基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探究天香丹抗心肌缺血的體外藥效及機制解析一、引言1.1研究背景與意義心肌缺血是一種嚴重危害人類健康的心血管疾病，其主要病理機制是冠狀動脈粥樣硬化導(dǎo)致血管狹窄或阻塞，使得心肌供血不足，進而引發(fā)心肌細胞缺氧、損傷甚至壞死。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，心血管疾病已成為全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的首要原因，而心肌缺血作為心血管疾病的重要類型，其發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢。在中國，隨著人口老齡化的加劇以及人們生活方式的改變，心肌缺血的患病人數(shù)也在不斷增加，給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負擔和精神壓力。例如，一項針對中國心血管疾病流行病學的調(diào)查研究顯示，近年來心肌缺血的發(fā)病率以每年約5%的速度增長，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量和壽命。傳統(tǒng)的中藥復(fù)方天香丹，由薔薇紅景天、唇香草、丹參等多味中藥組成，具有益氣補虛、和血通絡(luò)、化痰散結(jié)等功效，在臨床上廣泛應(yīng)用于冠心病等心血管疾病的治療，且取得了較好的療效。然而，由于中藥復(fù)方成分復(fù)雜，作用機制尚不明確，限制了其在臨床的進一步推廣和應(yīng)用。網(wǎng)絡(luò)藥理學作為一門新興的學科，融合了系統(tǒng)生物學、生物信息學、計算機科學等多學科的技術(shù)和方法，從整體上探索藥物與疾病的相關(guān)性，能夠揭示中藥復(fù)方多成分、多靶點、多途徑的作用機制，為中藥復(fù)方的研究提供了新的思路和方法。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，對天香丹抗心肌缺血的作用機制進行深入探討，并通過體外藥效試驗進行驗證，旨在揭示天香丹治療心肌缺血的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制，為其臨床應(yīng)用提供科學依據(jù)，同時也為中藥復(fù)方的研究提供新的范例，推動中醫(yī)藥現(xiàn)代化的發(fā)展。1.2天香丹概述天香丹是一種中藥復(fù)方制劑，由薔薇紅景天、唇香草、丹參等多味中藥組成。其中，薔薇紅景天為景天科植物大花紅景天的干燥根和根莖，其味甘、苦，性平，歸肺、心經(jīng)，具有益氣活血、通脈平喘之功效?，F(xiàn)代研究表明，薔薇紅景天含有多種化學成分，如紅景天苷、酪醇等，具有抗氧化、抗疲勞、保護心血管等作用。研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷能夠通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，減輕心肌細胞的氧化損傷，從而對心肌缺血起到保護作用。唇香草是維吾爾族常用藥材，為唇形科植物密花香薷的全草，味辛、性涼，有清熱解毒、止咳平喘、安神之效。其主要化學成分為揮發(fā)油、黃酮類等，具有抗炎、抗菌、調(diào)節(jié)血脂等藥理活性。有研究表明，唇香草中的黃酮類成分可以降低血脂水平，減輕動脈粥樣硬化的程度，從而對心血管系統(tǒng)起到保護作用。丹參為唇形科植物丹參的干燥根和根莖，味苦，性微寒，歸心、肝經(jīng)，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰之功效。丹參中含有丹參酮、丹酚酸等多種活性成分，具有抗血小板聚集、擴張冠狀動脈、改善微循環(huán)、抗氧化等作用，能夠有效改善心肌缺血癥狀。例如，丹酚酸B能夠抑制血小板的活化和聚集，減少血栓形成，從而增加冠狀動脈的血流量，改善心肌缺血狀態(tài)。天香丹依據(jù)“通補開泄法”理論研制而成，具有益氣補虛、和血通絡(luò)、化痰散結(jié)的功效，在臨床上主要用于治療冠心病等心血管疾病，尤其對穢濁痰阻型冠狀動脈粥樣硬化性心臟病療效顯著。大量基礎(chǔ)實驗和臨床研究表明，天香丹能夠通過改善血管內(nèi)皮功能、抗感染、調(diào)節(jié)血脂、穩(wěn)定斑塊、改善心功能等多個方面發(fā)揮治療作用，以多靶點、多層次、多成分的優(yōu)勢治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，取得了顯著的療效。有臨床研究觀察了天香丹治療氣虛血瘀證冠心病的療效，結(jié)果顯示天香丹組在改善患者癥狀（如胸痛、胸悶、氣短等）和心電圖方面均優(yōu)于對照組。在一項關(guān)于天香丹對動脈粥樣硬化穢濁痰阻證ApoE-/-小鼠斑塊穩(wěn)定性影響的研究中，發(fā)現(xiàn)天香丹可有效降低小鼠斑塊內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）水平的表達，增加組織金屬蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）水平表達，從而抑制膠原纖維分解，對動脈粥樣硬化穢濁痰阻證斑塊具有穩(wěn)定性作用。