位成像，提供高分辨率的空間轉(zhuǎn)錄組信息。這使得研究人員可以直觀地觀察基因和蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布和表達(dá)情況，深入研究細(xì)胞間的相互作用和細(xì)胞功能。該平臺(tái)還支持細(xì)胞配受體檢測，在真實(shí)的組織空間背景下推進(jìn)對(duì)細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞通訊和細(xì)胞狀態(tài)的深刻洞察。不過，CosMx?SMI的檢測通量相對(duì)較低，檢測的基因和蛋白數(shù)量有限，難以滿足對(duì)全轉(zhuǎn)錄組和全蛋白質(zhì)組的大規(guī)模分析需求。其設(shè)備成本和實(shí)驗(yàn)成本較高，也限制了其廣泛應(yīng)用。10xGenomicsXenium是一款具備高分辨率的空間轉(zhuǎn)錄組分析平臺(tái)。它利用原位測序技術(shù)，能夠在細(xì)胞水平上對(duì)RNA分子進(jìn)行直接測序。Xenium的優(yōu)勢在于其空間分辨率高，可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分辨率的空間轉(zhuǎn)錄組分析，能夠準(zhǔn)確地確定基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)位置和表達(dá)水平。該平臺(tái)可以檢測大量的基因，提供全面的轉(zhuǎn)錄組信息。它還能夠?qū)ο∮屑?xì)胞群體進(jìn)行研究，因?yàn)槠涓叻直媛士梢郧逦刈R(shí)別和分析這些細(xì)胞的基因表達(dá)。Xenium的技術(shù)復(fù)雜度較高，實(shí)驗(yàn)操作難度大，需要專業(yè)的技術(shù)人員和設(shè)備。其成本也相對(duì)較高，包括設(shè)備成本、試劑成本和數(shù)據(jù)分析成本等。不同空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)平臺(tái)的特點(diǎn)總結(jié)如表1所示：技術(shù)平臺(tái)原理分辨率通量樣本兼容性成本優(yōu)勢局限性10xGenomicsVisium空間條形碼技術(shù)55μm高通量，全轉(zhuǎn)錄組分析新鮮冷凍組織、FFPE組織較高通量高，實(shí)驗(yàn)流程簡單，數(shù)據(jù)分析軟件完善空間分辨率低，測序成本高華大基因Stereo-seqDNA納米球陣列亞細(xì)胞水平較高，可檢測多種轉(zhuǎn)錄本新鮮冷凍組織高超高分辨率，無偏轉(zhuǎn)錄組探索技術(shù)復(fù)雜度高，測序成本高，實(shí)驗(yàn)操作繁瑣NanoStringGeoMx?DSPROI圈選，檢測RNA和蛋白-針對(duì)性檢測，通量相對(duì)較低新鮮冷凍組織、FFPE組織、臨床樣本較高可圈選特定區(qū)域，同時(shí)檢測RNA和蛋白，樣本兼容性好通量低，檢測基因和蛋白數(shù)量受panel限制，靈活性差NanoStringCosMx?SMI超高分辨率成像和多靶標(biāo)檢測單細(xì)胞和亞細(xì)胞分辨率低，檢測分子數(shù)量有限新鮮冷凍組織、FFPE組織高單細(xì)胞和亞細(xì)胞分辨率原位成像，支持細(xì)胞配受體檢測檢測通量低，檢測分子數(shù)量有限，成本高10xGenomicsXenium原位測序技術(shù)單細(xì)胞分辨率較高，可檢測大量基因新鮮冷凍組織高高分辨率，可檢測大量基因，能研究稀有細(xì)胞群體技術(shù)復(fù)雜度高，實(shí)驗(yàn)操作難度大，成本高在實(shí)際應(yīng)用中，研究人員需要根據(jù)具體的研究目的、樣本類型、預(yù)算等因素綜合考慮，選擇最適合的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)平臺(tái)。例如，對(duì)于需要研究腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞間相互作用的研究，可能需要選擇具有較高分辨率的平臺(tái)，如Stereo-seq、CosMx?SMI或Xenium，以便能夠準(zhǔn)確地分析不同細(xì)胞類型之間的空間關(guān)系。而對(duì)于大規(guī)模的腫瘤樣本篩查和全轉(zhuǎn)錄組分析，10xGenomicsVisium可能是更合適的選擇，因?yàn)槠渫枯^高，能夠快速獲得大量的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。NanoStringGeoMx?DSP則適用于對(duì)特定區(qū)域和特定分子進(jìn)行深入研究的情況。2.3實(shí)驗(yàn)流程與數(shù)據(jù)分析方法在基于空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究原發(fā)性肝癌空間異質(zhì)性的實(shí)驗(yàn)中，規(guī)范且嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)流程與科學(xué)合理的數(shù)據(jù)分析方法是獲取準(zhǔn)確結(jié)果的關(guān)鍵。下面將詳細(xì)闡述從樣本采集到數(shù)據(jù)分析的整個(gè)過程。樣本采集是實(shí)驗(yàn)的首要環(huán)節(jié)，其質(zhì)量直接影響后續(xù)研究結(jié)果的可靠性。本研究選取經(jīng)臨床病理確診為原發(fā)性肝癌的患者作為樣本來源，在患者手術(shù)切除腫瘤組織時(shí)，嚴(yán)格按照無菌操作原則，迅速采集新鮮的肝癌組織樣本。為確保樣本的代表性，同時(shí)采集腫瘤核心區(qū)域、腫瘤邊緣區(qū)域以及距離腫瘤邊緣2cm以上的癌旁正常組織樣本。在采集過程中，盡量避免樣本受到外界因素的污染和損傷，采集后的樣本立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，以防止RNA降解。對(duì)于每一個(gè)樣本，詳細(xì)記錄患者的基本信息，如年齡、性別、病理類型、腫瘤分期等，這些信息對(duì)于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解釋具有重要意義。切片制備是實(shí)現(xiàn)空間轉(zhuǎn)錄組分析的重要步驟，需要精細(xì)的操作以保持組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性。將冷凍保存的組織樣本取出，在低溫條件下進(jìn)行切片，切片厚度一般控制在10-20μm之間。使用冷凍切片機(jī)將組織切成薄片后，將切片放置在預(yù)先準(zhǔn)備好的空間轉(zhuǎn)錄組專用載玻片上。對(duì)于10xGenomicsVisium技術(shù)平臺(tái)，載玻片上有特定的捕獲區(qū)域，切片需準(zhǔn)確覆蓋在捕獲區(qū)域上，確保組織中的mRNA能夠與載玻片上的捕獲探針充分接觸。在切片過程中，要注意保持切片的平整度和連續(xù)性，避免出現(xiàn)褶皺或斷裂等情況，影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。切片完成后，對(duì)組織切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（H&E）染色，通過顯微鏡觀察染色后的切片，對(duì)組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步評(píng)估，確保切片質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。測序環(huán)節(jié)是獲取基因表達(dá)數(shù)據(jù)的核心步驟，借助高通量測序技術(shù)能夠快速、準(zhǔn)確地測定組織切片中的mRNA序列。將制備好的帶有組織切片的載玻片按照相應(yīng)技術(shù)平臺(tái)的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行透化處理，使組織中的mRNA釋放出來，并與載玻片上的捕獲探針結(jié)合。以10xGenomicsVisium技術(shù)為例，捕獲探針上帶有空間條形碼、唯一分子標(biāo)識(shí)符（UMI）和poly（dT），能夠特異性地捕獲mRNA的poly(A)尾。在捕獲mRNA后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將mRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)一步構(gòu)建成測序文庫。構(gòu)建好的文庫經(jīng)過質(zhì)量檢測合格后，使用Illumina測序平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。在測序過程中，設(shè)置合適的測序參數(shù)，如測序深度、讀長等，以確保能夠獲得足夠的高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)。對(duì)于原發(fā)性肝癌的研究，通常需要較高的測序深度，以保證能夠檢測到低表達(dá)基因和稀有轉(zhuǎn)錄本，從而全面地反映腫瘤組織的基因表達(dá)情況。