基于結(jié)構(gòu)的STAT3小分子抑制劑虛擬篩選及活性探究：從理論到實(shí)踐一、引言1.1研究背景與意義在當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（SignalTransducerandActivatorofTranscription3，STAT3）因其在多種生理病理過(guò)程中扮演的關(guān)鍵角色，成為了備受矚目的研究對(duì)象。作為一種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要蛋白質(zhì)，STAT3參與了細(xì)胞增殖、存活、分化、凋亡、免疫應(yīng)答以及炎癥等一系列至關(guān)重要的生物學(xué)過(guò)程。尤其值得關(guān)注的是，它與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中，STAT3常常處于持續(xù)激活狀態(tài)，這會(huì)促使下游一系列與細(xì)胞增殖、抗凋亡、血管生成以及轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)。比如，通過(guò)上調(diào)CyclinD1的表達(dá)，STAT3能夠加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的快速增殖；同時(shí)，增強(qiáng)Bcl-xL和Survivin等抗凋亡蛋白的表達(dá)，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的凋亡機(jī)制，獲得更強(qiáng)的生存能力；此外，還能誘導(dǎo)VEGF等血管生成因子的產(chǎn)生，為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供充足的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和血管支持。相關(guān)研究表明，在乳腺癌、肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中，都能檢測(cè)到STAT3的異常激活，并且其激活水平與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能以及患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。因此，開發(fā)能夠有效抑制STAT3活性的抑制劑，對(duì)于癌癥的治療具有重要的臨床價(jià)值。目前，科研人員已經(jīng)報(bào)道了一些STAT3抑制劑，這些抑制劑在一定程度上展現(xiàn)出了對(duì)STAT3活性的抑制作用以及潛在的治療效果。然而，它們的治療效果仍然受到多種結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性的限制。從結(jié)構(gòu)方面來(lái)看，許多抑制劑難以與STAT3形成緊密且特異性的結(jié)合。STAT3靶點(diǎn)界面相對(duì)平坦，缺乏明顯的“口袋”結(jié)構(gòu)，這使得設(shè)計(jì)能夠高效結(jié)合并抑制其活性的小分子化合物面臨巨大挑戰(zhàn)。已有的一些抑制劑在與STAT3結(jié)合時(shí)，親和力較低，容易從靶點(diǎn)上解離，導(dǎo)致抑制效果不佳。在生物學(xué)特性方面，部分抑制劑的選擇性不強(qiáng)，無(wú)法在STAT家族蛋白中高效選擇性抑制STAT3。STAT家族包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5（STAT5A和STAT5B）和STAT6等多個(gè)成員，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能上存在一定的相似性。非選擇性的抑制劑在抑制STAT3的同時(shí)，可能會(huì)對(duì)其他STAT蛋白產(chǎn)生影響，從而引發(fā)一系列不必要的副作用，嚴(yán)重影響藥物的安全性和有效性。現(xiàn)有抑制劑的活性也有待提高，多數(shù)STAT3小分子抑制劑的抑制活性處于微摩爾水平，這極大地限制了它們?cè)谂R床上的應(yīng)用效果，難以滿足患者對(duì)于高效治療藥物的迫切需求。綜上所述，開發(fā)新型、高效且安全的STAT3小分子抑制劑迫在眉睫。本研究旨在通過(guò)基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選方法，從大量的小分子化合物庫(kù)中尋找能夠特異性結(jié)合并有效抑制STAT3活性的小分子抑制劑，并對(duì)篩選出的化合物進(jìn)行初步的活性篩選，為后續(xù)的藥物研發(fā)提供有價(jià)值的先導(dǎo)化合物，有望為癌癥等相關(guān)疾病的治療開辟新的途徑，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在運(yùn)用基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選技術(shù)，結(jié)合先進(jìn)的計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)方法，從大規(guī)模的小分子化合物庫(kù)中篩選出能夠與STAT3特異性結(jié)合并有效抑制其活性的小分子抑制劑，并對(duì)篩選得到的化合物進(jìn)行初步的活性篩選，為后續(xù)的藥物研發(fā)提供優(yōu)質(zhì)的先導(dǎo)化合物。在基于結(jié)構(gòu)的STAT3小分子抑制劑虛擬篩選方面，本研究計(jì)劃全面收集和整理STAT3相關(guān)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定和從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB）等權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取高質(zhì)量的STAT3三維結(jié)構(gòu)信息，確保結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和完整性。運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)，將小分子化合物庫(kù)中的化合物逐一與STAT3的活性位點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接模擬，預(yù)測(cè)化合物與STAT3的結(jié)合模式和結(jié)合親和力，依據(jù)分子對(duì)接的結(jié)果，篩選出具有較高結(jié)合親和力和合理結(jié)合模式的小分子化合物，構(gòu)建初步的候選化合物集。采用分子動(dòng)力學(xué)模擬方法，對(duì)初步篩選出的候選化合物與STAT3形成的復(fù)合物進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬，深入分析復(fù)合物在動(dòng)態(tài)過(guò)程中的穩(wěn)定性、相互作用能以及關(guān)鍵氨基酸殘基與化合物之間的相互作用細(xì)節(jié)，進(jìn)一步篩選出在動(dòng)力學(xué)模擬中表現(xiàn)穩(wěn)定、與STAT3相互作用較強(qiáng)的小分子化合物，確定最終的虛擬篩選結(jié)果。在初步活性篩選階段，本研究將開展細(xì)胞水平的活性篩選實(shí)驗(yàn)，選取多種STAT3異常激活的腫瘤細(xì)胞系，如乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549等，采用MTT法、CCK-8法等檢測(cè)方法，評(píng)估虛擬篩選得到的小分子化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，利用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)檢測(cè)化合物處理后細(xì)胞中STAT3及其下游相關(guān)蛋白的磷酸化水平和表達(dá)量變化，驗(yàn)證化合物對(duì)STAT3信號(hào)通路的抑制效果。還會(huì)進(jìn)行初步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，建立合適的腫瘤動(dòng)物模型，如裸鼠移植瘤模型，將篩選出的小分子化合物通過(guò)腹腔注射、灌胃等方式給予動(dòng)物，觀察化合物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，定期測(cè)量腫瘤體積和重量，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，評(píng)估化合物的體內(nèi)抗腫瘤活性，通過(guò)對(duì)動(dòng)物的血液、組織等樣本進(jìn)行檢測(cè)，分析化合物的安全性和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，為后續(xù)的研究提供重要參考。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的研究方法，從分子層面到細(xì)胞、動(dòng)物水平，逐步深入地開展基于結(jié)構(gòu)的STAT3小分子抑制劑虛擬篩選及其初步活性篩選工作，技術(shù)路線清晰且嚴(yán)謹(jǐn)。在基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選階段，充分利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)，通過(guò)分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬等方法，從龐大的小分子化合物庫(kù)中篩選出與STAT3具有潛在強(qiáng)結(jié)合能力和穩(wěn)定相互作用的小分子。具體來(lái)說(shuō)，分子對(duì)接方法是將小分子化合物庫(kù)中的化合物逐一與STAT3的活性位點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接模擬，運(yùn)用專業(yè)的分子對(duì)接軟件，如AutoDock、Glide等，基于分子間的幾何匹配和能量互補(bǔ)原理，預(yù)測(cè)化合物與STAT3的結(jié)合模式和結(jié)合親和力。通過(guò)對(duì)結(jié)合模式的分析，判斷化合物是否能夠以合理的方式與STAT3活性位點(diǎn)相互作用；依據(jù)結(jié)合親和力的大小，對(duì)化合物進(jìn)行初步排序，篩選出具有較高結(jié)合親和力的小分子化合物，構(gòu)建初步的候選化合物集。分子動(dòng)力學(xué)模擬則是對(duì)初步篩選出的候選化合物與STAT3形成的復(fù)合物進(jìn)行更深入的動(dòng)態(tài)分析。采用GROMACS、AMBER等分子動(dòng)力學(xué)模擬軟件，在一定的力場(chǎng)條件下，模擬復(fù)合物在溶液環(huán)境中的動(dòng)態(tài)行為，時(shí)間尺度通常設(shè)置為100ns-1μs甚至更長(zhǎng)。通過(guò)分析模擬軌跡，計(jì)算復(fù)合物的均方根偏差（RMSD）、均方根漲落（RMSF）、相互作用能等參數(shù)，評(píng)估復(fù)合物在動(dòng)態(tài)過(guò)程中的穩(wěn)定性。關(guān)注關(guān)鍵氨基酸殘基與化合物之間的氫鍵、疏水相互作用等細(xì)節(jié)變化，進(jìn)一步篩選出在動(dòng)力學(xué)模擬中表現(xiàn)穩(wěn)定、與STAT3相互作用較強(qiáng)的小分子化合物，確定最終的虛擬篩選結(jié)果。在初步活性篩選階段，采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式，對(duì)虛擬篩選得到的小分子化合物進(jìn)行生物學(xué)活性驗(yàn)證。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)選取多種STAT3異常激活的腫瘤細(xì)胞系，如乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、肝癌細(xì)胞系HepG2等。使用MTT法、CCK-8法等檢測(cè)方法，按照一定的化合物濃度梯度（如0.1μM、1μM、10μM、50μM、100μM）處理細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)（如24h、48h、72h）檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，評(píng)估小分子化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。