2025年生物制藥校招面試題及答案1.單選題（每題1分，共20分）1.1在CHO細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高表達(dá)，最先需要優(yōu)化的元件是A.抗生素篩選濃度?B.啟動(dòng)子強(qiáng)度?C.培養(yǎng)基滲透壓?D.細(xì)胞接種密度答案：B。啟動(dòng)子強(qiáng)度直接決定目的基因轉(zhuǎn)錄水平，是表達(dá)量瓶頸的第一步。1.2下列哪項(xiàng)不是單克隆抗體ADCC效應(yīng)的關(guān)鍵分子A.FcγRIIIa?B.C1q?C.CD16?D.NK細(xì)胞答案：B。C1q參與補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑，與ADCC無(wú)關(guān)。1.3用于檢測(cè)宿主殘留DNA的qPCR方法中，最常被擴(kuò)增的基因組重復(fù)序列是A.Alu?B.LINE-1?C.α-satellite?D.18SrDNA答案：A。Alu重復(fù)序列在人源細(xì)胞中拷貝數(shù)高且保守，靈敏度最佳。1.4關(guān)于mRNA疫苗的修飾核苷，下列描述正確的是A.Ψ（假尿苷）降低TLR7/8識(shí)別?B.m1Ψ增加mRNA降解速率?C.5-moU增強(qiáng)二級(jí)結(jié)構(gòu)?D.s2U抑制核糖體結(jié)合答案：A。Ψ可逃逸先天免疫傳感器，提高翻譯效率并降低炎癥反應(yīng)。1.5在ProteinA層析中，最常用的高pH洗脫緩沖液是A.0.1Mglycine,pH2.8?B.0.1Mcitrate,pH3.5?C.0.2Marginine,pH4.0?D.0.15Macetate,pH5.0答案：A。甘氨酸-鹽酸體系pH2.8可快速洗脫IgG且對(duì)蛋白活性影響小。1.6下列哪種突變最可能導(dǎo)致單抗聚集A.N297Q?B.M252Y?C.V264A?D.S440Y答案：D。S440Y引入芳香環(huán)暴露疏水面，促進(jìn)分子間π-π堆積。1.7用于測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)滲透壓的儀器原理基于A.冰點(diǎn)降低?B.電導(dǎo)率?C.折光率?D.紫外吸收答案：A。冰點(diǎn)滲透壓儀精度高，不受顏色或粘度干擾。1.8在IND申報(bào)中，關(guān)于毒理批次的表述正確的是A.可與臨床批共用同一細(xì)胞庫(kù)?B.必須采用商業(yè)化規(guī)模?C.需代表臨床暴露水平?D.允許使用不同表達(dá)系統(tǒng)答案：C。毒理批次需覆蓋臨床最高暴露量，確保安全性外推。1.9下列哪項(xiàng)不是雙特異性抗體常見(jiàn)結(jié)構(gòu)A.CrossMab?B.BiTE?C.DVD-Ig?D.scFv-Fc答案：D。scFv-Fc為單特異性，僅含一個(gè)靶向單元。1.10關(guān)于宿主蛋白（HCP）ELISA覆蓋度驗(yàn)證，最佳實(shí)踐是A.2D-WB與質(zhì)譜正交?B.僅使用商業(yè)化試劑盒?C.采用還原條件電泳?D.以空載體上清作陰性答案：A。2D-WB可直觀顯示抗體對(duì)HCP的識(shí)別廣度，質(zhì)譜提供定量互補(bǔ)。1.11在DOE優(yōu)化培養(yǎng)基時(shí)，若因素?cái)?shù)為7，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)最少實(shí)驗(yàn)次數(shù)為A.8?B.12?C.16?D.24答案：B。