數(shù)據(jù)分析是從海量測序數(shù)據(jù)中提取有價(jià)值信息的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過一系列的生物信息學(xué)方法和工具，能夠揭示原發(fā)性肝癌的空間異質(zhì)性特征和潛在的生物學(xué)機(jī)制。測序數(shù)據(jù)下機(jī)后，首先進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，使用Fastp等工具對(duì)原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，去除低質(zhì)量的reads、接頭序列以及含有過多N堿基的序列。對(duì)于基于空間條形碼的技術(shù)，還需要使用專門的軟件如SpaceRanger（針對(duì)10xGenomicsVisium數(shù)據(jù)）將測序數(shù)據(jù)中的空間條形碼信息與基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，確定每個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)在組織切片上的空間位置。經(jīng)過質(zhì)量控制和空間定位后的數(shù)據(jù)，使用Seurat等R包進(jìn)行進(jìn)一步的分析。通過降維、聚類分析，將具有相似基因表達(dá)模式的spot聚成不同的細(xì)胞簇，從而區(qū)分不同特征的細(xì)胞群體。在聚類分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)行差異表達(dá)分析，使用FindMarkers等函數(shù)找出不同細(xì)胞簇之間差異表達(dá)的基因，這些差異表達(dá)基因可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、空間異質(zhì)性等密切相關(guān)。還可以進(jìn)行空間可變基因分析，使用SpatialDE等方法識(shí)別在空間上具有顯著表達(dá)差異的基因，這些基因?qū)τ诮沂灸[瘤組織在空間上的異質(zhì)性分布具有重要意義。為了深入了解腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞間的相互作用，利用CellChat等工具進(jìn)行細(xì)胞通訊分析，預(yù)測細(xì)胞之間可能存在的信號(hào)傳導(dǎo)通路和相互作用關(guān)系。通過對(duì)這些分析結(jié)果的綜合解讀，能夠全面揭示原發(fā)性肝癌的空間異質(zhì)性特征，為進(jìn)一步探究其發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)提供有力的依據(jù)。三、原發(fā)性肝癌空間異質(zhì)性的研究現(xiàn)狀3.1原發(fā)性肝癌空間異質(zhì)性的表現(xiàn)原發(fā)性肝癌的空間異質(zhì)性表現(xiàn)復(fù)雜，涵蓋了腫瘤細(xì)胞自身特性以及腫瘤微環(huán)境等多個(gè)方面，這些異質(zhì)性特征對(duì)腫瘤的發(fā)展、治療反應(yīng)和患者預(yù)后產(chǎn)生著深遠(yuǎn)影響。在腫瘤細(xì)胞層面，原發(fā)性肝癌細(xì)胞在形態(tài)、基因表達(dá)和代謝等方面存在顯著的空間差異。從形態(tài)學(xué)角度來看，肝癌細(xì)胞的形態(tài)各異，在腫瘤的不同區(qū)域，細(xì)胞的大小、形狀和細(xì)胞核形態(tài)等均有所不同。在腫瘤邊緣區(qū)域，癌細(xì)胞可能呈現(xiàn)出更具侵襲性的形態(tài)，細(xì)胞邊界不規(guī)則，細(xì)胞核增大且染色質(zhì)濃集，這種形態(tài)變化有助于腫瘤細(xì)胞突破周圍組織的屏障，向周圍正常組織浸潤。而在腫瘤中心區(qū)域，由于營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)相對(duì)不足和代謝產(chǎn)物積累，部分癌細(xì)胞可能出現(xiàn)萎縮、變形等形態(tài)改變。基因表達(dá)的空間異質(zhì)性是原發(fā)性肝癌的重要特征之一。通過空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，不同空間位置的肝癌細(xì)胞存在大量差異表達(dá)基因。在腫瘤的某些區(qū)域，與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因如PCNA（增殖細(xì)胞核抗原）、Ki-67等表達(dá)水平較高，表明這些區(qū)域的腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖活性，可能導(dǎo)致腫瘤快速生長。而在其他區(qū)域，與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因如MMP2（基質(zhì)金屬蛋白酶2）、MMP9等表達(dá)上調(diào)，提示這些區(qū)域的腫瘤細(xì)胞具有更高的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能。一些與腫瘤耐藥相關(guān)的基因如ABCB1（ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白B1）、ABCC1（ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白C1）等在不同空間位置的表達(dá)也存在差異，這可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性不同，進(jìn)而影響治療效果。原發(fā)性肝癌細(xì)胞的代謝空間異質(zhì)性也十分明顯。腫瘤細(xì)胞為了滿足其快速增殖和生存的需求，會(huì)發(fā)生代謝重編程。在腫瘤的不同區(qū)域，代謝途徑的活性存在差異。腫瘤邊緣區(qū)域的細(xì)胞由于更接近正常組織的血管，能夠獲取更多的營養(yǎng)物質(zhì)，可能表現(xiàn)出更高的有氧糖酵解活性，即Warburg效應(yīng)。這些細(xì)胞即使在有氧條件下也優(yōu)先利用糖酵解途徑產(chǎn)生能量，并產(chǎn)生大量乳酸，這不僅為細(xì)胞提供了快速的能量供應(yīng)，還通過改變微環(huán)境的酸堿度，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。而在腫瘤中心區(qū)域，由于缺氧和營養(yǎng)物質(zhì)匱乏，細(xì)胞可能更多地依賴脂肪酸氧化等其他代謝途徑來維持能量需求。研究還發(fā)現(xiàn)，不同區(qū)域的腫瘤細(xì)胞在氨基酸代謝、核苷酸代謝等方面也存在差異，這些代謝差異進(jìn)一步影響了腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞組成和分布的異質(zhì)性也是原發(fā)性肝癌空間異質(zhì)性的重要體現(xiàn)。腫瘤微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，包含免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞成分。免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的分布具有明顯的空間異質(zhì)性。T細(xì)胞在腫瘤組織中的分布并不均勻，在腫瘤邊緣區(qū)域，T細(xì)胞的浸潤程度可能較高，這些T細(xì)胞具有較強(qiáng)的免疫活性，能夠識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。然而，在腫瘤中心區(qū)域，由于腫瘤細(xì)胞分泌的免疫抑制因子以及缺氧等微環(huán)境因素的影響，T細(xì)胞的功能可能受到抑制，表現(xiàn)為增殖能力下降、細(xì)胞毒性降低以及免疫檢查點(diǎn)分子表達(dá)上調(diào)等，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視。巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中也存在不同的極化狀態(tài)和空間分布。M1型巨噬細(xì)胞具有抗腫瘤活性，主要分布在腫瘤的周邊區(qū)域，能夠分泌細(xì)胞因子和趨化因子，激活免疫細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的殺傷。而M2型巨噬細(xì)胞則具有促腫瘤作用，多分布在腫瘤內(nèi)部，它們能夠促進(jìn)腫瘤血管生成、免疫抑制和腫瘤細(xì)胞的遷移?；|(zhì)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的分布也具有空間異質(zhì)性。成纖維細(xì)胞在腫瘤間質(zhì)中廣泛分布，它們通過分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分和生長因子，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長、遷移和侵襲起到支持作用。在腫瘤邊緣區(qū)域，成纖維細(xì)胞可能與腫瘤細(xì)胞緊密相互作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。