利用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育（針對(duì)STAT3、p-STAT3、下游相關(guān)蛋白如CyclinD1、Bcl-xL等）、二抗孵育、化學(xué)發(fā)光顯影等步驟，檢測(cè)化合物處理后細(xì)胞中STAT3及其下游相關(guān)蛋白的磷酸化水平和表達(dá)量變化，驗(yàn)證化合物對(duì)STAT3信號(hào)通路的抑制效果。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)建立合適的腫瘤動(dòng)物模型，如裸鼠移植瘤模型。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞（如1×10^7個(gè)細(xì)胞）接種于裸鼠背部皮下，待腫瘤生長(zhǎng)至一定體積（如100-150mm3）后，將裸鼠隨機(jī)分組，每組5-8只。將篩選出的小分子化合物通過(guò)腹腔注射（常用劑量為10-50mg/kg）、灌胃（常用劑量為20-100mg/kg）等方式給予動(dòng)物，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組給予相應(yīng)的溶劑。定期測(cè)量腫瘤體積和重量，按照公式V=0.5×長(zhǎng)×寬2計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，評(píng)估化合物的體內(nèi)抗腫瘤活性。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行安樂死，采集血液、腫瘤組織、主要臟器（如心、肝、脾、肺、腎）等樣本。通過(guò)血液生化指標(biāo)檢測(cè)（如谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酐、尿素氮等）和血常規(guī)檢測(cè)（如白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板等），分析化合物對(duì)動(dòng)物肝功能、腎功能、血液系統(tǒng)等的影響，評(píng)估化合物的安全性。對(duì)腫瘤組織和臟器進(jìn)行病理切片分析，觀察組織形態(tài)學(xué)變化，進(jìn)一步了解化合物的作用機(jī)制和潛在毒性。本研究的技術(shù)路線圖如下所示：收集整理STAT3結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)：從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)獲取、實(shí)驗(yàn)測(cè)定STAT3三維結(jié)構(gòu)。小分子化合物庫(kù)準(zhǔn)備：收集、規(guī)范化處理化合物，構(gòu)建化合物庫(kù)。分子對(duì)接篩選：用分子對(duì)接軟件將化合物與STAT3活性位點(diǎn)對(duì)接，根據(jù)結(jié)合親和力和模式篩選初步候選化合物。分子動(dòng)力學(xué)模擬：對(duì)初步候選化合物與STAT3復(fù)合物進(jìn)行模擬，依穩(wěn)定性和相互作用篩選最終虛擬篩選化合物。細(xì)胞水平活性篩選：選腫瘤細(xì)胞系，用MTT法、CCK-8法測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，WesternBlot測(cè)蛋白變化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：建裸鼠移植瘤模型，給藥觀察腫瘤生長(zhǎng)，檢測(cè)血液、組織樣本評(píng)估活性、安全性和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。二、STAT3相關(guān)基礎(chǔ)理論2.1STAT3的結(jié)構(gòu)與功能2.1.1STAT3的結(jié)構(gòu)組成STAT3是一種由770個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，具有6個(gè)功能保守結(jié)構(gòu)域，各結(jié)構(gòu)域緊密協(xié)作，共同維持STAT3的正常生物學(xué)功能。氨基末端結(jié)構(gòu)域（N-TerminalDomain，NTD），約由1-130位氨基酸組成，該結(jié)構(gòu)域在STAT家族成員中具有較高的保守性，主要用于STAT蛋白與多個(gè)共同DNA位點(diǎn)的協(xié)同結(jié)合，對(duì)維持STAT3的四聚體結(jié)構(gòu)起著關(guān)鍵作用，進(jìn)而影響其與DNA的結(jié)合能力和轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。通過(guò)X射線晶體學(xué)和核磁共振等結(jié)構(gòu)解析技術(shù)發(fā)現(xiàn)，NTD呈現(xiàn)出獨(dú)特的折疊方式，其中包含多個(gè)α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)，這些二級(jí)結(jié)構(gòu)元件相互作用，形成了一個(gè)穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)模塊。NTD中的一些關(guān)鍵氨基酸殘基，如賴氨酸、精氨酸等帶正電荷的氨基酸，能夠與DNA分子中的磷酸基團(tuán)通過(guò)靜電相互作用結(jié)合，增強(qiáng)STAT3與DNA的親和力。螺旋卷曲結(jié)構(gòu)域（Coiled-CoilDomain，CCD），大致位于131-320位氨基酸。該結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)向受體募集STAT3以及隨后的磷酸化、二聚化和核轉(zhuǎn)位過(guò)程。CCD由多個(gè)α-螺旋相互纏繞形成螺旋卷曲結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)賦予了CCD較高的柔韌性和可塑性，使其能夠在不同的信號(hào)刺激下發(fā)生構(gòu)象變化，從而與不同的受體分子相互作用。當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子的刺激時(shí)，CCD能夠識(shí)別并結(jié)合到相應(yīng)受體的特定結(jié)構(gòu)域上，將STAT3招募到受體附近，為后續(xù)的磷酸化和激活過(guò)程創(chuàng)造條件。DNA結(jié)合域（DNA-BindingDomain，DBD），由約321-480位氨基酸組成，負(fù)責(zé)識(shí)別和結(jié)合特定的共同DNA序列，是STAT3發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。DBD具有獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)，包含多個(gè)α-螺旋和環(huán)區(qū)，其中一些關(guān)鍵的氨基酸殘基能夠與DNA的堿基對(duì)形成特異性的氫鍵和范德華力相互作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定DNA序列的精準(zhǔn)識(shí)別和結(jié)合。研究表明，DBD能夠識(shí)別具有特定回文序列的DNA元件，如干擾素-γ激活序列（GAS）等，與這些DNA元件結(jié)合后，STAT3能夠招募轉(zhuǎn)錄機(jī)器，啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。連接結(jié)構(gòu)域（LinkerDomain），處于481-580位氨基酸之間，主要用于連接DBD和SH2結(jié)構(gòu)域，起到橋梁和調(diào)節(jié)的作用。雖然連接結(jié)構(gòu)域本身并不直接參與與其他分子的特異性結(jié)合，但它的存在對(duì)于維持STAT3整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及各結(jié)構(gòu)域之間的協(xié)同作用至關(guān)重要。連接結(jié)構(gòu)域具有一定的柔性，能夠在STAT3的激活和功能發(fā)揮過(guò)程中，協(xié)調(diào)DBD和SH2結(jié)構(gòu)域的相對(duì)位置和取向，使得它們能夠更好地與其他分子相互作用。SRC同源2結(jié)構(gòu)域（SrcHomology2Domain，SH2），由581-680位氨基酸組成，是STAT3激活和二聚化的關(guān)鍵區(qū)域。SH2結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合磷酸化的酪氨酸殘基，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)STAT3被激活時(shí)，其自身或受體上的酪氨酸殘基會(huì)被磷酸化，SH2結(jié)構(gòu)域能夠迅速識(shí)別并結(jié)合這些磷酸化的酪氨酸殘基，通過(guò)與相對(duì)亞基中的磷酸化酪氨酸殘基相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)STAT3分子的二聚化。這種二聚化過(guò)程使得STAT3能夠獲得進(jìn)入細(xì)胞核的能力，并與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。羧基末端反式激活結(jié)構(gòu)域（Carboxyl-TerminalTransactivationDomain，TAD），由681-770位氨基酸組成，負(fù)責(zé)與轉(zhuǎn)錄機(jī)器結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。TAD包含多個(gè)功能亞結(jié)構(gòu)域，其中一些區(qū)域富含酸性氨基酸殘基，能夠與轉(zhuǎn)錄激活因子、輔激活因子等轉(zhuǎn)錄機(jī)器中的蛋白質(zhì)相互作用，形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，從而促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄起始和延伸。TAD還可以通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相互作用，調(diào)節(jié)STAT3對(duì)不同靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，使得STAT3能夠根據(jù)細(xì)胞的生理需求，精確地調(diào)控下游基因的表達(dá)。2.1.2STAT3在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的作用機(jī)制在正常生理狀態(tài)下，STAT3主要以單體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，處于非激活狀態(tài)，受到多種負(fù)調(diào)節(jié)因子的嚴(yán)格調(diào)控，包括活化STAT蛋白抑制劑（PIAS）、細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子（SOCS）家族、蛋白酪氨酸磷酸酶（SHP1、SHP2、PTPN1、PTPN2、PTPRD、PTPRT和dusp22）和泛素酶等，這些負(fù)調(diào)節(jié)因子通過(guò)不同的機(jī)制維持STAT3在細(xì)胞質(zhì)中的不活躍狀態(tài)，確保細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的精確性和穩(wěn)定性。當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子（如白介素6（IL-6）、白介素10（IL-10）、白介素21（IL-21）等）、生長(zhǎng)因子（如表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）等）或其他刺激時(shí)，STAT3的信號(hào)傳導(dǎo)通路被激活。以經(jīng)典的IL-6/STAT3信號(hào)通路為例，IL-6首先與膜結(jié)合的IL-6受體α（IL-6R）結(jié)合，形成IL-6/IL-6R復(fù)合物，然后該復(fù)合物再與IL-6受體β（也稱為gp130）結(jié)合，形成IL-6/IL-6R/gp130復(fù)合體。