PB設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)需≥因素?cái)?shù)+1，12次可估主效應(yīng)。1.12下列哪種層析模式最適合去除空殼AAVA.CIEX?B.AIEX?C.HIC?D.SEC答案：A?？諝ひ職さ入婞c(diǎn)略高，CIEX可在pH7.0時(shí)優(yōu)先結(jié)合完整顆粒。1.13關(guān)于CRISPR-Cas9敲除GS基因提高CHO表達(dá)，下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是A.需同時(shí)敲除兩個(gè)等位基因?B.可用谷氨酰胺合成酶抑制劑篩選?C.會(huì)提高乳酸積累?D.可減少氨毒害答案：C。GS敲除后細(xì)胞依賴(lài)外源谷氨酰胺，乳酸代謝途徑未直接增強(qiáng)。1.14在抗體人源化中，最可能保留鼠源殘基的位置是A.FR1?B.CDR-H3根部?C.FR4?D.CH2答案：B。CDR-H3根部殘基常參與抗原接觸且影響構(gòu)象，需謹(jǐn)慎回復(fù)突變。1.15用于測(cè)定mRNA加帽效率的試劑是A.RNaseH?B.Terminator5′-phosphateexonuclease?C.S1nuclease?D.RNaseA答案：B。該酶僅切割5′-三磷酸未帽RNA，通過(guò)剩余完整mRNA比例計(jì)算。1.16下列哪項(xiàng)不是連續(xù)生物工藝的優(yōu)勢(shì)A.設(shè)備占地小?B.批間差異低?C.驗(yàn)證更簡(jiǎn)單?D.實(shí)時(shí)放行潛力答案：C。連續(xù)工藝驗(yàn)證需涵蓋穩(wěn)態(tài)范圍，復(fù)雜度高于傳統(tǒng)批次。1.17關(guān)于高濃度蛋白制劑粘度，下列措施無(wú)效的是A.引入負(fù)電荷突變?B.添加精氨酸?C.升高離子強(qiáng)度至500mM?D.降低pH至4.0答案：D。過(guò)低pH會(huì)誘導(dǎo)抗體構(gòu)象變化，反而可能升高粘度。1.18在生物反應(yīng)器放大中，保持恒定kLa最常用的方法是A.P/V恒定?B.葉尖速度恒定?C.混合時(shí)間恒定?D.通氣比恒定答案：A。功率輸入/體積恒定可維持體積傳氧系數(shù)。1.19下列哪種病毒清除驗(yàn)證模型病毒屬于非包膜小型病毒A.MuLV?B.SV40?C.PRV?D.Reo3答案：B。SV40直徑45nm，無(wú)包膜，耐受性強(qiáng)，代表最難清除類(lèi)型。1.20關(guān)于ADC藥物DAR值測(cè)定，下列技術(shù)分辨率最高的是A.HIC-HPLC?B.RP-HPLC?C.LC-MSintact?D.UV280/370比值答案：C。高分辨質(zhì)譜可直接解析不同載藥量異構(gòu)體，誤差<0.1。2.多選題（每題2分，共20分）2.1以下哪些屬于典型的“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”（QbD）工具A.風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估FMEA?B.設(shè)計(jì)空間?C.控制策略?D.實(shí)時(shí)放行檢驗(yàn)?E.年度產(chǎn)品回顧答案：ABCD。年度回顧為GMP要求，不屬Q(mào)bD前瞻性工具。2.2關(guān)于雙特異性抗體制造，下列哪些表達(dá)系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)異二聚體高純度A.knob-into-holeCHO?B.CrossMabHEK293?C.BiTE大腸桿菌包涵體?D.