而在腫瘤中心區(qū)域，成纖維細(xì)胞的分布和功能可能受到缺氧和代謝產(chǎn)物積累的影響，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的支持作用可能發(fā)生改變。內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成了腫瘤血管的內(nèi)壁，腫瘤血管的生成和分布具有明顯的空間異質(zhì)性。腫瘤邊緣區(qū)域的血管通常更為豐富，血管形態(tài)不規(guī)則，通透性較高，這有利于腫瘤細(xì)胞獲取營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，但也增加了腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。而在腫瘤中心區(qū)域，由于血管生成相對(duì)不足，可能存在缺氧和營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的情況，這會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的壞死和凋亡，但也可能促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生適應(yīng)性變化，如增強(qiáng)對(duì)缺氧環(huán)境的耐受性和代謝重編程。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，其成分和結(jié)構(gòu)在空間上也存在異質(zhì)性。ECM主要由膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等成分組成，它不僅為腫瘤細(xì)胞提供物理支撐，還參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和信號(hào)傳導(dǎo)。在腫瘤的不同區(qū)域，ECM的成分和交聯(lián)程度不同。在腫瘤邊緣區(qū)域，ECM可能更加疏松，有利于腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。而在腫瘤中心區(qū)域，ECM可能更加致密，形成物理屏障，限制腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散，但也可能影響藥物的滲透和免疫細(xì)胞的浸潤。ECM中的一些成分如基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的表達(dá)和活性在空間上也存在差異，它們通過調(diào)節(jié)ECM的降解和重塑，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。3.2傳統(tǒng)研究方法的局限性在原發(fā)性肝癌空間異質(zhì)性研究中，傳統(tǒng)研究方法雖然在一定程度上推動(dòng)了對(duì)肝癌的認(rèn)識(shí)，但隨著研究的深入，其局限性也日益凸顯。這些局限性主要體現(xiàn)在空間信息的丟失、對(duì)腫瘤微環(huán)境研究的片面性以及難以全面反映腫瘤異質(zhì)性等方面。傳統(tǒng)的病理活檢方法是肝癌診斷和研究的重要手段之一，但它存在明顯的局限性。在進(jìn)行病理活檢時(shí)，通常只能從腫瘤組織中獲取少量的樣本，這些樣本僅僅代表了腫瘤的一小部分，難以全面反映整個(gè)腫瘤的空間異質(zhì)性。由于腫瘤內(nèi)部不同區(qū)域的細(xì)胞具有不同的生物學(xué)特性，如增殖活性、分化程度、基因表達(dá)譜等，僅通過少量的活檢樣本可能會(huì)遺漏一些重要的信息，導(dǎo)致對(duì)腫瘤真實(shí)情況的判斷出現(xiàn)偏差。在對(duì)腫瘤邊緣區(qū)域進(jìn)行活檢時(shí)，可能由于采樣位置的局限性，無法準(zhǔn)確捕捉到腫瘤細(xì)胞與周圍正常組織相互作用的信息，從而影響對(duì)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制的理解。病理活檢主要依賴于形態(tài)學(xué)觀察和免疫組化等方法，這些方法雖然能夠提供一些關(guān)于腫瘤細(xì)胞形態(tài)和某些蛋白表達(dá)的信息，但無法直接獲取基因表達(dá)的空間位置信息，對(duì)于深入研究腫瘤細(xì)胞的分子機(jī)制和空間異質(zhì)性存在較大的限制。以傳統(tǒng)的腫瘤穿刺活檢為例，該方法通常從腫瘤的特定部位采集組織樣本，然而腫瘤組織在空間上存在顯著的異質(zhì)性，穿刺部位的選擇可能會(huì)導(dǎo)致獲取的樣本無法代表整個(gè)腫瘤的特征。有研究表明，在對(duì)同一腫瘤的不同區(qū)域進(jìn)行穿刺活檢時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同樣本之間的基因表達(dá)譜存在明顯差異。這種差異可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)腫瘤的診斷和治療方案的制定產(chǎn)生誤導(dǎo)，因?yàn)榛趩我淮┐虡颖镜姆治鼋Y(jié)果可能無法反映腫瘤的全貌。在一項(xiàng)針對(duì)肝癌患者的研究中，對(duì)同一腫瘤的中心區(qū)域和邊緣區(qū)域進(jìn)行穿刺活檢，結(jié)果顯示中心區(qū)域的腫瘤細(xì)胞在某些基因的表達(dá)上與邊緣區(qū)域存在顯著差異，這些差異與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。如果僅根據(jù)中心區(qū)域的活檢結(jié)果制定治療方案，可能會(huì)忽略邊緣區(qū)域腫瘤細(xì)胞的特性，從而影響治療效果。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，如基于組織勻漿的RNA測序，雖然能夠分析組織中基因表達(dá)的總體情況，但在研究腫瘤空間異質(zhì)性方面存在嚴(yán)重缺陷。在進(jìn)行組織勻漿時(shí)，會(huì)破壞組織的原有結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致所有細(xì)胞的RNA混合在一起，無法區(qū)分不同細(xì)胞類型以及不同空間位置的基因表達(dá)差異。這種方法無法提供基因表達(dá)的空間定位信息，使得研究人員難以了解腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞之間的相互作用以及基因表達(dá)在空間上的變化規(guī)律。在研究肝癌時(shí)，無法通過傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)確定腫瘤細(xì)胞與周圍免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等在空間上的分布關(guān)系，以及它們之間的基因表達(dá)差異和信號(hào)傳導(dǎo)通路。這限制了對(duì)腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制的深入研究，也難以發(fā)現(xiàn)針對(duì)腫瘤微環(huán)境的有效治療靶點(diǎn)。在腫瘤微環(huán)境研究方面，傳統(tǒng)研究方法同樣存在不足。腫瘤微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，包含多種細(xì)胞成分和生物活性物質(zhì)，它們之間相互作用，共同影響腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和治療反應(yīng)。傳統(tǒng)研究方法往往只能孤立地研究腫瘤微環(huán)境中的某一種或幾種成分，難以全面揭示腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性和異質(zhì)性。在研究腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞時(shí)，傳統(tǒng)方法可能只關(guān)注巨噬細(xì)胞的數(shù)量和表型，而忽略了它們在腫瘤微環(huán)境中的空間分布以及與其他細(xì)胞的相互作用。實(shí)際上，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在腫瘤的不同區(qū)域可能具有不同的功能，其空間分布與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和免疫逃逸密切相關(guān)。傳統(tǒng)方法還難以研究腫瘤微環(huán)境中各種成分之間的動(dòng)態(tài)變化和相互作用網(wǎng)絡(luò)，無法全面理解腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響機(jī)制。傳統(tǒng)研究方法在研究原發(fā)性肝癌空間異質(zhì)性時(shí)存在諸多局限性，這些局限性限制了對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的深入理解，也制約了肝癌治療手段的創(chuàng)新和優(yōu)化。因此，迫切需要新的技術(shù)和方法來突破這些局限，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)為解決這些問題提供了新的途徑。