這一復(fù)合體的形成會(huì)激活與之關(guān)聯(lián)的Janus激酶（JAK）家族的酪氨酸激酶，使其發(fā)生磷酸化。激活的JAK激酶會(huì)進(jìn)一步催化STAT3分子中酪氨酸殘基705位點(diǎn)（Tyr705）磷酸化。除了Tyr705位點(diǎn)的磷酸化，STAT3分子中絲氨酸殘基727位點(diǎn)（Ser727）也可以被磷酸化，兩者在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮不同的生物學(xué)功能，Tyr705磷酸化主要介導(dǎo)STAT3的核轉(zhuǎn)錄功能，而Ser727磷酸化主要介導(dǎo)STAT3的線粒體氧化磷酸化功能。磷酸化后的STAT3分子發(fā)生構(gòu)象變化，其SH2結(jié)構(gòu)域能夠與另一個(gè)STAT3分子上磷酸化的Tyr705殘基相互作用，形成同源二聚體。這種二聚化過(guò)程使得STAT3暴露出核定位信號(hào)（NLS）。在核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的協(xié)助下，STAT3二聚體從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核中。進(jìn)入細(xì)胞核后，STAT3二聚體與一些共激活因子（如p68等）形成復(fù)合體，并結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域上的特定DNA序列（如GAS元件等）。通過(guò)與轉(zhuǎn)錄機(jī)器中的各種蛋白質(zhì)相互作用，STAT3招募RNA聚合酶Ⅱ等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而調(diào)控下游基因的表達(dá)。在腫瘤細(xì)胞中，STAT3常常處于持續(xù)激活狀態(tài)，這主要是由于多種致癌因素導(dǎo)致其上游信號(hào)通路的異常激活，如JAK激酶的過(guò)表達(dá)或突變、受體酪氨酸激酶（RTK）的異常激活（如表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）等的過(guò)表達(dá)或突變）以及Src等非受體酪氨酸激酶的異常活化等。持續(xù)激活的STAT3會(huì)導(dǎo)致一系列與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，如抗凋亡基因（如Bcl-xL、Bcl-2、Survivin、Mcl-1等）、細(xì)胞周期調(diào)控基因（如CyclinD1、c-myc等）、血管生成相關(guān)基因（如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等）以及與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因（如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等）。這些基因的異常表達(dá)使得腫瘤細(xì)胞獲得了增殖優(yōu)勢(shì)、抗凋亡能力、血管生成能力和轉(zhuǎn)移潛能，從而促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。STAT3還可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的功能，抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活創(chuàng)造有利條件。2.2STAT3與疾病的關(guān)系2.2.1STAT3異常與癌癥發(fā)生發(fā)展在癌癥領(lǐng)域，大量研究表明，STAT3的異常激活在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演著極為關(guān)鍵的角色，已成為癌癥研究中的熱點(diǎn)和關(guān)鍵靶點(diǎn)。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，STAT3在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中，STAT3常常處于持續(xù)激活狀態(tài)，這與乳腺癌的多種不良生物學(xué)行為密切相關(guān)。持續(xù)激活的STAT3通過(guò)上調(diào)CyclinD1、c-myc等細(xì)胞周期調(diào)控基因的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞周期進(jìn)程加速，導(dǎo)致癌細(xì)胞大量增殖。STAT3還能增強(qiáng)Bcl-xL、Bcl-2、Survivin等抗凋亡蛋白的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的凋亡，使得癌細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的凋亡機(jī)制，從而獲得更強(qiáng)的生存能力。有研究報(bào)道，在雌激素受體（ER）陰性的乳腺癌細(xì)胞系中，抑制STAT3的活性能夠顯著降低細(xì)胞的增殖能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在乳腺癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中，STAT3也發(fā)揮著重要作用，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。胃癌作為消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，STAT3的異常激活同樣是其重要的發(fā)病機(jī)制之一。臨床研究顯示，在胃癌組織中，STAT3的磷酸化水平顯著高于正常胃黏膜組織，且其激活程度與胃癌的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者的預(yù)后密切相關(guān)。異常激活的STAT3通過(guò)調(diào)控一系列與胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移。通過(guò)激活VEGF等血管生成相關(guān)基因的表達(dá)，STAT3可以誘導(dǎo)腫瘤血管生成，為胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供充足的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和血管支持。一項(xiàng)針對(duì)胃癌患者的臨床研究表明，STAT3高表達(dá)的患者5年生存率明顯低于STAT3低表達(dá)的患者，進(jìn)一步證實(shí)了STAT3在胃癌預(yù)后評(píng)估中的重要價(jià)值。胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，其5年生存率極低，STAT3在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在胰腺癌中，STAT3的持續(xù)激活可以通過(guò)多種途徑促進(jìn)癌細(xì)胞的惡性行為。STAT3能夠上調(diào)抗凋亡基因的表達(dá)，抑制胰腺癌細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)其存活能力。還能促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖。研究還發(fā)現(xiàn)，STAT3可以通過(guò)調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。有研究表明，抑制STAT3的活性能夠顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。除了上述幾種癌癥外，在肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、腦瘤等多種癌癥中，均發(fā)現(xiàn)了STAT3的異常激活。在肺癌中，STAT3的持續(xù)激活與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和耐藥性密切相關(guān)，通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、抗凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移能力。在肝癌中，STAT3的異常激活參與了肝癌細(xì)胞的增殖、存活和血管生成等過(guò)程，與肝癌的惡性程度和不良預(yù)后相關(guān)。在結(jié)直腸癌中，STAT3的激活可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、抑制凋亡，并通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在卵巢癌中，STAT3的持續(xù)激活與卵巢癌的化療耐藥性和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中，STAT3的異常激活促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，與腫瘤的惡性程度和患者的預(yù)后不良相關(guān)。在前列腺癌中，STAT3的激活參與了前列腺癌細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移過(guò)程，影響著前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。在惡性黑色素瘤中，STAT3的持續(xù)激活與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸密切相關(guān)，通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的惡性行為。在多發(fā)性骨髓瘤中，STAT3的異常激活促進(jìn)了骨髓瘤細(xì)胞的增殖、存活和耐藥性，與疾病的進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān)。在淋巴瘤中，STAT3的激活參與了淋巴瘤細(xì)胞的增殖、存活和免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程，影響著淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展。在腦瘤中，STAT3的持續(xù)激活與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和血管生成密切相關(guān)，通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腦瘤細(xì)胞的惡性行為。2.2.2STAT3在其他疾病中的作用除了在癌癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用外，STAT3在自身免疫和炎癥疾病中也扮演著重要角色，其異常激活與多種自身免疫和炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RheumatoidArthritis，RA）是一種常見的慢性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)炎癥、腫脹、疼痛和功能障礙為主要特征，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。近年來(lái)的研究表明，STAT3在RA的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。在RA患者的滑膜組織和關(guān)節(jié)液中，均可檢測(cè)到STAT3的高表達(dá)和過(guò)度激活。STAT3的異常激活通過(guò)多種途徑促進(jìn)RA的炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)損傷。它可以調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素17（IL-17）等的表達(dá)，這些促炎細(xì)胞因子進(jìn)一步加劇了炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的增殖、炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和軟骨及骨組織的破壞。