適度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練通過(guò)抑制SHP2誘導(dǎo)的線粒體損傷改善骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展2026骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種退行性關(guān)節(jié)疾病，主要病理特征為關(guān)節(jié)軟骨退變，并可累及包括骨、滑膜、韌帶、肌肉及關(guān)節(jié)周?chē)驹趦?nèi)的多種關(guān)節(jié)組織，引發(fā)關(guān)節(jié)功能障礙、疼痛、僵硬及活動(dòng)能力下降等一系列臨床表現(xiàn)［1］。研究顯示，OA的進(jìn)展受多種因素影響，包括細(xì)胞炎癥反應(yīng)、軟骨基質(zhì)成分改變以及全身代謝狀態(tài)等，共同參與其復(fù)雜的病理過(guò)程［2-3］。盡管維持關(guān)節(jié)軟骨的表型穩(wěn)態(tài)對(duì)關(guān)節(jié)功能至關(guān)重要，調(diào)控軟骨細(xì)胞穩(wěn)定性的具體細(xì)胞與分子機(jī)制尚不完全明確。目前OA的治療主要是早期的藥物干預(yù)以及終末期的手術(shù)治療［4］。在過(guò)去三十年中，康復(fù)鍛煉在緩解膝關(guān)節(jié)OA癥狀方面逐漸顯示出重要作用［5-6］。然而，現(xiàn)有康復(fù)治療體系尚未完善，因此深入探索OA進(jìn)展的分子機(jī)制及優(yōu)化康復(fù)干預(yù)方案具有重要臨床意義。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是指具有計(jì)劃性、目的性和系統(tǒng)性的身體活動(dòng)，旨在改善或維持個(gè)體的生理功能、代謝健康及整體體能［7-8］。在骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)中，運(yùn)動(dòng)可通過(guò)施加機(jī)械應(yīng)力促進(jìn)骨骼、肌肉及軟骨的適應(yīng)性修復(fù)與功能重建［9-10］。大量研究證實(shí)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練在多種慢性疾病管理中具有明確的治療價(jià)值［11-12］。例如，適度運(yùn)動(dòng)（如步行、游泳）可促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成蛋白聚糖與Ⅱ型膠原，從而延緩軟骨退變進(jìn)程［13］。因此，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可作為OA康復(fù)治療的有效補(bǔ)充手段，而其具體作用機(jī)制與分子靶點(diǎn)仍需進(jìn)一步闡明。蛋白酪氨酸磷酸酶-2（SH2domain-containingtyrosinephosphatase2，SHP2）是由非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶11（proteintyrosinephosphatase，non-receptortype11，PTPN11）基因編碼的非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶，參與調(diào)控多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子及整合素受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程［14］。研究表明，SHP2在OA滑膜巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，能夠促進(jìn)M1型促炎巨噬細(xì)胞極化，加劇滑膜炎癥及軟骨損傷；而在巨噬細(xì)胞中特異性敲除SHP2則可減輕炎癥反應(yīng)并延緩疾病進(jìn)展［15］。線粒體作為細(xì)胞能量代謝的核心細(xì)胞器，通過(guò)多種代謝途徑為生命活動(dòng)供能［16］。另外，線粒體功能與炎癥及干細(xì)胞生成等一系列細(xì)胞過(guò)程有關(guān)［17-18］。近年研究發(fā)現(xiàn)，線粒體損傷可激活NOD樣受體家族pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白10（NOD-likereceptorfamily，pyrindomaincontaining10，NLRP10）炎癥小體，導(dǎo)致ASC斑點(diǎn)形成及caspase-1依賴性細(xì)胞因子釋放［19］。另有報(bào)道指出，巨噬細(xì)胞中SHP2的缺失或抑制會(huì)增強(qiáng)NLRP3炎癥小體活化，促進(jìn)促炎因子白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1beta，IL-1β）與IL-18的釋放［20］。盡管已有證據(jù)提示SHP2在巨噬細(xì)胞中可能通過(guò)誘導(dǎo)線粒體損傷參與炎癥發(fā)生，其在軟骨細(xì)胞中調(diào)控炎癥反應(yīng)的具體機(jī)制仍有待明確［21］。綜上所述，本研究提出如下假設(shè)：適度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能通過(guò)抑制SHP2介導(dǎo)的線粒體損傷，從而延緩OA的進(jìn)展。本研究旨在系統(tǒng)闡明SHP2在OA病理進(jìn)程中的作用機(jī)制，以及運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)其表達(dá)的調(diào)控效應(yīng)，以期為OA的康復(fù)治療提供新靶點(diǎn)，并進(jìn)一步完善該疾病的病理機(jī)制理論體系。