3.3空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在原發(fā)性肝癌研究中的優(yōu)勢空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在原發(fā)性肝癌研究中展現(xiàn)出多方面的顯著優(yōu)勢，為深入探究肝癌的發(fā)病機(jī)制、診斷和治療提供了獨(dú)特視角和有力工具。該技術(shù)能夠保留組織的空間信息，這是其最為突出的優(yōu)勢之一。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在處理組織樣本時(shí)，通常將整個(gè)組織勻漿，導(dǎo)致組織的空間結(jié)構(gòu)被破壞，丟失了基因表達(dá)的空間位置信息。而空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)則通過特殊的方法，如基于空間條形碼、原位雜交或原位測序等，在獲取基因表達(dá)信息的同時(shí)，精確地記錄基因在組織切片中的空間位置。在原發(fā)性肝癌研究中，這一優(yōu)勢尤為重要。通過空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，可以直觀地觀察到腫瘤細(xì)胞在肝臟組織中的分布情況，以及腫瘤細(xì)胞與周圍正常組織、腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等的空間關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤邊緣區(qū)域的腫瘤細(xì)胞與腫瘤中心區(qū)域的腫瘤細(xì)胞在基因表達(dá)上存在顯著差異，這些差異可能與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。通過空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，能夠準(zhǔn)確地定位這些具有不同基因表達(dá)特征的腫瘤細(xì)胞亞群，為進(jìn)一步研究腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了基礎(chǔ)?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)還可以揭示腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的空間分布特征，例如T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤模式和位置關(guān)系。這有助于深入了解腫瘤免疫微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，為開發(fā)基于免疫治療的新策略提供重要依據(jù)。空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境的全面分析。腫瘤微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，包含多種細(xì)胞類型和生物活性物質(zhì)，它們之間相互作用，共同影響腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和治療反應(yīng)。傳統(tǒng)研究方法往往只能孤立地研究腫瘤細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境中的某一種成分，難以全面揭示腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性和異質(zhì)性。而空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)可以同時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中的各種細(xì)胞成分進(jìn)行分析，獲取它們的基因表達(dá)譜和空間分布信息，從而全面地了解腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間的相互作用機(jī)制。在原發(fā)性肝癌研究中，通過空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，可以發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）與腫瘤細(xì)胞之間存在密切的相互作用。CAFs通過分泌細(xì)胞因子和生長因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞也可以通過信號(hào)傳導(dǎo)，影響CAFs的功能和表型。這種全面的分析有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和干預(yù)策略，為肝癌的治療提供更多的選擇。空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)能夠提供更準(zhǔn)確的腫瘤異質(zhì)性信息。原發(fā)性肝癌具有高度的異質(zhì)性，包括瘤間異質(zhì)性和瘤內(nèi)異質(zhì)性。傳統(tǒng)的研究方法由于樣本量有限和空間信息的缺失，難以全面準(zhǔn)確地評(píng)估腫瘤的異質(zhì)性。而空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)可以對(duì)腫瘤組織進(jìn)行高分辨率的分析，檢測到腫瘤內(nèi)部不同區(qū)域的基因表達(dá)差異，從而更準(zhǔn)確地揭示腫瘤的異質(zhì)性。通過對(duì)原發(fā)性肝癌組織進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)部存在多個(gè)具有不同基因表達(dá)特征的腫瘤細(xì)胞亞群，這些亞群在腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和治療反應(yīng)中可能發(fā)揮不同的作用?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)還可以分析腫瘤異質(zhì)性在空間上的變化規(guī)律，例如腫瘤邊緣區(qū)域和中心區(qū)域的異質(zhì)性差異，以及不同腫瘤區(qū)域之間的異質(zhì)性關(guān)聯(lián)。這對(duì)于制定個(gè)性化的治療方案具有重要意義，醫(yī)生可以根據(jù)腫瘤的異質(zhì)性特征，選擇更合適的治療方法，提高治療效果?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在原發(fā)性肝癌研究中具有保留組織空間信息、全面分析腫瘤細(xì)胞和微環(huán)境以及準(zhǔn)確揭示腫瘤異質(zhì)性等顯著優(yōu)勢，為肝癌的研究和治療帶來了新的機(jī)遇和突破。四、基于空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的原發(fā)性肝癌空間異質(zhì)性研究實(shí)例4.1研究設(shè)計(jì)與樣本采集在一項(xiàng)針對(duì)原發(fā)性肝癌空間異質(zhì)性的研究中，研究團(tuán)隊(duì)精心設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)方案，旨在全面深入地探究原發(fā)性肝癌在空間維度上的基因表達(dá)差異和細(xì)胞間相互作用機(jī)制。該研究的設(shè)計(jì)思路圍繞空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)展開，通過對(duì)原發(fā)性肝癌組織切片進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)合生物信息學(xué)分析方法，試圖揭示腫瘤內(nèi)部不同區(qū)域的基因表達(dá)特征以及腫瘤微環(huán)境中各種細(xì)胞類型的空間分布規(guī)律。研究人員認(rèn)為，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)能夠在保留組織空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，獲取基因表達(dá)信息，為解析原發(fā)性肝癌的空間異質(zhì)性提供了有力工具。通過分析不同患者的肝癌組織樣本，有望發(fā)現(xiàn)與肝癌發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路，為肝癌的精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)。研究樣本來源于[醫(yī)院名稱]的肝癌患者，這些患者均經(jīng)臨床病理確診為原發(fā)性肝癌。在樣本采集過程中，嚴(yán)格遵循倫理規(guī)范，獲得了患者的知情同意。研究人員共收集了[X]例肝癌患者的手術(shù)切除組織樣本，包括腫瘤核心區(qū)域、腫瘤邊緣區(qū)域以及距離腫瘤邊緣2cm以上的癌旁正常組織。在手術(shù)過程中，當(dāng)腫瘤組織被切除后，迅速使用無菌器械從不同區(qū)域采集組織樣本，確保樣本的新鮮度。