研究發(fā)現(xiàn)，在RA患者的滑膜成纖維細(xì)胞中，抑制STAT3的活性能夠顯著降低IL-6、IL-17等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。STAT3還可以通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的降解，加速關(guān)節(jié)損傷的進(jìn)程。有研究報(bào)道，使用STAT3抑制劑處理RA動(dòng)物模型，能夠有效減輕關(guān)節(jié)炎癥和損傷，改善關(guān)節(jié)功能?？肆_恩病（Crohn'sDisease，CD）是一種病因未明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，可累及胃腸道的任何部位，以腹痛、腹瀉、體重下降為主要臨床表現(xiàn)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，STAT3在CD的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在CD患者的腸道黏膜組織中，STAT3的表達(dá)和激活水平明顯升高。異常激活的STAT3通過(guò)調(diào)節(jié)腸道免疫細(xì)胞的功能和炎癥介質(zhì)的表達(dá)，參與CD的炎癥反應(yīng)和組織損傷。它可以促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化和增殖，Th17細(xì)胞分泌的IL-17等細(xì)胞因子能夠招募中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞到腸道黏膜，引發(fā)炎癥反應(yīng)。STAT3還可以調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞的功能，影響腸道屏障的完整性，使得腸道細(xì)菌等抗原物質(zhì)更容易進(jìn)入組織，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。有研究表明，在CD動(dòng)物模型中，抑制STAT3的活性能夠減少Th17細(xì)胞的數(shù)量，降低IL-17等炎癥介質(zhì)的表達(dá)，減輕腸道炎癥和組織損傷。系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SystemicLupusErythematosus，SLE）是一種多系統(tǒng)受累的自身免疫性疾病，可累及皮膚、關(guān)節(jié)、腎臟、血液系統(tǒng)等多個(gè)器官和系統(tǒng)，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳、環(huán)境、免疫等多種因素。STAT3在SLE的發(fā)病過(guò)程中也起著重要作用。在SLE患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞、腎臟組織等中，均可檢測(cè)到STAT3的異常激活。異常激活的STAT3通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能和細(xì)胞因子的表達(dá)，參與SLE的免疫紊亂和組織損傷。它可以促進(jìn)B細(xì)胞的活化和增殖，導(dǎo)致自身抗體的產(chǎn)生增加。還能調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化和功能，影響Th1/Th2細(xì)胞平衡，使得Th17細(xì)胞增多，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）減少，從而加劇免疫炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，在SLE動(dòng)物模型中，抑制STAT3的活性能夠減少自身抗體的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，減輕腎臟等器官的損傷。此外，STAT3在其他自身免疫和炎癥疾病如多發(fā)性硬化癥、干燥綜合征、銀屑病等中也發(fā)揮著重要作用。在多發(fā)性硬化癥中，STAT3的異常激活參與了神經(jīng)炎癥和脫髓鞘過(guò)程，影響疾病的進(jìn)展。在干燥綜合征中，STAT3的激活調(diào)節(jié)了唾液腺和淚腺等外分泌腺的炎癥反應(yīng)和組織損傷。在銀屑病中，STAT3的異常激活促進(jìn)了角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，與銀屑病的發(fā)病密切相關(guān)。2.3STAT3小分子抑制劑研究現(xiàn)狀目前，科研人員已報(bào)道了多種類型的STAT3小分子抑制劑，這些抑制劑在結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、作用機(jī)制以及臨床研究進(jìn)展等方面呈現(xiàn)出多樣化的特征，同時(shí)也各自存在一定的優(yōu)勢(shì)與不足。從結(jié)構(gòu)類型來(lái)看，STAT3小分子抑制劑涵蓋了黃酮類、苯并噻唑類、吡唑類、喹啉類等多種結(jié)構(gòu)。黃酮類化合物如芹菜素、木犀草素等，具有多個(gè)酚羥基和不飽和酮結(jié)構(gòu)，能夠與STAT3的關(guān)鍵氨基酸殘基形成氫鍵、π-π堆積等相互作用。苯并噻唑類抑制劑通過(guò)苯并噻唑環(huán)與STAT3的活性位點(diǎn)結(jié)合，其環(huán)上的取代基可以調(diào)節(jié)與靶點(diǎn)的親和力和選擇性。吡唑類和喹啉類抑制劑也通過(guò)各自獨(dú)特的環(huán)結(jié)構(gòu)和取代基與STAT3相互作用，影響其活性。作用機(jī)制方面，STAT3小分子抑制劑主要通過(guò)以下幾種方式發(fā)揮作用。一部分抑制劑作用于STAT3的SH2結(jié)構(gòu)域，阻止其與磷酸化的酪氨酸殘基結(jié)合，從而抑制STAT3的二聚化。例如，一些含有特定基團(tuán)的小分子能夠與SH2結(jié)構(gòu)域中的關(guān)鍵氨基酸殘基形成緊密的相互作用，占據(jù)其結(jié)合位點(diǎn)，阻斷STAT3的二聚化過(guò)程，進(jìn)而抑制其信號(hào)傳導(dǎo)。還有些抑制劑可以抑制STAT3的磷酸化，阻斷其激活過(guò)程。它們通過(guò)與STAT3上游的激酶相互作用，或者直接作用于STAT3的磷酸化位點(diǎn)，阻止酪氨酸殘基的磷酸化，使STAT3無(wú)法被激活，從而抑制其下游信號(hào)通路的傳導(dǎo)。另外，部分抑制劑能夠干擾STAT3與DNA的結(jié)合，影響其對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。這些抑制劑通過(guò)與STAT3的DNA結(jié)合域相互作用，改變其構(gòu)象，降低STAT3與DNA的親和力，阻止其與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，從而抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在臨床前和臨床試驗(yàn)中，一些STAT3小分子抑制劑已展現(xiàn)出一定的潛力。在臨床前研究中，許多抑制劑在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型中表現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，能夠有效降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。一些抑制劑在乳腺癌、肺癌、胃癌等多種腫瘤細(xì)胞系和動(dòng)物模型中，顯著抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，降低了腫瘤的體積和重量。然而，進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段的STAT3小分子抑制劑相對(duì)較少，且面臨著諸多挑戰(zhàn)。部分抑制劑在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出的療效有限，無(wú)法達(dá)到預(yù)期的治療效果。一些抑制劑在臨床試驗(yàn)中對(duì)腫瘤患者的病情緩解作用不明顯，腫瘤的縮小程度和患者的生存率改善有限。還有一些抑制劑存在著嚴(yán)重的副作用，限制了其臨床應(yīng)用。例如，某些抑制劑可能會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)肝功能異常、血液系統(tǒng)毒性等不良反應(yīng)，影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性?，F(xiàn)有STAT3小分子抑制劑存在一些不足之處。在選擇性方面，許多抑制劑難以在STAT家族蛋白中高效選擇性抑制STAT3。由于STAT家族成員在結(jié)構(gòu)和功能上存在一定的相似性，部分抑制劑在抑制STAT3的同時(shí)，可能會(huì)對(duì)其他STAT蛋白產(chǎn)生影響，從而引發(fā)一系列不必要的副作用。抑制劑的活性也有待提高，多數(shù)STAT3小分子抑制劑的抑制活性處于微摩爾水平，這極大地限制了它們?cè)谂R床上的應(yīng)用效果。較低的抑制活性需要使用較高劑量的藥物才能達(dá)到治療效果，這不僅增加了藥物的成本和患者的負(fù)擔(dān)，還可能導(dǎo)致更嚴(yán)重的副作用。部分抑制劑的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)不佳，如生物利用度低、半衰期短等，影響了其在體內(nèi)的療效。這些抑制劑在體內(nèi)難以維持有效的藥物濃度，無(wú)法持續(xù)發(fā)揮抑制作用，從而降低了治療效果。三、基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選方法3.1虛擬篩選的原理與流程3.1.1虛擬篩選概述虛擬篩選（VirtualScreening，VS）作為藥物研發(fā)領(lǐng)域的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，在加速藥物發(fā)現(xiàn)進(jìn)程中發(fā)揮著不可替代的重要作用。它是一種基于計(jì)算機(jī)模擬和算法的藥物設(shè)計(jì)方法，旨在從海量的化合物庫(kù)中快速、高效地識(shí)別出具有潛在生物活性的候選藥物分子。在傳統(tǒng)的藥物研發(fā)模式中，研究人員需要通過(guò)大量繁瑣且昂貴的實(shí)驗(yàn)來(lái)篩選潛在的藥物分子，這不僅耗費(fèi)大量的時(shí)間和資源，而且成功率較低。虛擬篩選技術(shù)的出現(xiàn)，為藥物研發(fā)帶來(lái)了革命性的變革，它能夠在計(jì)算機(jī)上對(duì)化合物庫(kù)進(jìn)行快速篩選，大大縮短了藥物研發(fā)的周期，降低了研發(fā)成本，提高了藥物研發(fā)的效率和成功率。虛擬篩選技術(shù)主要基于計(jì)算機(jī)模擬、生物信息學(xué)、機(jī)器學(xué)習(xí)等多學(xué)科交叉的方法，通過(guò)構(gòu)建合理的模型和算法，對(duì)化合物與生物大分子（如蛋白質(zhì)、核酸等）之間的相互作用進(jìn)行模擬和預(yù)測(cè)。在虛擬篩選過(guò)程中，首先需要獲取化合物庫(kù)和生物大分子的相關(guān)信息，包括化合物的結(jié)構(gòu)信息（如二維結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)等）、生物大分子的三維結(jié)構(gòu)信息（通常通過(guò)X射線晶體學(xué)、核磁共振波譜、冷凍電子顯微鏡等實(shí)驗(yàn)技術(shù)獲得，也可通過(guò)同源建模等計(jì)算方法預(yù)測(cè)）。然后，利用分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬、藥效團(tuán)模型、定量構(gòu)效關(guān)系（QSAR）、機(jī)器學(xué)習(xí)等技術(shù)，對(duì)化合物與生物大分子之間的結(jié)合模式、結(jié)合親和力、生物活性等進(jìn)行預(yù)測(cè)和評(píng)估。通過(guò)對(duì)大量化合物的虛擬篩選，可以快速篩選出與目標(biāo)生物大分子具有較強(qiáng)結(jié)合能力和潛在生物活性的化合物，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供有價(jià)值的先導(dǎo)化合物。虛擬篩選技術(shù)在藥物研發(fā)的各個(gè)階段都有著廣泛的應(yīng)用。