2025年春考生物制藥考題及答案一、單項(xiàng)選擇題（每題2分，共20分。每題只有一個(gè)正確答案，請(qǐng)將正確選項(xiàng)填涂在答題卡上）1.在CHO細(xì)胞中表達(dá)人源化單抗時(shí)，為提高產(chǎn)物均一性，最優(yōu)先敲除的宿主基因是A.FUT8B.DHFRC.GSD.Bcl-2答案：A解析：FUT8編碼α-1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，敲除后可降低抗體Fc段巖藻糖基化，增強(qiáng)ADCC效應(yīng)，同時(shí)減少糖型異質(zhì)性。2.2024年FDA批準(zhǔn)的“Zolbetuximab”屬于下列哪一類(lèi)抗體藥物A.PD-1抑制劑B.Claudin18.2靶向C.CD19CAR-TD.PCSK9單抗答案：B解析：Zolbetuximab為Claudin18.2靶向嵌合IgG1，用于胃癌一線治療。3.某質(zhì)粒在E.coli中拷貝數(shù)達(dá)500，其復(fù)制起點(diǎn)最可能來(lái)源于A.pMB1B.p15AC.pSC101D.R6K答案：A解析：pMB1突變型（如pUC系列）在野生型polA菌株中拷貝數(shù)300–700，p15A僅20–30。4.下列哪種層析介質(zhì)對(duì)IgG4的Fab親和力最高A.ProteinAB.ProteinGC.ProteinLD.CaptoMMC答案：C解析：ProteinL結(jié)合κ輕鏈1–4，不與Fc段作用，故對(duì)Fab親和力最高。5.在生物反應(yīng)器放大過(guò)程中，保持kLa恒定的常用策略是A.等P/VB.等葉尖速度C.等氧傳質(zhì)系數(shù)D.等混合時(shí)間答案：C解析：kLa為體積氧傳質(zhì)系數(shù)，直接關(guān)聯(lián)細(xì)胞耗氧，放大時(shí)常保持恒定。6.下列哪項(xiàng)不是mRNA疫苗質(zhì)粒線性化常用的限制性?xún)?nèi)切酶A.BspQⅠB.XbaⅠC.SapⅠD.BglⅡ答案：D解析：BglⅡ識(shí)別位點(diǎn)常在抗性基因內(nèi)，切割后易丟失篩選標(biāo)記；前三者為常用Ⅱ型酶，產(chǎn)生5′-粘性末端利于體外轉(zhuǎn)錄。7.關(guān)于CRISPR-Cas13d系統(tǒng)，下列描述正確的是A.靶向DNAB.依賴(lài)tracrRNAC.可做多重基因沉默D.產(chǎn)生雙鏈斷裂答案：C解析：Cas13d為RNA靶向，無(wú)需tracrRNA，通過(guò)設(shè)計(jì)不同crRNA可實(shí)現(xiàn)多重敲低，不形成DSB。8.在下游純化中，用于去除宿主細(xì)胞蛋白（HCP）的專(zhuān)屬配基最常用A.苯基B.亞氨基二乙酸C.多克隆抗HCP抗體D.巰基乙醚答案：C解析：免疫親和層析采用多克隆抗HCP抗體，可一次性去除>90%HCP。9.下列哪項(xiàng)檢測(cè)方法可區(qū)分抗體Met氧化與Trp氧化A.肽圖LC-UVB.cIEFC.RP-HPLCD.LC-MS/MS答案：D解析：只有高分辨質(zhì)譜可精確定位氧化位點(diǎn)并定量，Met+16、Trp+16、+32均可區(qū)分。10.關(guān)于“藥品上市許可持有人制度”（MAH），下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是A.允許研發(fā)機(jī)構(gòu)持證B.可委托生產(chǎn)C.必須自有GMP廠房D.需建立藥物警戒體系答案：C解析：MAH核心為“輕資產(chǎn)”，允許全鏈條委托，無(wú)需自有廠房。二、不定項(xiàng)選擇題（每題3分，共15分。每題有一個(gè)或多個(gè)正確答案，全部選對(duì)得滿分，漏選得1分，錯(cuò)選得0分）11.下列哪些操作可降低抗體高甘露糖型比例A.加入kifunensineB.降低培養(yǎng)溫度至32℃C.過(guò)表達(dá)GNTⅣD.