材料與方法一、實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自普諾賽（Procell，型號(hào)PM150312）；胎牛血清購(gòu)自新西蘭NEWZERUM公司；IL-1β購(gòu)自美國(guó)R&DSystems公司。RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、山羊抗兔/抗鼠二抗及胰蛋白酶均購(gòu)自武漢博士德公司。Ⅱ型膠原酶、番紅O-固綠染色液及多聚甲醛購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒與活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）檢測(cè)試劑DCFH-DA由上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供。磷酸化SHP2（Tyr542，編號(hào)3751）及COX2（編號(hào)12282）抗體購(gòu)自美國(guó)CellSignalingTechnology公司；SHP2（編號(hào)20145-1-AP）、GAPDH（10494-1-AP）、Ⅱ型膠原蛋白α1鏈（collagentypeⅡalpha1chain，COL2A1，28459-1-AP）和基質(zhì)金屬蛋白酶13（matrixmetalloproteinase13，MMP13，18165-1-AP）抗體均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（induciblenitricoxidesynthase，iNOS，A0312）購(gòu)自美國(guó)AffinityBiosciences公司。環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase-2，COX2，12282）購(gòu)自美國(guó)CellSignalingTechnology公司。蛋白印跡電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀和凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。共聚焦顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympusCorporation（日本）。MircoCT掃描儀購(gòu)自SCANCOMedical（瑞士）。二、大鼠軟骨細(xì)胞培養(yǎng)：取出生1周內(nèi)的新生SD乳鼠，于超凈工作臺(tái)內(nèi)分離其膝關(guān)節(jié)軟骨組織并將其剪碎。先后使用胰蛋白酶（37℃、30min）與Ⅱ型膠原酶（37℃、4~5h）分步消化。消化結(jié)束后，以1500rpm離心5min收集細(xì)胞沉淀，使用含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸，接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在同濟(jì)動(dòng)物中心進(jìn)行，并經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（TJH-202412003）。三、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組和干預(yù)方法為了檢測(cè)炎性軟骨細(xì)胞中SHP2的表達(dá)水平，應(yīng)用IL-1β建立炎癥-退行性細(xì)胞模型（使用2.5、5、10ng/mL的IL-1β干預(yù)軟骨細(xì)胞24h）。將軟骨細(xì)胞分為對(duì)照組、低IL-1β濃度干預(yù)組（2.5ng/mL）、中等IL-1β濃度干預(yù)組（5ng/mL）和高IL-1β濃度干預(yù)組（10ng/mL）。為了研究SHP2對(duì)炎性軟骨細(xì)胞的影響，在5ng/mL的IL-1β干預(yù)下用oeSHP2和空載質(zhì)粒（oeNC）干預(yù)細(xì)胞，另外，用siSHP2或?qū)φ湛蛰d（siNC）干預(yù)細(xì)胞再次驗(yàn)證SHP2的功能。為了探討SHP2對(duì)軟骨細(xì)胞線粒體功能的影響，在5ng/mL的IL-1β干預(yù)下敲低SHP2，檢測(cè)細(xì)胞活性氧與線粒體膜電位的變化。四、質(zhì)粒過(guò)表達(dá)與siRNA干預(yù)實(shí)驗(yàn)待細(xì)胞密度達(dá)70%~80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別采用SHP2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及siSHP2進(jìn)行干預(yù)，按照美國(guó)ThermoFisher公司Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明，以O(shè)pti-MEM培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒或siRNA，并加入對(duì)應(yīng)體積的P3000增強(qiáng)劑與Lipofectamine3000，混勻后加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中。轉(zhuǎn)染6~8h后更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24~48h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。