采集的組織樣本立即放入預(yù)冷的RNAlater試劑中，以防止RNA降解。對(duì)于腫瘤核心區(qū)域，選取腫瘤內(nèi)部質(zhì)地較硬、顏色較深的部分進(jìn)行采樣；腫瘤邊緣區(qū)域則選取腫瘤與正常組織交界處的組織；癌旁正常組織樣本則取自距離腫瘤邊緣較遠(yuǎn)、外觀正常的肝臟組織。采集后的樣本在1小時(shí)內(nèi)迅速轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，并在-80℃冰箱中保存，直至進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為了保證樣本的代表性，研究人員在選擇患者時(shí)，綜合考慮了患者的年齡、性別、病理類型、腫瘤分期等因素。在[X]例患者中，男性[X]例，女性[X]例；年齡范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡為[平均年齡]歲；肝細(xì)胞癌患者[X]例，肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者[X]例，混合型肝癌患者[X]例；腫瘤分期涵蓋了早期、中期和晚期。這樣的樣本選擇策略使得研究結(jié)果能夠更全面地反映原發(fā)性肝癌的空間異質(zhì)性特征，避免了因樣本單一而導(dǎo)致的研究偏差。在樣本處理過程中，所有樣本均經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制。首先對(duì)組織樣本進(jìn)行肉眼觀察，去除明顯壞死、出血或污染的部分。然后使用冰凍切片機(jī)將組織樣本切成10μm厚的切片，將切片放置在空間轉(zhuǎn)錄組專用載玻片上。對(duì)切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（H&E）染色，通過顯微鏡觀察染色后的切片，評(píng)估組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性和細(xì)胞形態(tài)是否正常。只有質(zhì)量合格的切片才會(huì)進(jìn)入后續(xù)的空間轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒?yàn)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。4.2空間轉(zhuǎn)錄組測序與數(shù)據(jù)分析在樣本準(zhǔn)備就緒后，研究人員采用10xGenomicsVisium空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)平臺(tái)對(duì)組織切片進(jìn)行測序。該技術(shù)的核心原理是基于空間條形碼和逆轉(zhuǎn)錄捕獲技術(shù)。載玻片上的捕獲區(qū)域布滿了帶有空間條形碼、唯一分子標(biāo)識(shí)符（UMI）和poly（dT）的寡核苷酸探針。將組織切片放置在載玻片上并進(jìn)行透化處理后，細(xì)胞內(nèi)的mRNA釋放出來，與捕獲探針的poly（dT）結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)mRNA的捕獲。隨后，在原位進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將mRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。在這個(gè)過程中，每個(gè)cDNA分子都帶上了其所在位置的空間條形碼信息，以及用于區(qū)分不同轉(zhuǎn)錄本的UMI。經(jīng)過一系列的文庫構(gòu)建步驟，包括末端修復(fù)、接頭連接、PCR擴(kuò)增等，最終得到可以用于測序的文庫。構(gòu)建好的文庫使用IlluminaNovaSeq6000測序平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。測序過程采用雙端測序模式，Read1用于測序16bp的空間條形碼和長達(dá)12bp的UMI，Read2用于測序cDNA插入片段。通過這種方式，能夠準(zhǔn)確地獲取每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的空間位置信息和序列信息。在測序過程中，嚴(yán)格控制測序質(zhì)量，確保每個(gè)樣本的測序深度達(dá)到[X]reads以上，以保證能夠檢測到低表達(dá)基因和稀有轉(zhuǎn)錄本，全面地反映組織中的基因表達(dá)情況。測序完成后，得到的原始數(shù)據(jù)為FASTQ格式文件，包含大量的測序reads。首先利用SpaceRanger軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，其主要功能包括對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，去除低質(zhì)量的reads和接頭序列；將測序reads比對(duì)到參考基因組上，并根據(jù)空間條形碼信息將轉(zhuǎn)錄本定位到組織切片上的相應(yīng)位置；對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析，計(jì)算每個(gè)基因在每個(gè)spot中的表達(dá)量。經(jīng)過SpaceRanger處理后，得到的結(jié)果文件包含基因表達(dá)矩陣、空間位置信息以及與組織切片對(duì)應(yīng)的圖像文件等。將處理后的基因表達(dá)數(shù)據(jù)導(dǎo)入R語言環(huán)境，使用Seurat包進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，采用SCTransform方法，該方法構(gòu)建了基因表達(dá)的正則化負(fù)二項(xiàng)模型，能夠在保留生物差異的同時(shí)考慮技術(shù)因素，有效地消除了數(shù)據(jù)中的批次效應(yīng)和技術(shù)噪音。經(jīng)過歸一化處理后，進(jìn)行高變基因的篩選，使用FindVariableFeatures函數(shù)，根據(jù)基因表達(dá)的離散度和均值，篩選出在不同樣本或不同區(qū)域中表達(dá)變化較大的基因，這些高變基因?qū)τ诤罄m(xù)的分析具有重要意義。接著，利用降維算法對(duì)高變基因進(jìn)行降維處理，常用的降維算法包括主成分分析（PCA）和t-分布隨機(jī)鄰域嵌入（t-SNE）。在本研究中，首先使用PCA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步降維，提取數(shù)據(jù)的主要特征。通過ElbowPlot函數(shù)確定主成分的數(shù)量，選擇能夠解釋大部分?jǐn)?shù)據(jù)變異的主成分用于后續(xù)分析。然后，使用t-SNE算法將高維數(shù)據(jù)映射到二維空間，以便于可視化和聚類分析。在t-SNE降維過程中，調(diào)整相關(guān)參數(shù)，如perplexity和learningrate，以獲得較好的降維效果?；诮稻S后的數(shù)據(jù)，使用FindNeighbors和FindClusters函數(shù)進(jìn)行聚類分析。FindNeighbors函數(shù)通過計(jì)算細(xì)胞之間的距離，構(gòu)建近鄰圖，用于定義細(xì)胞之間的鄰居關(guān)系。FindClusters函數(shù)則基于近鄰圖，使用Louvain算法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行聚類，將具有相似基因表達(dá)模式的細(xì)胞聚成不同的簇。在聚類過程中，通過調(diào)整分辨率參數(shù)，得到不同粒度的聚類結(jié)果。經(jīng)過多次嘗試，選擇分辨率為[X]時(shí)的聚類結(jié)果，此時(shí)聚類效果較好，能夠清晰地區(qū)分不同的細(xì)胞亞群。通過上述分析流程，成功地對(duì)原發(fā)性肝癌組織的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了處理和分析，得到了基因在組織切片上的空間表達(dá)信息以及不同的細(xì)胞亞群。這些結(jié)果為后續(xù)深入研究原發(fā)性肝癌的空間異質(zhì)性提供了堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。4.3研究結(jié)果與發(fā)現(xiàn)通過空間轉(zhuǎn)錄組測序和深入的數(shù)據(jù)分析，成功構(gòu)建了原發(fā)性肝癌的高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組圖譜，該圖譜全面展示了肝癌組織中基因表達(dá)的空間分布情況。從圖譜中可以直觀地看到，不同區(qū)域的基因表達(dá)存在明顯差異，腫瘤核心區(qū)域、腫瘤邊緣區(qū)域以及癌旁正常組織呈現(xiàn)出各自獨(dú)特的基因表達(dá)模式。在腫瘤核心區(qū)域，一些與腫瘤細(xì)胞增殖、代謝相關(guān)的基因如PCNA、LDHA等表達(dá)顯著上調(diào)，這表明腫瘤核心區(qū)域的細(xì)胞具有較高的增殖活性和代謝水平，以滿足腫瘤快速生長的需求。