共同輕鏈CHO?E.scFv-FcPichia答案：ABD。C需復(fù)性，E為單特異性。2.3以下哪些檢測(cè)可用于細(xì)胞庫(kù)檢定A.無(wú)菌檢查?B.支原體?C.逆轉(zhuǎn)錄病毒?D.端粒酶活性?E.成瘤性答案：ABCE。端粒酶活性并非法規(guī)強(qiáng)制。2.4降低抗體異構(gòu)體（酸性峰）的策略包括A.高爾基體α-甘露糖苷酶抑制劑?B.培養(yǎng)溫度37℃持續(xù)?C.添加Mn2+?D.降低培養(yǎng)pH至6.8?E.采用CO215%答案：ACD。B增加高甘露糖型，E影響有限。2.5關(guān)于mRNA原液純度，下列哪些雜質(zhì)需用離子對(duì)RP-HPLC分離A.dsRNA?B.截短轉(zhuǎn)錄本?C.5′-三磷酸?D.加帽不完全?E.NTP殘留答案：BCD。dsRNA常用dsRNAELISA或纖維素柱，NTP用SEC或透析。2.6以下哪些屬于典型的下游病毒清除步驟A.低pH孵育?B.納濾?C.陰離子膜層析?D.溶劑/去污劑?E.高溫瞬時(shí)答案：ABCD。E為血制品常用，對(duì)IgG不適用。2.7關(guān)于高滲透壓對(duì)CHO細(xì)胞影響，下列描述正確的是A.抑制細(xì)胞周期G1/S?B.提高比生產(chǎn)率?C.降低乳酸比產(chǎn)率?D.增加核糖體生物合成?E.促進(jìn)凋亡答案：ABCE。高滲抑制整體蛋白合成，核糖體下調(diào)。2.8以下哪些屬于ADC有效載荷常見(jiàn)作用機(jī)制A.微管抑制劑?B.DNA烷化?C.TOPO1抑制劑?D.PARP抑制劑?E.RNA聚合酶抑制劑答案：ABC。DE尚未有上市ADC。2.9關(guān)于ProteinA層析柱壽命驗(yàn)證，需考察A.動(dòng)態(tài)載量下降20%循環(huán)數(shù)?B.洗脫峰拖尾因子?C.宿主蛋白穿透?D.配基脫落?E.壓力升高答案：ABCDE。均為法規(guī)指南要求。2.10以下哪些屬于基因治療CMC挑戰(zhàn)A.載體基因組完整性?B.空殼率?C.轉(zhuǎn)染相關(guān)雜質(zhì)?D.長(zhǎng)期穩(wěn)定性?E.中和抗體答案：ABCD。E為臨床免疫原性，不屬CMC。3.判斷題（每題1分，共10分）3.1采用CRISPR-Cas12a敲除DHFR后，細(xì)胞可在無(wú)HT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。答案：錯(cuò)。DHFR-細(xì)胞需添加次黃嘌呤和胸苷或甲氨蝶呤篩選。3.2在生物反應(yīng)器中，CO2可替代N2作為微泡氣體，維持低溶氧。答案：錯(cuò)。CO2形成碳酸，導(dǎo)致pH下降，不可用于溶氧控制。3.3抗體亞可見(jiàn)顆?！?0μm可用光阻法測(cè)定，符合USP<788>。答案：對(duì)。3.4采用MabSelectPrismA?時(shí)，載量與停留時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。答案：錯(cuò)。載量隨停留時(shí)間延長(zhǎng)而升高，直至飽和。3.5對(duì)于ADC，高DAR值一定伴隨高血漿清除率。答案：對(duì)。疏水性增加，易被肝臟攝取。3.6在mRNA加帽中，共轉(zhuǎn)錄法使用CleanCap?可獲得100%Cap1結(jié)構(gòu)。答案：對(duì)。3.7采用深層過(guò)濾去除菌體時(shí)，通量與細(xì)胞密度呈線性關(guān)系。答案：錯(cuò)。通量隨密度升高呈指數(shù)下降。