SHP2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建；SHP2的小干擾RNA（siRNA）由Genomeditech（中國(guó)上海）合成。五、Westernblot實(shí)驗(yàn)使用按比例配制（RIPA∶磷酸酶抑制劑∶蛋白酶抑制劑∶EDTA=100∶1∶1∶1）的裂解工作液冰上裂解細(xì)胞10min，收集裂解液并于4℃、12000rpm離心30min，取上清即為總蛋白樣品。將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按4∶1比例混合，金屬浴95℃加熱10min使蛋白變性。每孔上樣8~10μg總蛋白，經(jīng)150V恒壓電泳60~80min進(jìn)行蛋白分離，隨后在275mA恒定電流下采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。使用無(wú)蛋白快速封閉液封閉15~20min，隨后加入相應(yīng)一抗，4℃搖床孵育過(guò)夜（18~24h）。TBST洗膜后與對(duì)應(yīng)種屬二抗于室溫?fù)u床共孵育1h，再次洗滌后使用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影并采集圖像。六、DCFH-DA熒光檢測(cè)將細(xì)胞均勻地接種在6孔板中，細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后，根據(jù)細(xì)胞密度配置DCFH-DA染色工作液，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，加入染色工作液共孵育30min，使用DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌。最后在熒光顯微鏡下觀察并捕獲ROS熒光圖像。七、JC-1熒光檢測(cè)：細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后，進(jìn)行JC-1染色以評(píng)估線粒體膜電位。首先配制JC-1染色工作液：取50μLJC-1（200X）儲(chǔ)備液，加入8mL超純水，渦旋振蕩使其充分溶解，隨后加入2mLJC-1染色緩沖液（5×），混勻后備用。同時(shí)，將JC-1染色緩沖液（5×）與超純水按1∶4比例稀釋?zhuān)A(yù)冷制備JC-1染色緩沖液（1×）。細(xì)胞經(jīng)PBS清洗后，每孔加入1mLJC-1工作液，37℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后，棄去工作液，用預(yù)冷的JC-1染色緩沖液（1×）洗滌細(xì)胞2~3次，最后加入2mL完全培養(yǎng)基，于熒光顯微鏡下觀察并采集熒光圖像。八、動(dòng)物分組設(shè)計(jì)與造模處理本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)自武漢鼠來(lái)寶生物科技有限公司，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理與使用委員會(huì)審核批準(zhǔn)（TJH-202412003，中國(guó)武漢）。將18只SD大鼠隨機(jī)分為3組（每組6只）：①SHAM組，僅打開(kāi)膝關(guān)節(jié)腔后即刻縫合；②DMM模型組，通過(guò)離斷內(nèi)側(cè)半月板穩(wěn)定韌帶并切斷前交叉韌帶，構(gòu)建膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)模型；③DMM+跑步訓(xùn)練組，于造模2周后開(kāi)始于電動(dòng)跑臺(tái)進(jìn)行適度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，方案為15m/min，30min/d，每周5d，持續(xù)6周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取大鼠膝關(guān)節(jié)進(jìn)行后續(xù)組織學(xué)與影像學(xué)分析。九、Micro-CT掃描成像

取大鼠左側(cè)膝關(guān)節(jié)樣本，經(jīng)4%多聚甲醛固定48~72h后，使用Micro-CT掃描儀在以下參數(shù)下進(jìn)行掃描：分辨率10.5μm，電壓100kV，電流98μA。掃描完成后，采用ScancoMedical系統(tǒng)配套軟件（ScancoMedical，瑞士）重建脛骨平臺(tái)的CT三維圖像。十、步態(tài)分析采用TreadScan步態(tài)分析系統(tǒng)（CleveSysInc，美國(guó)）評(píng)估大鼠運(yùn)動(dòng)功能。使大鼠在電動(dòng)跑臺(tái)上以15cm/s的速度持續(xù)行走20s，同步采集步態(tài)視頻。將視頻數(shù)據(jù)導(dǎo)入TreadScan分析軟件，系統(tǒng)根據(jù)足部與踏板接觸的平均持續(xù)時(shí)間計(jì)算平均站立時(shí)間；基于足部在整個(gè)站立階段與踏板接觸區(qū)域的平均面積，計(jì)算平均足印面積；并依據(jù)圖像亮度所反映的相對(duì)壓力值，計(jì)算平均足印壓力。隨后，將這些導(dǎo)出的數(shù)據(jù)導(dǎo)入GraphPadPrism10.0軟件，采用One-wayANOVA進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)分析。