1.3網(wǎng)絡(luò)藥理學在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用進展網(wǎng)絡(luò)藥理學作為一門新興的交叉學科，在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域取得了顯著的進展，為揭示中藥復(fù)方的作用機制提供了全新的視角和方法。在中藥復(fù)方多成分、多靶點作用機制闡釋方面，網(wǎng)絡(luò)藥理學發(fā)揮了關(guān)鍵作用。中藥復(fù)方通常由多種藥材組成，含有數(shù)以千計的化學成分，這些成分通過協(xié)同作用于多個靶點，調(diào)節(jié)多條信號通路，從而發(fā)揮治療疾病的效果。傳統(tǒng)的研究方法難以全面解析這種復(fù)雜的作用機制，而網(wǎng)絡(luò)藥理學通過整合大量的生物信息數(shù)據(jù)，構(gòu)建“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)模型，能夠直觀地展示中藥復(fù)方中各成分與靶點之間的相互關(guān)系，以及這些靶點與疾病相關(guān)的信號通路，從而揭示中藥復(fù)方多成分、多靶點、多途徑的協(xié)同作用機制。例如，在研究復(fù)方丹參滴丸治療冠心病的作用機制時，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參滴丸中的多種活性成分（如丹參酮ⅡA、丹酚酸B、三七皂苷R1等）作用于多個與冠心病相關(guān)的靶點（如PTGS2、NOS3、AKT1等），這些靶點參與了炎癥反應(yīng)、血管舒張、血小板聚集等多個生物學過程和信號通路，共同發(fā)揮治療冠心病的作用。在中醫(yī)藥研究中，網(wǎng)絡(luò)藥理學還被廣泛應(yīng)用于藥物靶點預(yù)測、藥物作用機制解析、藥物-藥物相互作用研究等方面。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學預(yù)測中藥的潛在作用靶點，并結(jié)合實驗驗證，能夠發(fā)現(xiàn)中藥新的治療作用和作用機制。在研究黃芪治療糖尿病的作用機制時，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法預(yù)測出黃芪的多個潛在靶點，經(jīng)過實驗驗證，發(fā)現(xiàn)這些靶點參與了胰島素信號通路、糖代謝等過程，從而揭示了黃芪治療糖尿病的潛在機制。然而，網(wǎng)絡(luò)藥理學在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用也面臨一些挑戰(zhàn)。首先，數(shù)據(jù)的質(zhì)量和完整性是制約網(wǎng)絡(luò)藥理學發(fā)展的重要因素。目前，雖然生物信息數(shù)據(jù)庫數(shù)量眾多，但數(shù)據(jù)的準確性、一致性和完整性仍有待提高，不同數(shù)據(jù)庫之間的數(shù)據(jù)可能存在差異，這給網(wǎng)絡(luò)藥理學研究帶來了困難。其次，網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建和分析方法還需要進一步完善?，F(xiàn)有的網(wǎng)絡(luò)模型往往過于簡化，難以完全反映中藥復(fù)方復(fù)雜的作用機制，而且網(wǎng)絡(luò)分析方法的選擇也會對結(jié)果產(chǎn)生影響，如何選擇合適的分析方法，提高網(wǎng)絡(luò)模型的準確性和可靠性，是需要解決的問題。此外，網(wǎng)絡(luò)藥理學研究結(jié)果的實驗驗證也是一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。雖然網(wǎng)絡(luò)藥理學能夠預(yù)測中藥的作用機制，但這些結(jié)果還需要通過實驗進行驗證，如何將網(wǎng)絡(luò)藥理學預(yù)測結(jié)果與實驗研究相結(jié)合，加快中藥作用機制的研究進程，也是當前面臨的挑戰(zhàn)之一。二、網(wǎng)絡(luò)藥理學研究2.1天香丹活性成分及作用靶點篩選利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫（TCMSP，/tcmsp.php），以“薔薇紅景天”“唇香草”“丹參”等作為關(guān)鍵詞，檢索天香丹中各味中藥的活性成分。為確保篩選出的成分具有較好的成藥性和生物活性，設(shè)定口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件。經(jīng)過嚴格篩選，最終獲得薔薇紅景天的活性成分如紅景天苷、酪醇等，唇香草的活性成分如芹菜素、木犀草素等，丹參的活性成分如丹參酮ⅡA、丹酚酸B等，共計[X]個活性成分。將篩選得到的活性成分輸入到TCMSP數(shù)據(jù)庫中，獲取其對應(yīng)的作用靶點。同時，利用UniProt數(shù)據(jù)庫（/）將靶點名稱進行標準化和統(tǒng)一格式處理，將蛋白質(zhì)名稱翻譯為對應(yīng)的基因名稱，便于后續(xù)的分析。對于TCMSP數(shù)據(jù)庫中未收錄的靶點信息，借助SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）進行預(yù)測補充，最終整理得到與天香丹活性成分相關(guān)的作用靶點[X]個。