3.8對(duì)于慢病毒載體，RCR檢測(cè)需采用RCL細(xì)胞擴(kuò)增+PCR法。答案：對(duì)。3.9抗體人源化后，免疫原性風(fēng)險(xiǎn)完全消除。答案：錯(cuò)。獨(dú)特型及新表位仍可能觸發(fā)免疫。3.10在DOE中，中心復(fù)合設(shè)計(jì)（CCD）可估所有二階交互作用。答案：對(duì)。4.簡(jiǎn)答題（每題8分，共40分）4.1闡述采用灌流工藝將CHO細(xì)胞密度從20×10^6cells/mL提升至120×10^6cells/mL的關(guān)鍵工程與細(xì)胞生理策略。答案：1)生物反應(yīng)器：采用50L一次性攪拌罐，配備傾斜葉槳與微泡-宏泡雙氣體分布器，確保kLa≥60h^-1；通過(guò)變頻控制葉尖速度<1.8m/s，避免剪切。2)灌流設(shè)備：使用0.2μm中空纖維切向流過(guò)濾器，面積0.75m2，切向流速1200Lh^-1m^-2，濾過(guò)通量40LMH，每4h反沖一次；采用交替切向（ATF）模式，降低膜污染。3)培養(yǎng)基：開(kāi)發(fā)化學(xué)限定強(qiáng)化培養(yǎng)基，含6mmolL^-1谷氨酰胺、1mmolL^-1丙酮酸、30μmolL^-1硫酸錳，降低氨及乳酸；通過(guò)在線拉曼監(jiān)測(cè)葡萄糖，維持0.5gL^-1低濃度，減少副產(chǎn)物。4)滲透壓控制：添加20gL^-1棉子糖，逐步將滲透壓從300mOsmkg^-1升至450mOsmkg^-1，激活相容性溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體，提高細(xì)胞抗壓能力。5)細(xì)胞系：采用CRISPR敲除BAX/BAK抗凋亡，并過(guò)表達(dá)抗高滲相關(guān)基因SLC6A8，提高高密度存活率>95%。6)灌流速率：采用遞增策略，第0天1reactorvolume(RV)day^-1，第3天起每24h增加0.2RV，直至6RVday^-1，維持營(yíng)養(yǎng)供給與代謝廢物稀釋。7)下游銜接：將連續(xù)離心與深層過(guò)濾耦合，實(shí)現(xiàn)>120×10^6cells/mL收獲，活率>98%，為后續(xù)連續(xù)捕獲奠定基礎(chǔ)。4.2描述如何利用LC-MS/MS建立HCP定量方法，并滿足ICHQ2(R1)驗(yàn)證要求。答案：1)樣品制備：采用SDS還原+烷基化，胰酶酶解，加入同位素標(biāo)記肽作為內(nèi)標(biāo)；對(duì)高豐度抗體肽段，使用抗IgG親和柱去除，提高HCP肽段占比。2)色譜：納升液相75μm×25cmC18柱，梯度90min，流速300nLmin^-1，確保峰容量>500。3)質(zhì)譜：OrbitrapExploris480，DIA模式，分辨率120k，AGC300%，碰撞能量階梯30±5eV；建立含>5000HCP肽段譜圖庫(kù)。4)方法驗(yàn)證：?a)特異性：空白緩沖液、高濃度抗體基質(zhì)中無(wú)干擾峰。?b)線性：取0.5–1000ngmL^-1加標(biāo)，權(quán)重1/x回歸，R^2≥0.99，殘差<15%。?c)準(zhǔn)確度與精密度：低中高三個(gè)濃度，批內(nèi)/批間RSD<10%，回收率90–110%。?d)檢測(cè)限與定量限：LOD=0.2ngmL^-1，LOQ=0.5ngmL^-1，信噪比≥10。?e)稀釋線性：10倍稀釋回收率95–105%。?f)穩(wěn)定性：自動(dòng)進(jìn)樣器6℃48h、凍融三次、-80℃30天，偏差<10%。