敲除MAN1A1答案：B、C、D解析：kifunensine為α-甘露糖苷酶抑制劑，反而升高高甘露糖；低溫延緩高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)，GNTⅣ引入分支，MAN1A1敲除減少甘露糖修剪。12.關(guān)于AAV載體生產(chǎn)，下列可提高包裝效率的措施有A.使用三重轉(zhuǎn)染系統(tǒng)B.優(yōu)化ITR序列C.加入丁酸鈉D.采用懸浮HEK293答案：A、B、D解析：丁酸鈉主要提高蛋白表達(dá)，對(duì)AAV包裝無(wú)顯著增益；三重轉(zhuǎn)染（rep/cap/helper）為工業(yè)主流，ITR完整性決定基因組包裝效率，懸浮293可放大。13.下列哪些屬于“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”（QbD）中的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）A.糖型分布B.電荷異構(gòu)體C.內(nèi)毒素D.培養(yǎng)基批號(hào)答案：A、B、C解析：CQA指影響安全有效的理化性質(zhì)，培養(yǎng)基批號(hào)為工藝參數(shù)，非CQA。14.關(guān)于連續(xù)生物制造，下列描述正確的是A.灌流培養(yǎng)可實(shí)現(xiàn)>80天穩(wěn)定運(yùn)行B.連續(xù)層析需多柱位切換C.可縮短下游處理周期D.需實(shí)時(shí)放行檢測(cè)（RTRT）答案：A、B、C、D解析：連續(xù)制造核心為“穩(wěn)態(tài)+在線監(jiān)控”，四選項(xiàng)均符合。15.下列哪些屬于生物類(lèi)似藥“頭對(duì)頭”臨床可比性研究的主要終點(diǎn)A.總緩解率B.藥代動(dòng)力學(xué)相似性C.抗藥抗體發(fā)生率D.中和活性答案：B、C解析：PK相似為首要終點(diǎn)，免疫原性（ADA）為次要；臨床療效等效為驗(yàn)證性終點(diǎn)。三、填空題（每空1分，共15分）16.2024年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予“點(diǎn)擊化學(xué)”與“生物正交反應(yīng)”，其中銅催化疊氮-炔環(huán)加成（CuAAC）的催化劑為_(kāi)_______，無(wú)銅應(yīng)變促進(jìn)疊氮-炔環(huán)加成（SPAAC）的核心基團(tuán)為_(kāi)_______。答案：Cu(I)、環(huán)辛炔（BCN或DIBO均可）17.在雙特異性抗體構(gòu)建中，若采用“杵-臼”（Knobs-into-Holes）結(jié)構(gòu)，杵突變位于________鏈的________位點(diǎn)，臼突變位于________鏈。答案：重鏈CH3、T366W、重鏈CH3T366SL368AY407V18.某mRNA疫苗加帽采用共轉(zhuǎn)錄法，帽類(lèi)似物為_(kāi)_______，其修飾可提升________酶對(duì)Cap1結(jié)構(gòu)的識(shí)別，進(jìn)而增強(qiáng)翻譯效率。答案：CleanCapAG、RNMT（RNA鳥(niǎo)嘌呤-7-甲基轉(zhuǎn)移酶）19.依據(jù)ICHQ5E，工藝變更后需進(jìn)行________研究，以證明變更前后產(chǎn)品質(zhì)量________。答案：可比性、高度相似20.在單抗A的強(qiáng)制降解試驗(yàn)中，pH9、40℃下放置4周，主峰下降15%，RP-HPLC出現(xiàn)+32Da碎片，提示發(fā)生________氧化，其敏感氨基酸為_(kāi)_______。答案：色氨酸、Trp21.用于測(cè)定宿主DNA殘留的qPCR法中，通常選擇________基因作為靶標(biāo)，其片段長(zhǎng)度控制在________bp以?xún)?nèi)，以保證擴(kuò)增效率。