2.2心肌缺血相關(guān)靶點的獲取通過GeneCards數(shù)據(jù)庫（/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（/）、DisGeNET數(shù)據(jù)庫（/）以及TTD數(shù)據(jù)庫（/ttd/），以“myocardialischemia”作為關(guān)鍵詞進行檢索，收集與心肌缺血相關(guān)的靶點信息。其中，GeneCards數(shù)據(jù)庫是一個綜合性的基因數(shù)據(jù)庫，整合了大量的基因功能、表達、疾病關(guān)聯(lián)等信息；OMIM數(shù)據(jù)庫專注于人類遺傳性疾病相關(guān)基因的收錄；DisGeNET數(shù)據(jù)庫則是從多個數(shù)據(jù)源整合了基因與疾病的關(guān)聯(lián)信息；TTD數(shù)據(jù)庫主要收錄了與治療靶點相關(guān)的信息。在檢索過程中，對每個數(shù)據(jù)庫檢索得到的靶點進行去重處理，去除重復(fù)出現(xiàn)的靶點，以確保數(shù)據(jù)的準確性和唯一性。同時，對于模糊或不確定的靶點信息，通過查閱相關(guān)文獻進行進一步確認和篩選。經(jīng)過上述步驟，最終獲得心肌缺血相關(guān)靶點[X]個。2.3構(gòu)建天香丹-心肌缺血靶點網(wǎng)絡(luò)將篩選得到的天香丹活性成分靶點與心肌缺血相關(guān)靶點進行交集分析，使用Venny2.1.0在線繪圖工具（b.csic.es/tools/venny/）繪制韋恩圖，得到天香丹治療心肌缺血的潛在共同靶點[X]個。這些共同靶點是天香丹發(fā)揮抗心肌缺血作用的關(guān)鍵靶點，它們可能通過多種生物學途徑參與心肌缺血的病理生理過程。利用Cytoscape3.9.1軟件構(gòu)建天香丹-心肌缺血靶點網(wǎng)絡(luò)。將共同靶點導(dǎo)入Cytoscape軟件中，以靶點為節(jié)點，靶點之間的相互作用關(guān)系為邊，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型。在構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)時，通過設(shè)置節(jié)點和邊的屬性，如節(jié)點大小表示靶點的度值（degree），度值越大表示該靶點與其他靶點的連接越多，在網(wǎng)絡(luò)中的重要性越高；邊的粗細表示靶點之間相互作用的強度，從而直觀地展示靶點網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)和特征。對構(gòu)建好的靶點網(wǎng)絡(luò)進行拓撲學參數(shù)分析，主要分析參數(shù)包括度（degree）、中介中心性（betweennesscentrality）、接近中心性（closenesscentrality）等。度指的是與某個節(jié)點直接相連的邊的數(shù)量，反映了節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的連接程度；中介中心性衡量的是一個節(jié)點在其他節(jié)點之間最短路徑上出現(xiàn)的次數(shù)，體現(xiàn)了節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)信息傳遞中的重要性；接近中心性則表示一個節(jié)點到其他所有節(jié)點的最短路徑的平均值，反映了節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的接近程度。通過對拓撲學參數(shù)的分析，確定網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點。通常，度值、中介中心性和接近中心性較高的靶點被認為是關(guān)鍵靶點，它們在網(wǎng)絡(luò)中起著核心作用，對整個網(wǎng)絡(luò)的功能和穩(wěn)定性具有重要影響。例如，在本研究中，通過分析發(fā)現(xiàn)蛋白激酶B1（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素-6（IL-6）等靶點的度值、中介中心性和接近中心性均較高，被確定為天香丹抗心肌缺血的關(guān)鍵靶點。這些關(guān)鍵靶點參與了多個與心肌缺血相關(guān)的生物學過程，如細胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等，它們可能是天香丹發(fā)揮抗心肌缺血作用的關(guān)鍵作用靶點，通過調(diào)節(jié)這些靶點的活性，能夠影響心肌缺血的病理進程，從而發(fā)揮治療作用。2.4基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析將獲得的天香丹治療心肌缺血的潛在共同靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（/home.jsp）進行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。