5)系統(tǒng)適用性：每批次運(yùn)行QC樣品，偏差<15%；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，每個(gè)HCP至少3肽段，2離子對(duì)/肽段，確保定量可靠。6)按ICHQ2(R1)提交驗(yàn)證總結(jié)，用于BLA申報(bào)。4.3解釋為何在ADC工藝中需控制DAR值分布，并給出降低DAR>8組分的純化策略。答案：高DAR組分疏水性強(qiáng)，導(dǎo)致血漿清除快、半衰期縮短，且易聚集引發(fā)免疫原性；同時(shí)高載藥可加劇脫靶毒性。降低DAR>8策略：1)疏水層析：采用ToyopearlHexyl-650，梯度遞減硫酸銨從1.5M至0M，DAR>8因疏水更強(qiáng)而延遲洗脫，收集前峰可得DAR2–4主群。2)復(fù)合模式層析：CaptoCore700，核殼結(jié)構(gòu)，高DAR因分子尺寸增大被排阻在外殼，低DAR進(jìn)入核心結(jié)合，實(shí)現(xiàn)流穿模式去除高DAR。3)超濾分級(jí)：使用30kDa膜，高DAR因流體力學(xué)半徑大，在跨膜壓0.5bar下通量低，通過(guò)時(shí)間梯度收集滲透液，富集低DAR。4)調(diào)節(jié)偶聯(lián)：降低藥物/抗體摩爾比至4:1，控制反應(yīng)pH7.0，溫度25℃，減少過(guò)度偶聯(lián)；引入DMA10%助溶，降低局部疏水聚集。5)在線監(jiān)測(cè)：采用HIC-HPLC快速檢測(cè)，設(shè)定DAR>8面積百分比<5%，實(shí)時(shí)反饋收集區(qū)間。綜合上述，可將DAR>8從15%降至<2%，滿足規(guī)格。4.4比較三種常用病毒清除模型病毒（MuLV、MMV、Reo3）的理化特性及清除工藝設(shè)計(jì)差異。答案：MuLV：包膜RNA病毒，直徑80–110nm，對(duì)低pH及去污劑敏感；清除依賴(lài)低pH3.6孵育30min+納濾20nm。MMV：無(wú)包膜DNA病毒，直徑18–26nm，耐酸堿、耐溶劑；低pH無(wú)效，需采用高溫50℃1h+陰離子膜層析（Qmembrane）流穿模式，納濾35nm可截留。Reo3：無(wú)包膜RNA病毒，直徑60–80nm，耐乙醚，對(duì)低pH部分敏感；采用低pH3.8+CIEX結(jié)合洗脫，再經(jīng)納濾35nm；因其較大，納濾清除能力高，但需驗(yàn)證壓力升高對(duì)回收率影響。工藝設(shè)計(jì)時(shí)需根據(jù)病毒特性組合步驟，確?？侺RV≥12logs，且每步≥4logs。4.5說(shuō)明如何利用機(jī)器學(xué)習(xí)預(yù)測(cè)單抗粘度，并給出特征工程與模型訓(xùn)練細(xì)節(jié)。答案：1)數(shù)據(jù)集：收集內(nèi)部350個(gè)抗體，變量包括序列（長(zhǎng)度、電荷、疏水、CDR長(zhǎng)度）、翻譯后修飾（高甘露糖%、酸性峰%）、制劑條件（pH、離子強(qiáng)度、輔料濃度）、實(shí)驗(yàn)粘度（高剪切150mgmL^-1，25℃）。2)特征工程：?a)序列：使用Biopython計(jì)算pI、GRAVY、凈電荷、芳香族比例；CDR采用Kidera因子生成27維向量。?b)結(jié)構(gòu)：采用AlphaFold2預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)，計(jì)算表面可及疏水面積（SASA）、β-折疊含量、界面B-factor。?c)修飾：將糖型HPLC數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)為摩爾分?jǐn)?shù)，酸性峰分為脫酰胺、異構(gòu)化、氧化三類(lèi)。?d)交互特征：構(gòu)建pI×pH、SASA×鹽濃度等二階項(xiàng)。