答案：高度重復(fù)Alu、20022.某生物藥采用20nm病毒過(guò)濾去除細(xì)小病毒，其Log10降低值（LRV）需≥________，依據(jù)________指南。答案：4、EMA/410/01rev.3四、名詞解釋?zhuān)款}4分，共12分）23.糖工程（Glycoengineering）答案：通過(guò)基因編輯或代謝調(diào)控手段，對(duì)宿主細(xì)胞糖基化途徑進(jìn)行定向改造，以獲得均一、優(yōu)化的糖型結(jié)構(gòu)，從而改善抗體ADCC/CDC效應(yīng)、半衰期及免疫原性。24.連續(xù)灌流培養(yǎng)（Perfusion）答案：在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，持續(xù)補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基并同時(shí)排出廢液，使細(xì)胞保留于反應(yīng)器內(nèi)，維持高密度、高活性狀態(tài)的培養(yǎng)模式，常用于不穩(wěn)定蛋白或高產(chǎn)量需求場(chǎng)景。25.免疫原性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估矩陣答案：綜合產(chǎn)品相關(guān)因素（結(jié)構(gòu)、聚集體、雜質(zhì)）、患者因素（免疫狀態(tài)、給藥途徑）、臨床因素（劑量、療程）建立的多維度評(píng)分工具，用于預(yù)測(cè)生物藥誘發(fā)抗藥抗體的概率并制定控制策略。五、簡(jiǎn)答題（每題8分，共24分）26.闡述利用CRISPR-Cas9敲除CHO細(xì)胞FUT8基因的完整實(shí)驗(yàn)流程，并說(shuō)明如何鑒定純合敲除克隆。答案：（1）sgRNA設(shè)計(jì)：在FUT8第3外顯子選擇5′-GAGTACCGCGTGGCCGAGTA-3′，GC含量60%，無(wú)脫靶（CRISPOR評(píng)分>90）。（2）載體構(gòu)建：將sgRNA克隆至pX330-mCherry，同時(shí)合成80nt單鏈寡核苷酸供體（ssODN），引入兩個(gè)終止密碼子及BglⅡ酶切位點(diǎn)。（3）轉(zhuǎn)染：CHO-S細(xì)胞以2×10?cells/mL密度電轉(zhuǎn)（120V、20ms），質(zhì)粒用量5μg，ssODN10μg。（4）分選：24h后流式分選mCherry+單細(xì)胞至96孔板，每孔1cell。（5）克隆擴(kuò)增：10天后取上清進(jìn)行LCA-FITC凝集素染色，敲除細(xì)胞失去巖藻糖基化，熒光強(qiáng)度下降>90%。（6）基因型鑒定：提取基因組，PCR擴(kuò)增靶區(qū)（引物F:5′-ATGGCTACCGAGGTGCTG-3′，R:5′-GCCTCGAACTTGCCCTT-3′），產(chǎn)物經(jīng)BglⅡ酶切，敲除克隆出現(xiàn)130+70bp片段；測(cè)序確認(rèn)引入雙終止，無(wú)野生型讀碼。（7）脫靶檢測(cè)：對(duì)預(yù)測(cè)前5位潛在位點(diǎn)PCR測(cè)序，無(wú)突變，判定為純合敲除。27.比較ProteinA親和層析與混合模式層析（MMC）在單抗捕獲階段的優(yōu)劣，并給出選擇策略。答案：ProteinA優(yōu)勢(shì)：①對(duì)IgGFc段特異性極高，一步純度可達(dá)95%；②工藝成熟，平臺(tái)化參數(shù)明確；③線性放大容易，柱壽命>200cycle。劣勢(shì)：①介質(zhì)成本高（$10000/L）；②耐堿受限（CIP僅0.1MNaOH）；③對(duì)IgG4/人源化scFv親和力下降。MMC優(yōu)勢(shì)：①配基密度高，載量80–100g/L；②耐堿（1MNaOH），CIP徹底；③可去除聚集體、HCP、DNA同步進(jìn)行；④成本僅為ProteinA1/3。