而在癌旁正常組織中，與肝臟正常功能相關(guān)的基因如ALB、CYP2E1等表達(dá)較高，維持著肝臟的正常生理功能。對(duì)腫瘤不同區(qū)域的基因表達(dá)特征進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)了一系列與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因和信號(hào)通路。通過差異表達(dá)分析，篩選出在腫瘤區(qū)域與癌旁正常組織之間差異表達(dá)的基因，其中許多基因參與了細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖、凋亡、代謝等生物學(xué)過程。在腫瘤區(qū)域，細(xì)胞周期相關(guān)基因如CCNB1、CDC25C等表達(dá)上調(diào)，表明腫瘤細(xì)胞的增殖活性增強(qiáng)。與代謝相關(guān)的基因如GLUT1、PDK1等表達(dá)也顯著升高，這與腫瘤細(xì)胞的代謝重編程現(xiàn)象一致，腫瘤細(xì)胞通過增強(qiáng)糖酵解等代謝途徑獲取更多的能量和物質(zhì)，以支持其快速生長和增殖。通過基因富集分析（GO和KEGG），發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因主要富集在PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等，這些信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。PI3K-Akt信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和遷移，抑制細(xì)胞凋亡；MAPK信號(hào)通路則參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和應(yīng)激反應(yīng)；Wnt信號(hào)通路的異常激活與腫瘤細(xì)胞的干性維持、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）等過程密切相關(guān)。在細(xì)胞組成方面，利用空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合細(xì)胞類型標(biāo)記基因，對(duì)肝癌組織中的細(xì)胞類型進(jìn)行了鑒定和分析。結(jié)果顯示，肝癌組織中不僅包含腫瘤細(xì)胞，還存在多種腫瘤微環(huán)境細(xì)胞，如免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等，且它們在空間分布上呈現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性。免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮著重要的免疫監(jiān)視和免疫調(diào)節(jié)作用。在腫瘤邊緣區(qū)域，T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的浸潤程度相對(duì)較高。T細(xì)胞中的CD8+T細(xì)胞具有殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，在腫瘤邊緣區(qū)域的部分區(qū)域中，CD8+T細(xì)胞的數(shù)量較多，且其相關(guān)的細(xì)胞毒性基因如GZMB、PRF1等表達(dá)上調(diào)，表明這些區(qū)域的免疫細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。然而，在腫瘤核心區(qū)域，由于腫瘤細(xì)胞分泌的免疫抑制因子以及缺氧等微環(huán)境因素的影響，免疫細(xì)胞的功能可能受到抑制。T細(xì)胞的增殖能力下降，免疫檢查點(diǎn)分子如PD-1、CTLA-4等表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用減弱，腫瘤細(xì)胞得以逃避免疫監(jiān)視。巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中存在不同的極化狀態(tài)，M1型巨噬細(xì)胞具有抗腫瘤活性，主要分布在腫瘤的周邊區(qū)域，能夠分泌細(xì)胞因子和趨化因子，激活免疫細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的殺傷；而M2型巨噬細(xì)胞則具有促腫瘤作用，多分布在腫瘤內(nèi)部，它們能夠促進(jìn)腫瘤血管生成、免疫抑制和腫瘤細(xì)胞的遷移。在本研究中，通過對(duì)巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記基因的分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)部M2型巨噬細(xì)胞的比例相對(duì)較高，且其相關(guān)的基因如ARG1、CD163等表達(dá)上調(diào)，表明M2型巨噬細(xì)胞在腫瘤內(nèi)部發(fā)揮著重要的促腫瘤作用?；|(zhì)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中也起著重要的支持作用。成纖維細(xì)胞在腫瘤間質(zhì)中廣泛分布，通過分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分和生長因子，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長、遷移和侵襲起到支持作用。在腫瘤邊緣區(qū)域，成纖維細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞緊密相互作用，其分泌的一些生長因子如TGF-β、PDGF等可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成了腫瘤血管的內(nèi)壁，腫瘤血管的生成和分布具有明顯的空間異質(zhì)性。腫瘤邊緣區(qū)域的血管通常更為豐富，血管形態(tài)不規(guī)則，通透性較高，這有利于腫瘤細(xì)胞獲取營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，但也增加了腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。通過對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記基因如CD31、VEGFR2等的分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤邊緣區(qū)域內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量較多，且其相關(guān)基因的表達(dá)水平較高，表明腫瘤邊緣區(qū)域的血管生成較為活躍。對(duì)腫瘤邊緣區(qū)域微環(huán)境特征的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤邊緣區(qū)域具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。腫瘤邊緣區(qū)域的腫瘤細(xì)胞與周圍正常組織相互交錯(cuò)，形成了復(fù)雜的界面。在這個(gè)界面處，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出更高的侵襲活性，相關(guān)的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因如MMP2、MMP9、CXCR4等表達(dá)上調(diào)。MMP2和MMP9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的成員，它們能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供條件。CXCR4是一種趨化因子受體，與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其在腫瘤邊緣區(qū)域的高表達(dá)表明腫瘤細(xì)胞可能通過CXCR4與其配體CXCL12的相互作用，向周圍正常組織浸潤和轉(zhuǎn)移。腫瘤邊緣區(qū)域的微環(huán)境還存在免疫細(xì)胞浸潤和免疫逃逸的現(xiàn)象。雖然腫瘤邊緣區(qū)域有較多的免疫細(xì)胞浸潤，但腫瘤細(xì)胞也會(huì)通過多種機(jī)制逃避免疫監(jiān)視。腫瘤細(xì)胞可能分泌免疫抑制因子如TGF-β、IL-10等，抑制免疫細(xì)胞的活性；腫瘤細(xì)胞表面的免疫檢查點(diǎn)分子如PD-L1的表達(dá)也可能上調(diào)，與免疫細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合，阻斷免疫細(xì)胞的活化信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。腫瘤邊緣區(qū)域的血管生成也較為活躍，為腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。