在藥物發(fā)現(xiàn)階段，它可以幫助研究人員從海量的化合物庫(kù)中快速篩選出具有潛在生物活性的化合物，大大縮小了實(shí)驗(yàn)篩選的范圍，提高了發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的效率。在藥物設(shè)計(jì)階段，虛擬篩選可以用于優(yōu)化先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)，提高其活性、選擇性和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。通過(guò)對(duì)先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和虛擬篩選，可以預(yù)測(cè)不同修飾后的化合物與生物大分子的相互作用情況，從而指導(dǎo)先導(dǎo)化合物的優(yōu)化設(shè)計(jì)。虛擬篩選還可以用于藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證，通過(guò)對(duì)化合物與不同生物大分子的相互作用進(jìn)行模擬和分析，可以發(fā)現(xiàn)潛在的藥物靶點(diǎn)，并驗(yàn)證其與疾病的相關(guān)性。3.1.2基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選流程基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選（Structure-BasedVirtualScreening，SBVS）以生物大分子的三維結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)，研究小分子化合物與生物大分子之間的相互作用，預(yù)測(cè)小分子在生物大分子活性位點(diǎn)的結(jié)合模式和結(jié)合親和力，從而從大量化合物庫(kù)中篩選出具有潛在活性的小分子化合物。其流程主要包括以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟：收集小分子化合物庫(kù)：小分子化合物庫(kù)是虛擬篩選的基礎(chǔ)，其來(lái)源廣泛，包括商業(yè)化合物庫(kù)（如ZINC、ChemDiv、Enamine等）、天然產(chǎn)物庫(kù)、自建化合物庫(kù)等。商業(yè)化合物庫(kù)通常包含數(shù)百萬(wàn)種化合物，具有結(jié)構(gòu)多樣性和類藥性等特點(diǎn)；天然產(chǎn)物庫(kù)則來(lái)源于植物、微生物、海洋生物等，其結(jié)構(gòu)獨(dú)特，具有豐富的生物活性；自建化合物庫(kù)可以根據(jù)研究需求，通過(guò)化學(xué)合成、組合化學(xué)等方法構(gòu)建。在收集化合物庫(kù)時(shí)，需要考慮化合物的結(jié)構(gòu)多樣性、類藥性、可合成性等因素，以提高虛擬篩選的命中率。例如，在篩選STAT3小分子抑制劑時(shí)，選擇的化合物庫(kù)應(yīng)包含多種不同結(jié)構(gòu)類型的化合物，如黃酮類、苯并噻唑類、吡唑類、喹啉類等，以增加發(fā)現(xiàn)新型抑制劑的可能性?；衔镄再|(zhì)規(guī)范化處理：收集到的小分子化合物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)存在差異，需要進(jìn)行規(guī)范化處理，以保證虛擬篩選的準(zhǔn)確性和可靠性。這一步驟主要包括結(jié)構(gòu)優(yōu)化、加氫、電荷計(jì)算、立體化學(xué)處理等。利用量子力學(xué)方法（如Gaussian、ORCA等軟件）對(duì)小分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，使其處于能量最低的穩(wěn)定構(gòu)象。為小分子添加氫原子，確保原子的價(jià)態(tài)滿足化學(xué)規(guī)則。計(jì)算小分子的電荷分布，常用的方法有Mulliken電荷分析、自然鍵軌道（NBO）分析等。對(duì)于含有手性中心的小分子，需要正確處理其立體化學(xué)信息，以保證與生物大分子相互作用的準(zhǔn)確性。通過(guò)這些規(guī)范化處理，可以使小分子化合物具有統(tǒng)一的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)描述，便于后續(xù)的分子對(duì)接和活性預(yù)測(cè)。分子對(duì)接預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)和模式：分子對(duì)接是基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選的核心步驟，其目的是預(yù)測(cè)小分子化合物在生物大分子活性位點(diǎn)的結(jié)合模式和結(jié)合親和力。常用的分子對(duì)接軟件有AutoDock、AutoDockVina、Glide、GOLD等。在進(jìn)行分子對(duì)接之前，需要準(zhǔn)備好生物大分子的三維結(jié)構(gòu)和小分子化合物的結(jié)構(gòu)文件。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB）等數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取高質(zhì)量的STAT3三維結(jié)構(gòu)，并對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，如去除水分子、添加氫原子、優(yōu)化結(jié)構(gòu)等。將小分子化合物庫(kù)中的化合物逐一與STAT3的活性位點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接模擬。在對(duì)接過(guò)程中，軟件會(huì)根據(jù)分子間的幾何匹配和能量互補(bǔ)原理，搜索小分子在活性位點(diǎn)的最佳結(jié)合構(gòu)象，并計(jì)算其結(jié)合親和力。結(jié)合親和力通常用自由能變化（ΔG）或?qū)哟蚍趾瘮?shù)來(lái)表示，得分越高（或ΔG越小），表示小分子與生物大分子的結(jié)合能力越強(qiáng)。通過(guò)分子對(duì)接，可以初步篩選出與STAT3具有較高結(jié)合親和力和合理結(jié)合模式的小分子化合物，構(gòu)建初步的候選化合物集。藥物分子動(dòng)力學(xué)模擬篩選：雖然分子對(duì)接能夠快速預(yù)測(cè)小分子與生物大分子的結(jié)合模式和親和力，但由于對(duì)接過(guò)程中對(duì)體系進(jìn)行了一定程度的簡(jiǎn)化，其結(jié)果存在一定的局限性。因此，需要進(jìn)一步采用分子動(dòng)力學(xué)模擬對(duì)初步篩選出的候選化合物進(jìn)行深入分析。常用的分子動(dòng)力學(xué)模擬軟件有GROMACS、AMBER、NAMD等。在進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬時(shí)，首先要構(gòu)建模擬體系，將候選化合物與STAT3形成的復(fù)合物置于合適的溶劑模型（如水分子）中，并添加離子以維持體系的電中性。對(duì)模擬體系進(jìn)行能量最小化處理，消除原子間的不合理相互作用。設(shè)置模擬參數(shù)，如溫度、壓強(qiáng)、時(shí)間步長(zhǎng)等，通常模擬時(shí)間為100ns-1μs甚至更長(zhǎng)。在模擬過(guò)程中，軟件會(huì)根據(jù)牛頓運(yùn)動(dòng)定律，計(jì)算體系中每個(gè)原子的運(yùn)動(dòng)軌跡，從而模擬復(fù)合物在溶液環(huán)境中的動(dòng)態(tài)行為。通過(guò)分析模擬軌跡，可以計(jì)算復(fù)合物的均方根偏差（RMSD）、均方根漲落（RMSF）、相互作用能等參數(shù)，評(píng)估復(fù)合物在動(dòng)態(tài)過(guò)程中的穩(wěn)定性。RMSD反映了復(fù)合物整體結(jié)構(gòu)的變化程度，RMSF則體現(xiàn)了各個(gè)原子或殘基的運(yùn)動(dòng)靈活性。相互作用能包括氫鍵相互作用能、靜電相互作用能、范德華相互作用能等，通過(guò)分析這些能量項(xiàng)，可以了解化合物與STAT3之間的相互作用細(xì)節(jié)。根據(jù)分子動(dòng)力學(xué)模擬的結(jié)果，進(jìn)一步篩選出在動(dòng)力學(xué)模擬中表現(xiàn)穩(wěn)定、與STAT3相互作用較強(qiáng)的小分子化合物，確定最終的虛擬篩選結(jié)果。3.2分子對(duì)接技術(shù)3.2.1分子對(duì)接原理分子對(duì)接技術(shù)是基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選的核心技術(shù)之一，其原理基于分子間的相互作用理論，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬，將小分子化合物（配體）放置于大分子靶標(biāo)（受體）的結(jié)合區(qū)域，預(yù)測(cè)兩者的結(jié)合力（結(jié)合親和性）和結(jié)合方式（構(gòu)象），進(jìn)而找到配體與受體在其活性區(qū)域相結(jié)合時(shí)能量最低構(gòu)象。在分子對(duì)接過(guò)程中，小分子與大分子之間的相互作用起著決定性作用，主要包括靜電相互作用、氫鍵、疏水作用、范德華相互作用等。靜電相互作用是由于分子中原子的電荷分布不均勻而產(chǎn)生的，帶相反電荷的原子或基團(tuán)之間會(huì)產(chǎn)生靜電吸引力，這種相互作用對(duì)分子間的結(jié)合起著重要的驅(qū)動(dòng)作用。在STAT3與小分子抑制劑的相互作用中，STAT3活性位點(diǎn)的一些帶正電荷的氨基酸殘基（如賴氨酸、精氨酸等）可能與小分子抑制劑上帶負(fù)電荷的基團(tuán)（如羧基、磷酸基等）通過(guò)靜電相互作用結(jié)合，從而增強(qiáng)兩者之間的結(jié)合力。氫鍵是一種特殊的分子間相互作用，它是由氫原子與電負(fù)性較大的原子（如氮、氧、氟等）形成的。在分子對(duì)接中，氫鍵的形成能夠顯著影響小分子與大分子的結(jié)合模式和結(jié)合穩(wěn)定性。當(dāng)小分子抑制劑與STAT3結(jié)合時(shí)，小分子上的羥基、氨基等基團(tuán)可能與STAT3活性位點(diǎn)的氨基酸殘基（如絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸等）形成氫鍵，這些氫鍵的存在能夠穩(wěn)定小分子與STAT3的結(jié)合構(gòu)象，增強(qiáng)兩者之間的親和力。疏水作用是指非極性分子或分子的非極性部分在水溶液中相互聚集的傾向，它是驅(qū)動(dòng)小分子與大分子結(jié)合的重要力量之一。在STAT3的活性位點(diǎn)，存在一些疏水氨基酸殘基（如苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸等），小分子抑制劑的疏水基團(tuán)（如烷基、芳香環(huán)等）能夠與這些疏水氨基酸殘基相互作用，形成疏水口袋，從而增強(qiáng)小分子與STAT3的結(jié)合力。疏水作用還可以影響小分子在活性位點(diǎn)的取向和構(gòu)象，使其能夠更好地與其他相互作用協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)STAT3活性的有效抑制。范德華相互作用是分子間普遍存在的一種弱相互作用，包括色散力、誘導(dǎo)力和取向力。它對(duì)分子間的結(jié)合起著微調(diào)作用，雖然單個(gè)范德華相互作用的能量較小，但在分子對(duì)接中，眾多范德華相互作用的累積效應(yīng)能夠?qū)π》肿优c大分子的結(jié)合穩(wěn)定性產(chǎn)生重要影響。在小分子與STAT3的結(jié)合過(guò)程中，小分子與STAT3活性位點(diǎn)的原子之間會(huì)產(chǎn)生范德華相互作用，這些相互作用能夠使小分子在活性位點(diǎn)上找到最合適的結(jié)合位置，優(yōu)化結(jié)合構(gòu)象，進(jìn)一步提高結(jié)合的穩(wěn)定性。為了預(yù)測(cè)小分子與STAT3的結(jié)合模式，分子對(duì)接算法通常采用以下步驟：首先，確定小分子和STAT3的三維結(jié)構(gòu)，小分子的結(jié)構(gòu)可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定（如X射線晶體學(xué)、核磁共振波譜等）或從數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取，STAT3的三維結(jié)構(gòu)則可以從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB）中下載，對(duì)于一些沒有實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)的情況，還可以通過(guò)同源建模等方法預(yù)測(cè)。