十一、組織學(xué)染色和免疫組化將膝關(guān)節(jié)進(jìn)行固定、脫鈣與石蠟包埋處理，在標(biāo)準(zhǔn)半月板位置將膝關(guān)節(jié)軟骨切成4μm厚的石蠟切片，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行番紅固綠、HE染色與鏡下拍攝。對(duì)染色切片嚴(yán)格按照國(guó)際骨關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會(huì)（OsteoarthritisResearchSocietyInternational，OARSI）評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估關(guān)節(jié)軟骨退化程度，3位研究人員共同參與評(píng)分。另一部分石臘切片進(jìn)行免疫組化染色?？乖迯?fù)步驟如下：切片經(jīng)脫蠟、水化后，置于盛有足量0.01M檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）的耐熱容器中，確保液面完全覆蓋組織。采用微波爐進(jìn)行熱修復(fù)：首先高火加熱至緩沖液沸騰，隨后轉(zhuǎn)為中低火維持微沸狀態(tài)，并開(kāi)始計(jì)時(shí)，修復(fù)10~15min（全程確保切片被液體浸沒(méi)，防止干片）。修復(fù)結(jié)束后，將容器置于室溫環(huán)境下自然冷卻至室溫。最后，使用PBS（pH7.4）輕柔沖洗切片3次，每次3min。后續(xù)進(jìn)行封閉處理，并與相應(yīng)一抗（1∶200）于4℃下孵育過(guò)夜，孵育結(jié)束后加入二抗并封片，最后通過(guò)熒光顯微鏡觀察并拍攝成像。十二、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析取3~6次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用GraphPadPrism10（GraphPadSoftware，美國(guó)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與圖表制作，對(duì)于參數(shù)檢驗(yàn)，通過(guò)One-wayANOVA進(jìn)行多組間比較。非參數(shù)數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中ns表示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，****表示P＜0.0001。結(jié)

果一、SHP2在OA組織和細(xì)胞模型中高表達(dá)為明確SHP2在OA病理進(jìn)程中的作用，本研究首先通過(guò)免疫組化染色比較了SHAM組與DMM模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中SHP2的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與SHAM組相比，DMM組大鼠軟骨組織中SHP2的表達(dá)顯著升高（圖1a、b）。為進(jìn)一步驗(yàn)證SHP2在炎癥環(huán)境下的反應(yīng)，我們進(jìn)一步探究炎性軟骨細(xì)胞模型中SHP2的表達(dá)情況。Westernblot分析結(jié)果顯示，當(dāng)IL-1β干預(yù)濃度達(dá)到5ng/mL及以上時(shí)，炎癥標(biāo)志物iNOS的蛋白表達(dá)水平顯著上升，而軟骨合成代謝標(biāo)志物COL2A1的表達(dá)則明顯降低，表明在炎癥刺激下軟骨細(xì)胞發(fā)生了代謝失衡，提示炎癥模型構(gòu)建成功。同時(shí)，與空白對(duì)照組相比，IL-1β刺激組中磷酸化SHP2（P-SHP2）的蛋白表達(dá)水平也顯著上升（圖1c、d）。綜上所述，上述結(jié)果提示SHP2的活化可能與OA的疾病進(jìn)展密切相關(guān)。二、SHP2誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝紊亂與炎癥為探究SHP2在OA進(jìn)展中的具體作用，本研究在前期確認(rèn)SHP2與OA相關(guān)性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了SHP2過(guò)表達(dá)對(duì)軟骨細(xì)胞代謝的影響。我們?cè)谡＜把仔原h(huán)境下的軟骨細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SHP2，Westernblot結(jié)果顯示，在IL-1β誘導(dǎo)的炎癥基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)SHP2后，合成代謝標(biāo)志物COL2A1表達(dá)進(jìn)一步下降，分解代謝標(biāo)志物MMP13以及炎癥標(biāo)志物COX2的表達(dá)均進(jìn)一步升高（圖2a、c），表明SHP2過(guò)表達(dá)可加劇軟骨細(xì)胞的代謝紊亂。為驗(yàn)證上述結(jié)果，我們?cè)谘仔愿深A(yù)條件下敲低SHP2，結(jié)果顯示，SHP2敲低顯著抑制了IL-1β所誘導(dǎo)的炎癥標(biāo)志物iNOS和分解代謝標(biāo)志物（MMP13、MMP3）的過(guò)度表達(dá)（圖2b、d），提示敲低SHP2能夠改善IL-1β引起的軟骨細(xì)胞損傷。綜上，本研究結(jié)果表明，SHP2不僅參與OA的病理進(jìn)程，還能夠直接誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞發(fā)生代謝紊亂，進(jìn)一步證實(shí)了SHP2在OA發(fā)展中的促進(jìn)作用。