腫瘤細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等促進(jìn)血管生成的因子在腫瘤邊緣區(qū)域的表達(dá)較高，導(dǎo)致該區(qū)域的血管密度增加，血管通透性增強(qiáng)，有利于腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在研究原發(fā)性肝癌的瘤內(nèi)異質(zhì)性時(shí)，發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)部存在多個(gè)具有不同基因表達(dá)特征和生物學(xué)行為的細(xì)胞亞群。通過對(duì)腫瘤組織的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，將腫瘤細(xì)胞分為多個(gè)不同的簇，每個(gè)簇代表一個(gè)具有相似基因表達(dá)模式的細(xì)胞亞群。不同的腫瘤細(xì)胞亞群在腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和治療反應(yīng)中可能發(fā)揮不同的作用。一些亞群的腫瘤細(xì)胞具有較高的增殖活性，其相關(guān)的細(xì)胞周期基因和增殖相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)；而另一些亞群的腫瘤細(xì)胞則可能具有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，其相關(guān)的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)較高。這些不同亞群的腫瘤細(xì)胞在空間上并非孤立存在，而是相互交織、相互作用。通過細(xì)胞通訊分析，發(fā)現(xiàn)不同亞群的腫瘤細(xì)胞之間存在廣泛的配體-受體相互作用，這些相互作用可能影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和進(jìn)化。腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等之間也存在復(fù)雜的相互作用。腫瘤細(xì)胞可以通過分泌細(xì)胞因子和生長因子，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的功能；免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞也可以反過來影響腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。在腫瘤內(nèi)部，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）與腫瘤細(xì)胞之間存在密切的相互作用。CAFs可以分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，如TGF-β、PDGF等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。腫瘤細(xì)胞也可以通過信號(hào)傳導(dǎo)，影響CAFs的功能和表型，使其成為腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的支持者。腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的相互作用也十分復(fù)雜。腫瘤細(xì)胞可以通過表達(dá)免疫抑制分子，抑制免疫細(xì)胞的活性，逃避免疫監(jiān)視；免疫細(xì)胞則可以通過識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的抗原，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。在腫瘤內(nèi)部，不同區(qū)域的腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的相互作用存在差異，這也是導(dǎo)致腫瘤異質(zhì)性的重要原因之一。五、研究成果的臨床意義與應(yīng)用前景5.1對(duì)原發(fā)性肝癌發(fā)病機(jī)制的深入理解本研究通過空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，揭示了原發(fā)性肝癌的空間異質(zhì)性，這為深入理解肝癌的發(fā)病機(jī)制提供了全新的視角和關(guān)鍵信息。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過程，涉及多個(gè)基因的異常表達(dá)和多種細(xì)胞類型之間的相互作用。原發(fā)性肝癌的空間異質(zhì)性在這一過程中發(fā)揮著重要作用，它影響著腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及對(duì)治療的反應(yīng)。在肝癌的發(fā)生階段，空間異質(zhì)性使得腫瘤細(xì)胞在肝臟組織中的分布并非均勻一致，而是形成不同的細(xì)胞亞群。這些亞群可能起源于不同的細(xì)胞克隆，具有不同的基因表達(dá)特征和生物學(xué)行為。研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌的早期階段，一些腫瘤細(xì)胞亞群可能位于肝臟的特定區(qū)域，如肝小葉的邊緣或肝竇周圍。這些區(qū)域的細(xì)胞可能更容易接觸到血液中的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子，從而獲得生存和增殖的優(yōu)勢。在這些區(qū)域，與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因如CCND1、MYC等表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的快速分裂和生長。腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞成分和細(xì)胞外基質(zhì)在空間上的異質(zhì)性分布也對(duì)肝癌的發(fā)生起到了重要的調(diào)節(jié)作用。在腫瘤發(fā)生的起始部位，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）可能與腫瘤細(xì)胞緊密相互作用。CAFs通過分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，如TGF-β、PDGF等，為腫瘤細(xì)胞提供生長信號(hào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞在空間分布上的異質(zhì)性也影響著肝癌的發(fā)生。在肝癌發(fā)生的早期，腫瘤邊緣區(qū)域可能存在較多的免疫細(xì)胞浸潤，如T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等。這些免疫細(xì)胞具有一定的抗腫瘤活性，能夠識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。然而，腫瘤細(xì)胞也會(huì)通過多種機(jī)制逃避免疫監(jiān)視，如分泌免疫抑制因子、表達(dá)免疫檢查點(diǎn)分子等。在腫瘤內(nèi)部，由于免疫抑制微環(huán)境的形成，免疫細(xì)胞的功能可能受到抑制，使得腫瘤細(xì)胞得以逃脫免疫攻擊，進(jìn)一步發(fā)展為腫瘤。隨著肝癌的發(fā)展，空間異質(zhì)性進(jìn)一步加劇，不同區(qū)域的腫瘤細(xì)胞亞群在基因表達(dá)和生物學(xué)行為上的差異更加明顯。在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移階段，腫瘤邊緣區(qū)域的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲能力。通過空間轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤邊緣區(qū)域的腫瘤細(xì)胞中，與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)的基因如SNAI1、TWIST1等表達(dá)上調(diào)。這些基因的表達(dá)促使腫瘤細(xì)胞失去上皮細(xì)胞的特性，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特征，從而增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。腫瘤邊緣區(qū)域的腫瘤細(xì)胞還高表達(dá)與細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)的基因，如MMP2、MMP9等。這些基質(zhì)金屬蛋白酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移開辟道路。腫瘤微環(huán)境中的血管生成在空間上也存在異質(zhì)性。腫瘤邊緣區(qū)域的血管生成更為活躍，這為腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。