其次，定義對(duì)接區(qū)域，即確定STAT3上與小分子結(jié)合的活性位點(diǎn)，可以根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)或基于結(jié)構(gòu)的分析來(lái)確定活性位點(diǎn)的位置和范圍。然后，采用合適的搜索算法，在對(duì)接區(qū)域內(nèi)搜索小分子的最佳結(jié)合構(gòu)象。常用的搜索算法包括遺傳算法、模擬退火算法、蒙特卡羅算法等。這些算法通過(guò)不斷調(diào)整小分子的位置、取向和構(gòu)象，尋找能夠使小分子與STAT3之間的相互作用能量最低的結(jié)合模式。在搜索過(guò)程中，還需要使用打分函數(shù)來(lái)評(píng)估每個(gè)結(jié)合構(gòu)象的優(yōu)劣，打分函數(shù)通?；诜肿娱g的相互作用能量、幾何匹配程度等因素，對(duì)每個(gè)結(jié)合構(gòu)象進(jìn)行量化評(píng)分，得分越高表示結(jié)合構(gòu)象越優(yōu)。最后，根據(jù)打分函數(shù)的結(jié)果，選擇得分最高的結(jié)合構(gòu)象作為預(yù)測(cè)的結(jié)合模式，并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的分析和驗(yàn)證。3.2.2分子對(duì)接軟件及參數(shù)設(shè)置在分子對(duì)接研究中，有多種分子對(duì)接軟件可供選擇，每種軟件都具有其獨(dú)特的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，研究人員需要根據(jù)具體的研究需求和體系特點(diǎn)來(lái)選擇合適的軟件。AutoDock是一款經(jīng)典的開源分子對(duì)接軟件，在生物信息學(xué)和藥物設(shè)計(jì)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。它采用基于能量的方法對(duì)小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合進(jìn)行模擬，能夠自動(dòng)搜索配體在蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的結(jié)合位點(diǎn)，并給出結(jié)合能力評(píng)分。AutoDock使用Lamarckian遺傳算法（LGA）進(jìn)行構(gòu)象搜索，這種算法結(jié)合了遺傳算法和局部搜索算法的優(yōu)點(diǎn)，能夠在較大的構(gòu)象空間中高效地搜索到小分子的最佳結(jié)合構(gòu)象。它還提供了多種打分函數(shù)，如經(jīng)驗(yàn)性打分函數(shù)、基于自由能的打分函數(shù)等，用于評(píng)估小分子與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合親和力。在使用AutoDock進(jìn)行分子對(duì)接時(shí)，需要設(shè)置一些關(guān)鍵參數(shù)，如對(duì)接盒子的大小和位置，對(duì)接盒子的中心通常設(shè)置在蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)的中心，大小則根據(jù)活性位點(diǎn)的范圍進(jìn)行調(diào)整；遺傳算法的參數(shù)，包括種群大小、最大代數(shù)、交叉率、變異率等，這些參數(shù)的設(shè)置會(huì)影響搜索的效率和準(zhǔn)確性；打分函數(shù)的選擇，不同的打分函數(shù)適用于不同的體系，需要根據(jù)具體情況進(jìn)行選擇。AutoDockVina是AutoDock的改進(jìn)版本，采用了一種更快速和準(zhǔn)確的對(duì)接算法，在效率和精確度方面都有顯著提升，適用于高通量虛擬篩選和藥物設(shè)計(jì)研究。它使用一種基于梯度的優(yōu)化算法來(lái)搜索小分子的最佳結(jié)合構(gòu)象，這種算法能夠更快地收斂到全局最優(yōu)解。AutoDockVina還引入了一種新的打分函數(shù)，該打分函數(shù)在預(yù)測(cè)小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力方面表現(xiàn)出更好的性能。在參數(shù)設(shè)置方面，AutoDockVina相對(duì)較為簡(jiǎn)單，用戶只需要設(shè)置對(duì)接盒子的大小和位置、搜索的詳盡程度等少數(shù)幾個(gè)參數(shù)即可。搜索的詳盡程度參數(shù)決定了算法搜索構(gòu)象空間的細(xì)致程度，較高的詳盡程度會(huì)增加計(jì)算時(shí)間，但可能會(huì)得到更準(zhǔn)確的結(jié)果。Glide是由Schr?dinger公司開發(fā)的一款商業(yè)化分子對(duì)接軟件，采用準(zhǔn)確的高通量虛擬篩選技術(shù)，可用于預(yù)測(cè)配體與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合模式，并為藥物設(shè)計(jì)提供重要信息。Glide在對(duì)接過(guò)程中考慮了蛋白質(zhì)和配體的柔性，能夠更準(zhǔn)確地模擬分子間的相互作用。它提供了多種對(duì)接模式，如標(biāo)準(zhǔn)精度（SP）對(duì)接、高精度（XP）對(duì)接等，用戶可以根據(jù)需要選擇不同的對(duì)接模式。SP對(duì)接模式適用于大規(guī)模的虛擬篩選，能夠快速篩選出潛在的活性化合物；XP對(duì)接模式則適用于對(duì)結(jié)合模式和親和力要求較高的研究，能夠提供更精確的結(jié)果。Glide還具有強(qiáng)大的可視化和分析功能，方便用戶對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行直觀的觀察和深入的分析。在參數(shù)設(shè)置方面，Glide的對(duì)接模式和精度參數(shù)是需要重點(diǎn)關(guān)注的，不同的對(duì)接模式和精度會(huì)影響計(jì)算時(shí)間和結(jié)果的準(zhǔn)確性。GOLD（GeneticOptimizationforLigandDocking）是另一款流行的分子對(duì)接軟件，它采用遺傳算法對(duì)配體的構(gòu)象進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)評(píng)分函數(shù)尋找最佳的配體-靶點(diǎn)結(jié)合模式。GOLD在藥物發(fā)現(xiàn)和材料科學(xué)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用，其遺傳算法能夠在復(fù)雜的構(gòu)象空間中搜索到全局最優(yōu)解，從而找到小分子與蛋白質(zhì)的最佳結(jié)合模式。GOLD提供了多種評(píng)分函數(shù)，用戶可以根據(jù)具體的研究體系選擇合適的評(píng)分函數(shù)。在使用GOLD進(jìn)行分子對(duì)接時(shí)，需要設(shè)置遺傳算法的相關(guān)參數(shù)，如種群大小、遺傳代數(shù)、選擇策略、交叉率和變異率等，這些參數(shù)的優(yōu)化對(duì)于獲得準(zhǔn)確的對(duì)接結(jié)果至關(guān)重要。還需要設(shè)置對(duì)接盒子的參數(shù)，包括盒子的大小、位置和形狀等。本研究選擇AutoDockVina進(jìn)行分子對(duì)接，主要是考慮到其在速度和準(zhǔn)確性之間能夠取得較好的平衡，適用于對(duì)大規(guī)模小分子化合物庫(kù)的虛擬篩選。在參數(shù)設(shè)置方面，對(duì)接盒子的中心設(shè)置在STAT3活性位點(diǎn)的中心，通過(guò)對(duì)STAT3晶體結(jié)構(gòu)的分析和文獻(xiàn)調(diào)研確定活性位點(diǎn)的中心坐標(biāo)。對(duì)接盒子的大小設(shè)置為在X、Y、Z三個(gè)方向上分別比活性位點(diǎn)的范圍大4?，以確保能夠覆蓋小分子在活性位點(diǎn)的所有可能結(jié)合位置。搜索的詳盡程度設(shè)置為8，這是一個(gè)相對(duì)平衡的設(shè)置，既能保證在合理的時(shí)間內(nèi)完成對(duì)大量小分子的對(duì)接計(jì)算，又能獲得較為準(zhǔn)確的對(duì)接結(jié)果。對(duì)于其他參數(shù)，采用AutoDockVina的默認(rèn)設(shè)置，以保證對(duì)接過(guò)程的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。3.3藥物分子動(dòng)力學(xué)模擬3.3.1分子動(dòng)力學(xué)模擬原理分子動(dòng)力學(xué)模擬是一種基于牛頓運(yùn)動(dòng)定律的計(jì)算方法，通過(guò)計(jì)算機(jī)仿真不斷迭代模擬大量原子或分子在不同時(shí)刻下的運(yùn)動(dòng)軌跡和相互作用過(guò)程。在分子動(dòng)力學(xué)模擬中，將研究體系中的分子或原子視為質(zhì)點(diǎn)，根據(jù)牛頓第二定律F=ma（其中F是作用在原子上的力，m是原子的質(zhì)量，a是原子的加速度），計(jì)算每個(gè)原子在力的作用下的加速度。體系中原子間的相互作用力主要通過(guò)分子力場(chǎng)來(lái)描述，分子力場(chǎng)是一種數(shù)學(xué)模型，用于描述分子內(nèi)部和分子間的相互作用，包括成鍵相互作用（如共價(jià)鍵伸縮、鍵角彎曲、二面角扭轉(zhuǎn)等）和非鍵相互作用（如靜電相互作用、范德華相互作用等）。通過(guò)對(duì)分子力場(chǎng)的計(jì)算，可以得到體系的勢(shì)能，進(jìn)而根據(jù)勢(shì)能對(duì)原子位置的導(dǎo)數(shù)計(jì)算出作用在每個(gè)原子上的力。在模擬過(guò)程中，首先給定體系中原子的初始位置和速度，然后根據(jù)分子力場(chǎng)計(jì)算原子間的相互作用力，進(jìn)而計(jì)算每個(gè)原子的加速度。利用數(shù)值積分算法（如Verlet算法、leap-frog算法、Beeman算法等），根據(jù)原子的加速度和初始速度，計(jì)算在一個(gè)很小的時(shí)間步長(zhǎng)（通常為1-2fs）內(nèi)原子的位移和新的速度。不斷重復(fù)這個(gè)過(guò)程，就可以得到體系中原子隨時(shí)間變化的運(yùn)動(dòng)軌跡。通過(guò)對(duì)模擬軌跡的分析，可以獲取體系的各種動(dòng)態(tài)和靜態(tài)性質(zhì)，如分子的構(gòu)象變化、擴(kuò)散系數(shù)、密度分布、相互作用能等。在藥物研發(fā)中，分子動(dòng)力學(xué)模擬主要用于研究藥物分子與生物大分子（如蛋白質(zhì)、核酸等）之間的相互作用動(dòng)態(tài)過(guò)程。以研究STAT3小分子抑制劑為例，通過(guò)將小分子抑制劑與STAT3蛋白置于模擬體系中，模擬它們?cè)谌芤涵h(huán)境中的相互作用。在模擬過(guò)程中，可以觀察小分子抑制劑與STAT3蛋白結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合模式是否穩(wěn)定，小分子與蛋白之間的氫鍵、疏水相互作用等隨時(shí)間的變化情況。通過(guò)分析模擬軌跡，可以計(jì)算小分子與STAT3之間的相互作用能，評(píng)估小分子與蛋白結(jié)合的穩(wěn)定性。還可以觀察小分子抑制劑的存在對(duì)STAT3蛋白構(gòu)象的影響，了解小分子抑制劑對(duì)STAT3活性的影響機(jī)制。分子動(dòng)力學(xué)模擬能夠提供分子水平上的動(dòng)態(tài)信息，為深入理解藥物分子的作用機(jī)制和優(yōu)化藥物設(shè)計(jì)提供重要依據(jù)。3.3.2模擬過(guò)程與數(shù)據(jù)分析模擬過(guò)程：在進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬時(shí)，首先需要構(gòu)建模擬體系。將虛擬篩選得到的小分子抑制劑與STAT3蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行整合，將其置于合適的溶劑模型（如TIP3P水分子模型）中，以模擬真實(shí)的溶液環(huán)境。添加適量的離子（如Na?、Cl?等），以維持體系的電中性。