三、SHP2誘導(dǎo)線粒體損傷導(dǎo)致軟骨細(xì)胞炎癥在明確SHP2能夠?qū)е萝浌羌?xì)胞損傷后，我們進(jìn)一步探究了SHP2導(dǎo)致軟骨細(xì)胞損傷的具體機(jī)制。線粒體是生物合成、生物能量和信號(hào)傳導(dǎo)功能的中心，最近的研究表明，線粒體是促進(jìn)炎癥反應(yīng)的中心［22］。首先，我們對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行SHP2敲低與炎癥干預(yù)，并通過(guò)JC-1檢測(cè)線粒體膜電位的改變。結(jié)果表明，相比于空白對(duì)照組，IL-1β干預(yù)后炎性軟骨細(xì)胞中綠色熒光強(qiáng)度占比升高，提示線粒體發(fā)生損傷，而在IL-1β干預(yù)基礎(chǔ)上敲低SHP2逆轉(zhuǎn)了這一變化（圖3a、b）。接著，我們?cè)谕瑯拥母深A(yù)下評(píng)估了軟骨細(xì)胞中總ROS的表達(dá)變化，結(jié)果表明，IL-1β干預(yù)的炎性軟骨細(xì)胞中ROS明顯升高，提示線粒體過(guò)度氧化應(yīng)激，而在IL-1β干預(yù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步敲低SHP2逆轉(zhuǎn)了這一變化（圖3c、d）。因此，我們通過(guò)以上結(jié)果證明了SHP2能夠通過(guò)誘導(dǎo)線粒體損傷導(dǎo)致軟骨細(xì)胞炎癥。四、適度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能緩解DMM大鼠軟骨損傷基于課題組前期研究已證實(shí)的適度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案（速度15m/min，30min/d，每周5d，持續(xù)6周）對(duì)OA具有改善作用［23-24］，本研究將18只雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組，分別進(jìn)行DMM造模與適度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)。干預(yù)結(jié)束后，采用Micro-CT對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)進(jìn)行掃描分析。結(jié)果顯示，與SHAM組相比，DMM組大鼠脛骨平臺(tái)出現(xiàn)明顯磨損，而經(jīng)過(guò)跑步訓(xùn)練的DMM大鼠脛骨平臺(tái)磨損程度顯著減輕（圖4a）。為進(jìn)一步評(píng)估運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)行為功能的影響，我們對(duì)大鼠進(jìn)行了步態(tài)分析。結(jié)果顯示，DMM模型組大鼠表現(xiàn)出明顯的步態(tài)不穩(wěn)，具體表現(xiàn)為平均站立時(shí)間、平均足印面積及平均足印壓力均顯著減??；而經(jīng)適度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的DMM大鼠上述步態(tài)參數(shù)均得到明顯改善（圖4b、c）。綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)，適度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠有效緩解DMM大鼠的軟骨結(jié)構(gòu)損傷并改善其步態(tài)穩(wěn)定性。五、適度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以通過(guò)下調(diào)SHP2表達(dá)改善OA在完成步態(tài)分析與Micro-CT檢測(cè)后，收集大鼠膝關(guān)節(jié)組織，經(jīng)固定、脫鈣及石蠟包埋后切片，分別進(jìn)行番紅O-固綠染色、HE染色和免疫組化分析。番紅O-固綠染色結(jié)果顯示，與SHAM組相比，DMM模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，OARSI評(píng)分顯著升高，提示軟骨發(fā)生明顯損傷；而經(jīng)過(guò)適度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的DMM組大鼠軟骨損傷程度明顯減輕（圖5a、b）。免疫組化結(jié)果進(jìn)一步顯示，DMM模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中分解代謝標(biāo)志物MMP13表達(dá)增加，合成代謝標(biāo)志物COL2A1表達(dá)下降，表明軟骨出現(xiàn)退行性改變；而在適度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的DMM大鼠中，上述異常表達(dá)均得到明顯改善（圖5c、d）。另外適度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練明顯降低了DMM大鼠軟骨組織中SHP2的表達(dá)（圖1a、b）。綜上所述，本研究結(jié)果一致表明，適度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練通過(guò)抑制SHP2的表達(dá)，緩解軟骨退變過(guò)程，從而改善OA的病理進(jìn)展。討