劣勢(shì)：①選擇性低，需精細(xì)pI/電導(dǎo)窗口；②緩沖液種類(lèi)多，開(kāi)發(fā)周期長(zhǎng)；③對(duì)糖型敏感，需驗(yàn)證批間一致。選擇策略：若臨床Ⅲ期及商業(yè)化，追求穩(wěn)健與速度，優(yōu)先ProteinA；若早期研發(fā)、抗體pI<7.0且聚集體<5%，可采用MMC縮短周期并降本；對(duì)雙特異抗體或Fc缺失片段，直接采用MMC或離子交換。28.說(shuō)明mRNA疫苗中dsRNA副產(chǎn)物引發(fā)先天免疫的機(jī)制，并給出工藝去除方案。答案：機(jī)制：dsRNA>30bp被胞內(nèi)模式識(shí)別受體RIG-I/MDA5識(shí)別，激活MAVS信號(hào)級(jí)聯(lián)，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素（IFN-β）及促炎因子（TNF-α、IL-6），抑制mRNA翻譯起始因子eIF2α磷酸化，導(dǎo)致抗原表達(dá)下降，并伴隨發(fā)熱、注射部位疼痛。去除方案：（1）優(yōu)化IVT體系：降低T7RNA聚合酶濃度至1U/μg模板，減少轉(zhuǎn)錄回溯；GTP/CAPratio4:1，減少異常起始。（2）酶處理：IVT結(jié)束后加入1U/μgRNaseⅢ，37℃30min，特異性剪切dsRNA為<10bp片段。（3）純化：采用oligodT親和層析捕獲帶polyA尾完整mRNA，dsRNA流穿；再經(jīng)纖維素（cellulose）柱，dsRNA在高鹽下結(jié)合，mRNA回收率>85%，dsRNA殘留<0.01ng/μg。（4）實(shí)時(shí)檢測(cè)：使用J2抗體dot-blot或HPLC-MS，定量下限0.5pg/μg。（5）體內(nèi)驗(yàn)證：IFN-β報(bào)告基因小鼠模型肌肉注射后6h血清IFN-β<20pg/mL，與陰性對(duì)照無(wú)差異。六、計(jì)算與綜合題（共64分）29.（10分）某50kDa單抗以灌流方式生產(chǎn)，反應(yīng)器工作體積100L，細(xì)胞密度維持60×10?cells/mL，比生產(chǎn)速率qP=25pg/cell/day，產(chǎn)物濃度5g/L，每日收獲50L并補(bǔ)入等量新鮮培養(yǎng)基。（1）計(jì)算每日抗體產(chǎn)量；（2）若下游純化總收率75%，求年運(yùn)行300天的可上市原料藥（DS）量；（3）若ProteinA層析載量50g/L，柱體積如何選擇可滿足1天處理量且循環(huán)≤3次？答案：（1）日產(chǎn)量=5g/L×50L=250g（2）年DS=250g×300×0.75=56.25kg（3）日處理量250g，循環(huán)3次，總載量=250/3≈83.3g；柱體積=83.3g÷50g/L=1.67L，可選1.8L柱。30.（12分）某雙特異抗體（BsAb）采用“CrossMab”技術(shù)，其中一條重鏈CH1與CL互換。構(gòu)建過(guò)程中發(fā)現(xiàn)聚集體高達(dá)18%，分析顯示為錯(cuò)配半抗體。（1）給出兩種降低錯(cuò)配半抗體的分子設(shè)計(jì)策略；（2）設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證聚集體來(lái)源；（3）若陽(yáng)離子交換層析分離半抗體與BsAb，預(yù)測(cè)洗脫順序并說(shuō)明理由。答案：（1）策略：①在互換CH1/CL的Fab界面引入“電荷對(duì)”突變（互換鏈CH1K221E、CLE123K），利用靜電牽引促進(jìn)正確配對(duì)；②在knobs-into-holes基礎(chǔ)上，于CH3增加額外二硫鍵（S354C-Y349C），提高異源二聚體穩(wěn)定性。（2）實(shí)驗(yàn)：采用非還原CE-SDS，若聚集體為半抗體，可見(jiàn)75kDa條帶；還原CE-SDS僅出現(xiàn)25kDa（LC）與50kDa（HC），無(wú)額外條帶，可排除二硫鍵錯(cuò)連；再通過(guò)LC-MS/MS分析半抗體序列，確認(rèn)互換鏈比例，驗(yàn)證錯(cuò)配來(lái)源。