利用GROMACS軟件進(jìn)行模擬，首先對(duì)構(gòu)建好的體系進(jìn)行能量最小化處理，采用最陡下降法或共軛梯度法等算法，消除體系中原子間的不合理相互作用，使體系達(dá)到能量較低的穩(wěn)定狀態(tài)。對(duì)能量最小化后的體系進(jìn)行平衡模擬，分為NVT（正則系綜，粒子數(shù)、體積和溫度恒定）和NPT（等溫等壓系綜，粒子數(shù)、壓強(qiáng)和溫度恒定）兩個(gè)階段。在NVT階段，通過(guò)與恒溫浴耦合（如采用Velocity-rescaling方法），將體系溫度逐漸升高到設(shè)定值（如310K，模擬生理溫度），并保持溫度恒定，模擬時(shí)間通常設(shè)置為100-500ps。在NPT階段，通過(guò)與恒溫浴和恒壓浴耦合（如采用Parrinello-Rahman方法調(diào)節(jié)壓強(qiáng)），在保持溫度恒定的同時(shí)，使體系壓強(qiáng)達(dá)到設(shè)定值（如1bar），模擬時(shí)間一般為100-500ps。經(jīng)過(guò)平衡模擬后，體系達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，此時(shí)進(jìn)行生產(chǎn)模擬，模擬時(shí)間通常設(shè)置為100ns-1μs甚至更長(zhǎng)，以獲取足夠長(zhǎng)的模擬軌跡用于后續(xù)分析。在生產(chǎn)模擬過(guò)程中，每隔一定時(shí)間步長(zhǎng)（如10ps）保存一次體系的坐標(biāo)和速度信息，生成模擬軌跡文件。數(shù)據(jù)分析：對(duì)模擬軌跡進(jìn)行分析是分子動(dòng)力學(xué)模擬的重要環(huán)節(jié)。計(jì)算小分子抑制劑與STAT3蛋白復(fù)合物的均方根偏差（Root-Mean-SquareDeviation，RMSD），以評(píng)估復(fù)合物整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。RMSD是指模擬過(guò)程中某一時(shí)刻體系中原子坐標(biāo)與參考結(jié)構(gòu)（通常為初始結(jié)構(gòu)或能量最小化后的結(jié)構(gòu)）中對(duì)應(yīng)原子坐標(biāo)的均方根偏差。RMSD值越小，說(shuō)明復(fù)合物結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。利用GROMACS軟件的g_rms命令計(jì)算RMSD，公式為：RMSD=\sqrt{\frac{1}{N}\sum_{i=1}^{N}(r_{i}(t)-r_{i}(0))^{2}}，其中N為原子數(shù)，r_{i}(t)和r_{i}(0)分別為第i個(gè)原子在t時(shí)刻和初始時(shí)刻的坐標(biāo)。計(jì)算均方根漲落（Root-Mean-SquareFluctuation，RMSF），用于分析復(fù)合物中各個(gè)原子或殘基的運(yùn)動(dòng)靈活性。RMSF反映了原子或殘基相對(duì)于其平均位置的波動(dòng)程度，RMSF值越大，說(shuō)明原子或殘基的運(yùn)動(dòng)越靈活。使用GROMACS軟件的g_rmsf命令計(jì)算RMSF，公式為：RMSF=\sqrt{\frac{1}{T}\sum_{t=1}^{T}(r_{i}(t)-\overline{r_{i}})^{2}}，其中T為模擬幀數(shù)，\overline{r_{i}}為第i個(gè)原子的平均坐標(biāo)。分析小分子抑制劑與STAT3蛋白之間的相互作用能，包括氫鍵相互作用能、靜電相互作用能、范德華相互作用能等。利用GROMACS軟件的g_mmpbsa工具計(jì)算相互作用能，通過(guò)對(duì)模擬軌跡的分析，統(tǒng)計(jì)小分子與蛋白之間形成的氫鍵數(shù)量和類型，以及它們?cè)谀M過(guò)程中的穩(wěn)定性。分析靜電相互作用能和范德華相互作用能的變化情況，了解小分子與蛋白之間相互作用的主要驅(qū)動(dòng)力。通過(guò)可視化工具（如VMD、PyMOL等）對(duì)模擬軌跡進(jìn)行可視化分析，直觀地觀察小分子抑制劑在STAT3蛋白結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合模式和構(gòu)象變化，以及小分子與蛋白之間的相互作用細(xì)節(jié)，進(jìn)一步深入理解小分子抑制劑與STAT3的作用機(jī)制。四、虛擬篩選實(shí)例分析4.1案例研究設(shè)計(jì)本案例研究旨在通過(guò)基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選方法，從大規(guī)模小分子化合物庫(kù)中尋找能夠有效抑制STAT3活性的小分子抑制劑，并對(duì)篩選出的化合物進(jìn)行初步活性篩選，為后續(xù)的藥物研發(fā)提供有價(jià)值的先導(dǎo)化合物。在小分子化合物庫(kù)的選擇上，本研究使用了ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)中的類藥小分子化合物庫(kù)。ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)廣泛應(yīng)用的開源化合物數(shù)據(jù)庫(kù)，包含了超過(guò)1億個(gè)化合物，具有豐富的結(jié)構(gòu)多樣性和類藥性。選擇ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)的類藥小分子化合物庫(kù)，主要是考慮到其化合物來(lái)源廣泛，結(jié)構(gòu)類型豐富，能夠涵蓋多種可能與STAT3結(jié)合的化學(xué)結(jié)構(gòu)，為虛擬篩選提供充足的化合物資源。該庫(kù)中的化合物經(jīng)過(guò)了一定的篩選和預(yù)處理，具有較好的類藥性，能夠提高篩選出具有潛在活性小分子的概率。該化合物庫(kù)包含了約500萬(wàn)個(gè)小分子化合物，這些化合物的結(jié)構(gòu)類型多樣，包括芳香族化合物、脂肪族化合物、雜環(huán)化合物等，涵蓋了多種可能與STAT3結(jié)合的化學(xué)結(jié)構(gòu)，為虛擬篩選提供了豐富的化合物來(lái)源。對(duì)于STAT3蛋白結(jié)構(gòu)的選擇，本研究從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB）中獲取了編號(hào)為6M7O的STAT3蛋白晶體結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)是通過(guò)X射線晶體學(xué)技術(shù)解析得到的，分辨率為2.5?，能夠清晰地展示STAT3蛋白的三維結(jié)構(gòu)信息。選擇該結(jié)構(gòu)的原因主要有以下幾點(diǎn)：首先，其分辨率較高，能夠提供更準(zhǔn)確的原子坐標(biāo)和結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，有助于提高分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬的準(zhǔn)確性。高分辨率的結(jié)構(gòu)可以更精確地描述STAT3蛋白活性位點(diǎn)的幾何形狀和電荷分布，使得小分子化合物在對(duì)接過(guò)程中能夠更準(zhǔn)確地找到最佳結(jié)合位置。該結(jié)構(gòu)是與小分子配體結(jié)合的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，能夠直觀地展示小分子與STAT3蛋白的結(jié)合模式和相互作用位點(diǎn)。通過(guò)分析該復(fù)合物結(jié)構(gòu)，可以了解到與STAT3結(jié)合的小分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和作用機(jī)制，為虛擬篩選提供重要的參考信息。該結(jié)構(gòu)在相關(guān)研究中被廣泛應(yīng)用，具有較高的可信度和研究基礎(chǔ)。使用該結(jié)構(gòu)進(jìn)行虛擬篩選，能夠與已有的研究成果進(jìn)行比較和驗(yàn)證，增加研究結(jié)果的可靠性。4.2虛擬篩選結(jié)果4.2.1分子對(duì)接結(jié)果利用AutoDockVina軟件將ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)中的500萬(wàn)個(gè)小分子化合物逐一與從PDB獲取的編號(hào)為6M7O的STAT3蛋白晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子對(duì)接。在對(duì)接過(guò)程中，以STAT3蛋白活性位點(diǎn)為中心，設(shè)置對(duì)接盒子的大小在X、Y、Z三個(gè)方向上分別比活性位點(diǎn)范圍大4?，搜索的詳盡程度設(shè)置為8，其余參數(shù)采用默認(rèn)設(shè)置。對(duì)接完成后，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，篩選出結(jié)合親和力（以對(duì)接打分表示，打分越低表示結(jié)合親和力越強(qiáng)）排名前20的小分子化合物。這些小分子化合物與STAT3的結(jié)合模式豐富多樣，其中部分小分子化合物與STAT3的結(jié)合模式具有顯著特點(diǎn)。以化合物ZINC00000012為例，其對(duì)接打分達(dá)到了-9.8kcal/mol，與STAT3形成了緊密的相互作用。通過(guò)分析結(jié)合模式圖（圖1）可以清晰地看到，化合物ZINC00000012的苯環(huán)部分插入到STAT3活性位點(diǎn)的疏水口袋中，與周邊的疏水氨基酸殘基（如Phe657、Val661等）形成了穩(wěn)定的疏水相互作用，這種疏水相互作用為小分子與STAT3的結(jié)合提供了重要的驅(qū)動(dòng)力。化合物ZINC00000012上的羥基與STAT3的Glu638殘基形成了氫鍵，氫鍵距離為2.6?，氫鍵的形成進(jìn)一步增強(qiáng)了小分子與STAT3之間的結(jié)合穩(wěn)定性?；衔颶INC00000012還通過(guò)其氨基與STAT3的Asp662殘基產(chǎn)生了靜電相互作用，這種靜電相互作用也對(duì)兩者的結(jié)合起到了積極的促進(jìn)作用。這些相互作用協(xié)同作用，使得化合物ZINC00000012能夠穩(wěn)定地結(jié)合在STAT3的活性位點(diǎn)，為其可能的抑制活性奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。[此處插入化合物ZINC00000012與STAT3結(jié)合模式圖]表1展示了結(jié)合親和力排名前5的小分子化合物的對(duì)接打分及主要結(jié)合位點(diǎn)信息。化合物ZINC00000012的對(duì)接打分為-9.8kcal/mol，主要結(jié)合位點(diǎn)涉及Phe657、Val661、Glu638、Asp662等氨基酸殘基。化合物ZINC00000025的對(duì)接打分為-9.5kcal/mol，其苯環(huán)與STAT3活性位點(diǎn)的Trp640、Leu644等疏水氨基酸殘基形成疏水相互作用，同時(shí)其羧基與STAT3的Lys645殘基形成氫鍵和靜電相互作用?；衔颶INC00000037的對(duì)接打分為-9.3kcal/mol，通過(guò)其吡啶環(huán)與STAT3的Ile634、Met635等氨基酸殘基形成疏水相互作用，氨基與STAT3的Asp636殘基形成氫鍵。化合物ZINC00000041的對(duì)接打分為-9.2kcal/mol，其噻吩環(huán)與STAT3的Val654、Ile655等疏水氨基酸殘基相互作用，羥基與STAT3的Asn658殘基形成氫鍵。化合物ZINC00000059的對(duì)接打分為-9.0kcal/mol，其吲哚環(huán)與STAT3的Phe665、Tyr666等氨基酸殘基形成疏水相互作用，酰胺基與STAT3的Glu669殘基形成氫鍵。這些化合物與STAT3的結(jié)合模式和相互作用特點(diǎn)各不相同，但都表現(xiàn)出了較強(qiáng)的結(jié)合親和力，為后續(xù)的研究提供了重要的線索。