論OA的病理進(jìn)程涉及復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)，其中軟骨細(xì)胞的代謝穩(wěn)態(tài)失衡與炎癥是核心環(huán)節(jié)［25］。近年來(lái)有研究指出，SHP2（由PTPN11基因編碼）作為一種重要的非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶，在多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用［26］。最新研究表明，SHP2可通過(guò)直接或間接方式參與調(diào)控線粒體功能，影響細(xì)胞代謝和炎癥反應(yīng)過(guò)程［20，27］。但在軟骨細(xì)胞中SHP2是否參與OA進(jìn)展以及其中具體的作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究首先確認(rèn)了SHP2是OA病理環(huán)境中的一個(gè)敏感分子。在IL-1β誘導(dǎo)的炎性軟骨細(xì)胞及DMM模型大鼠的關(guān)節(jié)軟骨中，SHP2的磷酸化及蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)，提示其活性增強(qiáng)與OA進(jìn)程密切相關(guān)。更重要的是，功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SHP2的異?；罨荗A的一個(gè)致病驅(qū)動(dòng)因素，而非伴隨現(xiàn)象。過(guò)表達(dá)SHP2足以加劇炎癥下的代謝失衡，而敲低SHP2則能有效逆轉(zhuǎn)這一過(guò)程。這表明，SHP2在OA中扮演了重要角色，其狀態(tài)與表達(dá)水平直接影響了軟骨細(xì)胞的病理進(jìn)展。在機(jī)制層面，本研究的關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)在于，SHP2通過(guò)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞線粒體損傷，充當(dāng)了連接炎癥與線粒體功能之間的橋梁。線粒體作為細(xì)胞的能量代謝中心，其功能完整性對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。近年研究表明，線粒體不僅是ATP合成的主要場(chǎng)所，還參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程［28］。在OA的病理進(jìn)程中，線粒體功能障礙表現(xiàn)為電子傳遞鏈異常、膜電位降低以及ROS過(guò)度積累，這些變化可進(jìn)一步激活NLRP3炎癥小體等關(guān)鍵炎癥信號(hào)通路，促進(jìn)IL-1β、IL-18等促炎因子的釋放，最終加劇軟骨細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)降解［29-30］。值得注意的是，線粒體損傷與OA進(jìn)展之間形成了惡性循環(huán)：炎癥微環(huán)境會(huì)加重線粒體功能障礙，而受損的線粒體又會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)［31］。在這些研究的基礎(chǔ)上，本研究發(fā)現(xiàn)敲低SHP2能顯著改善IL-1β引起的線粒體膜電位下降和ROS過(guò)度累積。這一結(jié)果強(qiáng)烈提示，SHP2是上游的調(diào)控因子，其活化通過(guò)誘導(dǎo)線粒體功能障礙導(dǎo)致了軟骨細(xì)胞炎癥的發(fā)生。這為OA的病理機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的闡明與補(bǔ)充。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練作為一種重要的非藥物干預(yù)手段，其作用機(jī)制主要體現(xiàn)在通過(guò)機(jī)械應(yīng)力刺激促進(jìn)軟骨細(xì)胞的適應(yīng)性修復(fù)［32］。研究表明，機(jī)械負(fù)荷能夠激活軟骨細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路，從而促進(jìn)軟骨基質(zhì)中Ⅱ型膠原和蛋白聚糖等關(guān)鍵成分的合成［33］。這些細(xì)胞外基質(zhì)成分對(duì)于維持軟骨組織的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。目前，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練在OA中的作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步闡明。本研究通過(guò)細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，適度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可通過(guò)抑制SHP2的表達(dá)與活化，緩解線粒體損傷，從而延緩OA的進(jìn)展。這一發(fā)現(xiàn)不僅揭示了SHP2在OA軟骨細(xì)胞中的關(guān)鍵致病作用，更重要的是，它闡明了一種連接機(jī)械生物學(xué)與細(xì)胞代謝的全新保護(hù)性機(jī)制，為OA的康復(fù)治療提供了新的理論依據(jù)和潛在干預(yù)靶點(diǎn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了適度運(yùn)動(dòng)在OA治療中的重要性。另外，在運(yùn)動(dòng)方式的選擇上，大量臨床研究證實(shí)，低沖擊性運(yùn)動(dòng)如步行、游泳和水療等能夠顯著上調(diào)軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的表達(dá)水平，同時(shí)降低基質(zhì)