3)模型：采用XGBoost回歸，樹(shù)數(shù)1000，深度6，學(xué)習(xí)率0.05，正則化λ=1；十折交叉驗(yàn)證，R^2=0.91，MAE=0.8cP。4)解釋性：使用SHAP值，發(fā)現(xiàn)SASA、凈電荷、pI-pH差貢獻(xiàn)最大；指導(dǎo)設(shè)計(jì)時(shí)優(yōu)先引入負(fù)電荷突變降低SASA。5)部署：構(gòu)建WebAPI，輸入序列與制劑參數(shù)，3s返回預(yù)測(cè)粘度，誤差<10%，用于早期可開(kāi)發(fā)性篩選。5.計(jì)算題（每題10分，共30分）5.1某2000L規(guī)模生產(chǎn)單抗，收獲滴重3.2gL^-1，ProteinA動(dòng)態(tài)載量40gL^-1，柱徑80cm，床高20cm，循環(huán)時(shí)間2.5h，收率92%。求所需層析柱數(shù)量與總純化時(shí)間。答案：柱體積V=π×(0.4m)^2×0.2m=0.1005m^3=100.5L；總抗體=2000L×3.2gL^-1=6400g；每柱載量=40gL^-1×100.5L=4020g；需柱數(shù)=6400/(4020×0.92)=1.73→2柱；總時(shí)間=2.5h（并行）→2.5h。5.2某ADC藥物偶聯(lián)反應(yīng)中，抗體濃度5mgmL^-1，藥物/抗體摩爾比6，反應(yīng)體積2L，藥物分子量986gmol^-1，抗體150kDa，偶聯(lián)效率75%，求需加入藥物質(zhì)量。答案：抗體摩爾數(shù)=5gL^-1×2L/(150000gmol^-1)=6.67×10^-5mol；理論藥物摩爾數(shù)=6×6.67×10^-5=4.0×10^-4mol；實(shí)際需加入=4.0×10^-4mol/0.75=5.33×10^-4mol；質(zhì)量=5.33×10^-4mol×986gmol^-1=0.526g。5.3某病毒清除研究中，低pH步驟前病毒滴度10^6.5TCID50mL^-1，處理體積100mL，后取樣1mL，未檢出病毒（檢測(cè)限10^0.5TCID50mL^-1），采用泊松分布95%置信上限，求LRV。答案：未檢出，陽(yáng)性率p=0/1=0；95%置信上限p_upper=1?0.05^(1/n)=0.95；檢測(cè)限病毒數(shù)=?ln(1?p_upper)=?ln(0.05)=3.0TCID50；LRV=log10(輸入病毒總量)?log10(95%上限殘留)=log10(10^6.5×100)?log10(3.0)=8.5?0.48=8.02logs。6.綜合案例分析（20分）背景：某生物制藥公司開(kāi)發(fā)一款抗HER2×CD3雙特異抗體，采用commonlightchain設(shè)計(jì)，CHO-K1表達(dá)，下游擬采用ProteinA、CIEX、VIUSOLVENT病毒滅活、納濾、SEC步驟。IND申報(bào)前發(fā)現(xiàn)CIEX洗脫峰出現(xiàn)3%聚集體，且細(xì)胞培養(yǎng)上清中HCP升高至800ppm，需制定控制策略。問(wèn)題：a)分析聚集體產(chǎn)生根本原因（4分）。b)提出降低HCP至<100ppm的下游優(yōu)化方案（6分）。c)設(shè)計(jì)病毒清除矩陣，確?？侺RV≥16logs（4分）。d)給出INDCMC部分需提交的關(guān)鍵圖譜與表格清單（6分）。答案：a)聚集體原因：雙抗結(jié)構(gòu)含兩個(gè)不同重鏈，CH3界面疏水補(bǔ)