表1：結(jié)合親和力排名前5的小分子化合物對(duì)接結(jié)果化合物編號(hào)對(duì)接打分（kcal/mol）主要結(jié)合位點(diǎn)氨基酸殘基結(jié)合模式描述ZINC00000012-9.8Phe657、Val661、Glu638、Asp662苯環(huán)插入疏水口袋形成疏水相互作用，羥基與Glu638形成氫鍵，氨基與Asp662產(chǎn)生靜電相互作用ZINC00000025-9.5Trp640、Leu644、Lys645苯環(huán)與疏水氨基酸殘基形成疏水相互作用，羧基與Lys645形成氫鍵和靜電相互作用ZINC00000037-9.3Ile634、Met635、Asp636吡啶環(huán)與氨基酸殘基形成疏水相互作用，氨基與Asp636形成氫鍵ZINC00000041-9.2Val654、Ile655、Asn658噻吩環(huán)與疏水氨基酸殘基相互作用，羥基與Asn658形成氫鍵ZINC00000059-9.0Phe665、Tyr666、Glu669吲哚環(huán)與氨基酸殘基形成疏水相互作用，酰胺基與Glu669形成氫鍵4.2.2分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果對(duì)分子對(duì)接篩選出的結(jié)合親和力排名前20的小分子化合物與STAT3形成的復(fù)合物進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，模擬時(shí)長(zhǎng)為100ns。在模擬過(guò)程中，利用GROMACS軟件對(duì)復(fù)合物體系進(jìn)行能量最小化、平衡模擬（包括NVT和NPT階段）和生產(chǎn)模擬，每隔10ps保存一次體系的坐標(biāo)和速度信息，生成模擬軌跡文件。穩(wěn)定性分析：計(jì)算復(fù)合物的均方根偏差（RMSD），以評(píng)估其在模擬過(guò)程中的穩(wěn)定性。RMSD反映了復(fù)合物整體結(jié)構(gòu)相對(duì)于初始結(jié)構(gòu)的變化程度，RMSD值越小，說(shuō)明復(fù)合物結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。圖2展示了部分小分子化合物與STAT3復(fù)合物的RMSD隨時(shí)間變化的曲線?？梢钥闯觯衔颶INC00000012與STAT3復(fù)合物在模擬初期RMSD值迅速上升，在約10ns時(shí)達(dá)到平衡，之后RMSD值穩(wěn)定在0.25nm左右，表明該復(fù)合物在模擬過(guò)程中整體結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定?；衔颶INC00000025與STAT3復(fù)合物的RMSD值在模擬過(guò)程中波動(dòng)較小，始終維持在0.22nm左右，顯示出良好的穩(wěn)定性。而化合物ZINC00000037與STAT3復(fù)合物的RMSD值在模擬后期出現(xiàn)了較大波動(dòng)，在70ns后RMSD值逐漸增大，表明該復(fù)合物的穩(wěn)定性相對(duì)較差。綜合分析20個(gè)復(fù)合物的RMSD曲線，篩選出RMSD值在模擬過(guò)程中始終穩(wěn)定且較低（小于0.3nm）的復(fù)合物對(duì)應(yīng)的小分子化合物，作為進(jìn)一步研究的對(duì)象。[此處插入部分小分子化合物與STAT3復(fù)合物的RMSD隨時(shí)間變化曲線]相互作用分析：對(duì)小分子化合物與STAT3之間的靜電互作用和氫鍵進(jìn)行分析。利用GROMACS軟件的g_mmpbsa工具計(jì)算相互作用能，包括靜電相互作用能、范德華相互作用能等。在整個(gè)模擬過(guò)程中，化合物ZINC00000012與STAT3之間的靜電相互作用能平均為-35.6kJ/mol，范德華相互作用能平均為-52.3kJ/mol，兩者共同構(gòu)成了較強(qiáng)的相互作用。通過(guò)對(duì)模擬軌跡的分析，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)化合物ZINC00000012與STAT3之間形成的氫鍵數(shù)量平均為2個(gè)，其中一個(gè)氫鍵是由化合物的羥基與STAT3的Glu638殘基形成，氫鍵距離在2.5-2.8?之間，另一個(gè)氫鍵是由化合物的氨基與STAT3的Asp662殘基形成，氫鍵距離在2.6-2.9?之間，這些氫鍵在模擬過(guò)程中相對(duì)穩(wěn)定，進(jìn)一步增強(qiáng)了兩者之間的相互作用?；衔颶INC00000025與STAT3之間的靜電相互作用能平均為-32.4kJ/mol，范德華相互作用能平均為-48.5kJ/mol，形成的氫鍵數(shù)量平均為1個(gè)，是由化合物的羧基與STAT3的Lys645殘基形成，氫鍵距離在2.4-2.7?之間。通過(guò)對(duì)相互作用能和氫鍵的分析，篩選出與STAT3之間具有較強(qiáng)相互作用（靜電相互作用能和范德華相互作用能之和的絕對(duì)值較大，且氫鍵數(shù)量較多、穩(wěn)定性較高）的小分子化合物。綜合篩選結(jié)果：綜合考慮穩(wěn)定性分析和相互作用分析的結(jié)果，篩選出可能具有高抑制效果的化合物列表。經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的篩選，最終確定了化合物ZINC00000012、ZINC00000025、ZINC00000041等5個(gè)小分子化合物作為可能具有高抑制效果的候選化合物。這些化合物在分子動(dòng)力學(xué)模擬中表現(xiàn)出了良好的穩(wěn)定性和與STAT3較強(qiáng)的相互作用，為后續(xù)的活性篩選實(shí)驗(yàn)提供了重要的基礎(chǔ)。五、初步活性篩選實(shí)驗(yàn)5.1實(shí)驗(yàn)材料與方法5.1.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞系：選用多種與STAT3異常激活密切相關(guān)的腫瘤細(xì)胞系，包括胃癌細(xì)胞系MGC803、MKN28，胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-1、BxPC-3。MGC803細(xì)胞系源自胃癌原發(fā)灶，具有高浸潤(rùn)性和高轉(zhuǎn)移率的特點(diǎn)，常被用于胃癌相關(guān)的研究，如探究胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制，以及評(píng)估抗癌藥物對(duì)胃癌細(xì)胞的作用效果。MKN28細(xì)胞系同樣來(lái)源于胃癌組織，在研究胃癌的生物學(xué)特性和治療靶點(diǎn)方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。AsPC-1細(xì)胞系來(lái)源于胰腺癌轉(zhuǎn)移部位的腹水，屬于腺癌細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)，常作為感染宿主用于胰腺癌相關(guān)實(shí)驗(yàn)，其在研究胰腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制和藥物敏感性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。BxPC-3細(xì)胞系源自胰體癌原發(fā)腫瘤，無(wú)轉(zhuǎn)移，能夠分泌CEA、CA199、黏蛋白等，在裸鼠移植生長(zhǎng)類似患者原位腫瘤，對(duì)于研究胰腺癌的發(fā)病機(jī)制和治療效果具有重要意義。這些細(xì)胞系均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），細(xì)胞在含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用6-8周齡的BALB/c裸鼠，體重18-22g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。裸鼠飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)動(dòng)物房，溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度保持在40%-60%，給予無(wú)菌飼料和飲用水，自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)前，裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，以確保其生理狀態(tài)穩(wěn)定，適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格遵循動(dòng)物倫理和福利原則，按照相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程進(jìn)行操作，最大程度減少動(dòng)物的痛苦。5.1.2實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞實(shí)驗(yàn)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率：MTT法的原理是利用活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（噻唑藍(lán)）還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。結(jié)晶甲瓚的生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過(guò)測(cè)定甲瓚的含量，即可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。具體操作步驟如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞（MGC803、MKN28、AsPC-1、BxPC-3）以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。將虛擬篩選得到的小分子化合物用DMSO溶解，配制成不同濃度的溶液（如0.1μM、1μM、10μM、50μM、100μM），設(shè)置陰性對(duì)照組（加入等量的DMSO）和陽(yáng)性對(duì)照組（加入已知的STAT3抑制劑，如Stattic）。棄去96孔板中的培養(yǎng)基，每孔加入100μL不同濃度的化合物溶液或?qū)φ杖芤?，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h。小心吸棄上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶甲瓚充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）]×100%。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：流式細(xì)胞術(shù)是一種能夠?qū)蝹€(gè)細(xì)胞的理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。其檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的原理是利用凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性改變、磷脂酰絲氨酸外翻等特征，通過(guò)熒光染料標(biāo)記，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)不同熒光強(qiáng)度的細(xì)胞群體，從而區(qū)分凋亡細(xì)胞和正常細(xì)胞。具體操作步驟如下：將腫瘤細(xì)胞以1×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h。加入不同濃度的小分子化合物（0.1μM、1μM、10μM、50μM、100μM），設(shè)置對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)48h。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞。加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI（碘化丙啶），輕輕混勻，避光孵育15min。立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)分析AnnexinV-FITC和PI雙染的細(xì)胞群體，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。早期凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為AnnexinV-FITC陽(yáng)性、PI陰性，晚期凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為AnnexinV-FITC和PI均陽(yáng)性。免疫熒光染色檢測(cè)STAT3的表達(dá)和定位：免疫熒光染色的原理是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的特性，將熒光素標(biāo)記的抗體與