腫瘤細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等促血管生成因子在腫瘤邊緣區(qū)域的表達(dá)較高，促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，形成了豐富的腫瘤血管網(wǎng)絡(luò)。這些血管不僅為腫瘤細(xì)胞提供了充足的營養(yǎng)和氧氣，還使得腫瘤細(xì)胞更容易進(jìn)入血液循環(huán)，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在肝癌的進(jìn)展過程中，腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用也發(fā)生了動(dòng)態(tài)變化。在腫瘤內(nèi)部，由于缺氧、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏以及免疫抑制微環(huán)境的形成，腫瘤細(xì)胞可能發(fā)生代謝重編程。腫瘤細(xì)胞通過增強(qiáng)糖酵解等代謝途徑獲取能量，同時(shí)分泌大量的乳酸等代謝產(chǎn)物，改變了微環(huán)境的酸堿度。這種代謝變化不僅影響了腫瘤細(xì)胞自身的生物學(xué)行為，還對(duì)腫瘤微環(huán)境中的其他細(xì)胞產(chǎn)生了影響。腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞在這種酸性環(huán)境下可能發(fā)生極化，從具有抗腫瘤活性的M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂写倌[瘤作用的M2型巨噬細(xì)胞。M2型巨噬細(xì)胞通過分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，如IL-10、TGF-β等，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，同時(shí)抑制免疫細(xì)胞的活性，形成了一個(gè)惡性循環(huán)，加速了腫瘤的進(jìn)展。本研究通過空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)揭示的原發(fā)性肝癌空間異質(zhì)性，為深入理解肝癌的發(fā)病機(jī)制提供了全面而細(xì)致的信息。從腫瘤的發(fā)生起始，到腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和進(jìn)展，空間異質(zhì)性在各個(gè)階段都發(fā)揮著重要作用。它影響著腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)、生物學(xué)行為以及與腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞的相互作用。這些發(fā)現(xiàn)有助于我們更深入地認(rèn)識(shí)肝癌的發(fā)病機(jī)制，為開發(fā)新的治療策略提供了理論基礎(chǔ)。5.2在肝癌診斷與預(yù)后評(píng)估中的應(yīng)用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)為原發(fā)性肝癌的診斷與預(yù)后評(píng)估提供了全新的視角和有力的工具，展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用價(jià)值。在肝癌診斷方面，傳統(tǒng)的診斷方法主要依賴于病理活檢、影像學(xué)檢查以及血清學(xué)標(biāo)志物檢測等。病理活檢雖然是肝癌診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但存在局限性，如樣本代表性不足、無法全面反映腫瘤異質(zhì)性等。影像學(xué)檢查如超聲、CT、MRI等能夠提供腫瘤的形態(tài)、大小和位置信息，但對(duì)于腫瘤的分子特征和細(xì)胞組成了解有限。血清學(xué)標(biāo)志物檢測如甲胎蛋白（AFP）等，雖然具有一定的診斷價(jià)值，但存在假陽性和假陰性的問題，且對(duì)早期肝癌的診斷靈敏度不高?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)診斷方法的不足，通過分析腫瘤組織的基因表達(dá)空間特征，為肝癌的早期診斷提供更準(zhǔn)確的依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中存在一些特異性的基因表達(dá)模式，這些模式在腫瘤的不同區(qū)域以及腫瘤與癌旁正常組織之間存在顯著差異。通過空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，可以檢測到這些差異表達(dá)基因，并利用它們構(gòu)建診斷模型。通過對(duì)肝癌組織和癌旁正常組織的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出了一組與肝癌發(fā)生密切相關(guān)的基因，這些基因在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織。利用這些基因構(gòu)建的診斷模型，對(duì)肝癌的診斷準(zhǔn)確率達(dá)到了[X]%，顯著高于傳統(tǒng)診斷方法?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)還可以對(duì)肝癌的亞型進(jìn)行精準(zhǔn)分類，不同亞型的肝癌在基因表達(dá)和生物學(xué)行為上存在差異，通過分析空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，可以準(zhǔn)確識(shí)別不同亞型的肝癌，為個(gè)性化治療提供依據(jù)。在預(yù)后評(píng)估方面，準(zhǔn)確預(yù)測肝癌患者的預(yù)后對(duì)于制定合理的治療方案和改善患者生存質(zhì)量具有重要意義。傳統(tǒng)的預(yù)后評(píng)估指標(biāo)如腫瘤大小、分期、肝功能等雖然具有一定的價(jià)值，但無法全面反映腫瘤的生物學(xué)行為和患者的個(gè)體差異。近年來的研究表明，腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等以及它們之間的相互作用對(duì)肝癌的預(yù)后具有重要影響?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)可以深入分析腫瘤微環(huán)境的空間異質(zhì)性，揭示免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等在腫瘤組織中的分布和功能狀態(tài)，從而為肝癌的預(yù)后評(píng)估提供更全面、準(zhǔn)確的信息。通過對(duì)肝癌組織的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤邊緣區(qū)域的免疫細(xì)胞浸潤情況與患者的預(yù)后密切相關(guān)。在腫瘤邊緣區(qū)域，CD8+T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的浸潤程度較高，且其相關(guān)的細(xì)胞毒性基因表達(dá)上調(diào)，提示患者的預(yù)后較好；相反，若腫瘤邊緣區(qū)域免疫細(xì)胞浸潤較少，且免疫抑制分子表達(dá)上調(diào)，患者的預(yù)后往往較差。通過對(duì)這些空間轉(zhuǎn)錄組特征進(jìn)行分析，可以構(gòu)建預(yù)后預(yù)測模型，準(zhǔn)確預(yù)測肝癌患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和生存時(shí)間。有研究利用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)肝癌患者的腫瘤組織進(jìn)行分析，結(jié)合臨床數(shù)據(jù)，構(gòu)建了一個(gè)基于空間轉(zhuǎn)錄組特征的預(yù)后預(yù)測模型。該模型在獨(dú)立驗(yàn)證隊(duì)列中表現(xiàn)出了良好的預(yù)測性能，能夠準(zhǔn)確區(qū)分高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)患者，為臨床醫(yī)生制定個(gè)性化的治療方案提供了重要參考?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)還可以發(fā)現(xiàn)一些新的預(yù)后相關(guān)生物標(biāo)志物，這些生物標(biāo)志物可以作為潛在的治療靶點(diǎn)，為肝癌的治療提供新的方向。5.3為肝癌個(gè)性化治療提供依據(jù)原發(fā)性肝癌的空間異質(zhì)性為臨床治療帶來了巨大挑戰(zhàn)，但同時(shí)也為個(gè)性化治療提供了關(guān)鍵線索?；诳臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)肝癌空間異質(zhì)性的深入研究，能夠?yàn)榛颊咧贫ǜ泳珳?zhǔn)、有效的個(gè)性化治療方案，從而提高治療效果，減少不良反應(yīng)。在手術(shù)治療方面，了解腫瘤的空間異質(zhì)性有助于優(yōu)化手術(shù)策略。傳統(tǒng)的肝癌手術(shù)主要依