（3）洗脫順序：半抗體因缺少一個(gè)Fc段，表面正電荷密度低，與介質(zhì)結(jié)合弱，先洗脫；完整BsAb含雙Fc，正電荷高，后洗脫。31.（14分）某ADC藥物由人源化IgG1、mc-VC-PAB、MMAE組成，DAR=4。強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)顯示：pH8.5、40℃、2周，游離MMAE升高至2.1%，出現(xiàn)DAR=0、2、4、6混合組分。（1）說(shuō)明游離毒素升高的兩種化學(xué)機(jī)制；（2）建立RP-HPLC方法同時(shí)定量DAR分布，給出色譜條件；（3）若規(guī)定游離MMAE≤1%，計(jì)算所需加速實(shí)驗(yàn)最小時(shí)間（已知活化能Ea=95kJ/mol）。答案：（1）機(jī)制：①β-消除：mc-VC-PAB連接子中Val-Cit二肽在堿性條件下發(fā)生β-消除，生成脫氫丙氨酸與游離MMAE；②硫醚氧化：抗體表面游離巰基（未配對(duì)Cys）氧化為磺酸，導(dǎo)致連接子硫醚鍵斷裂。（2）色譜條件：色譜柱：WatersBEH300C42.1×150mm，1.7μm；流動(dòng)相A：0.1%TFA-水，B：0.1%TFA-乙腈；梯度：5–45%B30min，柱溫80℃，流速0.3mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm（蛋白）+248nm（MMAE），可基線分離裸抗、DAR2、4、6。（3）應(yīng)用Arrhenius方程：k=Ae^(–Ea/RT)，40℃（313K）下k?=ln(2.1/100)/14day=1.46×10?3day?1；目標(biāo)x=1%，則k?t=ln(1/100)=–4.605；因k?/k?=exp[Ea/R(1/T?–1/T?)]，設(shè)T?=313K不變，需降低k?，但溫度恒定，只能縮短時(shí)間；題目要求≤1%，則t=ln(1/100)/k?=4.605/1.46×10?3≈7.0day，即最小加速時(shí)間7天。32.（16分）某生物藥企業(yè)計(jì)劃將傳統(tǒng)批次培養(yǎng)（Batch）改為強(qiáng)化灌流（IntensifiedPerfusion），需進(jìn)行經(jīng)濟(jì)評(píng)估。已知：批次：5×2000L，每批滴度5g/L，收率70%，年20批，廠房折舊+人工+耗材=$12M/年；灌流：1×500L，細(xì)胞密度80×10?cells/mL，qP=30pg/cell/day，每日收獲400L，下游收率75%，年運(yùn)行300天，設(shè)備折舊+人工=$4M/年，耗材（培養(yǎng)基+膜包）=$2g/L產(chǎn)物。（1）分別計(jì)算兩種模式年DS產(chǎn)量；（2）計(jì)算單位克DS成本；（3）若DS售價(jià)$2000/克，給出兩種模式年毛利潤(rùn)；（4）從質(zhì)量、監(jiān)管、供應(yīng)鏈角度各提一條灌流模式需額外關(guān)注的風(fēng)險(xiǎn)。答案：（1）批次：5×2000L×5g/L×0.7×20=700kg；灌流：400L×（待求濃度C）×0.75×300。先求C：每日產(chǎn)抗體=80×10?cells/mL×500L×30pg/cell=1.2kg/day；C=1.2kg/400L=3g/L；年DS=1.2kg×300×0.75=270kg。（2）批次：$12M/700kg=$17.1/g；灌流：總成本=$4M+$2/g×270kg=$4M+$0.54M=$4.54M，單位成本=$4.54M/270kg=$16.8/g。（3）批次：收入=$2000×700kg=$1400M，毛利=$1400M–$12M=$1388M；灌流：收入=$2000×270kg=$540M，毛利=$540M–$4.54M=$535.46M。