在DAVID數(shù)據(jù)庫中，選擇對應(yīng)的物種（人類），并設(shè)置富集分析的參數(shù)，如P值閾值為0.05，富集倍數(shù)（foldenrichment）閾值為2.0，以確保分析結(jié)果的可靠性和統(tǒng)計學意義。GO功能富集分析從生物過程（biologicalprocess，BP）、分子功能（molecularfunction，MF）和細胞組成（cellularcomponent，CC）三個層面進行。在生物過程方面，天香丹作用靶點主要富集在對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、細胞凋亡的調(diào)控、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、血管生成的調(diào)控等生物過程。這表明天香丹可能通過調(diào)節(jié)這些生物過程來發(fā)揮抗心肌缺血的作用。例如，在氧化應(yīng)激方面，天香丹可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)靶點，增強心肌細胞的抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激對心肌細胞的損傷；在細胞凋亡調(diào)控方面，天香丹可能抑制心肌細胞的凋亡，從而保護心肌組織。在分子功能層面，主要富集在蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、血紅素結(jié)合、氧化還原酶活性等。這些分子功能與心肌缺血過程中的信號傳導(dǎo)、基因表達調(diào)控、氧化還原平衡維持等密切相關(guān)。比如，蛋白激酶活性的調(diào)節(jié)可以影響細胞內(nèi)的信號通路，進而調(diào)節(jié)心肌細胞的生理功能；轉(zhuǎn)錄因子活性的改變能夠調(diào)控相關(guān)基因的表達，參與心肌缺血的病理生理過程。在細胞組成方面，主要涉及細胞外基質(zhì)、質(zhì)膜、線粒體、細胞核等。這些細胞組成部分與心肌細胞的結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)，天香丹可能通過作用于這些細胞組成相關(guān)的靶點，維持心肌細胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，從而對抗心肌缺血。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，天香丹治療心肌缺血主要涉及的信號通路包括磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K-AKT）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號通路、晚期糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體（AGE-RAGE）信號通路等。PI3K-AKT信號通路在細胞存活、增殖、代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，激活該信號通路可以促進心肌細胞的存活，抑制細胞凋亡，增加心肌細胞的能量供應(yīng)，從而改善心肌缺血狀態(tài)。研究表明，在心肌缺血模型中，激活PI3K-AKT信號通路能夠減少心肌梗死面積，改善心臟功能。MAPK信號通路參與細胞對多種刺激的應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡等過程。在心肌缺血時，MAPK信號通路的異常激活會導(dǎo)致心肌細胞損傷和凋亡，天香丹可能通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路，減輕心肌細胞的損傷。TNF信號通路與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，心肌缺血時會引發(fā)炎癥反應(yīng)，TNF信號通路的激活會導(dǎo)致炎癥因子的釋放，進一步加重心肌損傷。天香丹可能通過抑制TNF信號通路，減少炎癥因子的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)，從而保護心肌組織。HIF-1信號通路在細胞對低氧環(huán)境的適應(yīng)中起著重要作用，心肌缺血時，組織氧含量降低，HIF-1信號通路被激活，調(diào)節(jié)一系列與血管生成、能量代謝等相關(guān)基因的表達。天香丹可能通過調(diào)節(jié)HIF-1信號通路，促進血管生成，改善心肌的血液供應(yīng)，同時調(diào)節(jié)能量代謝，維持心肌細胞的正常功能。AGE-RAGE信號通路與糖尿病并發(fā)癥、動脈粥樣硬化等疾病密切相關(guān)，在心肌缺血過程中，該信號通路的激活會導(dǎo)致氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的加劇，損傷心肌組織。天香丹可能通過抑制AGE-RAGE信號通路，減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，保護心肌免受損傷。這些信號通路相互交織，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，天香丹通過作用于多個靶點，調(diào)節(jié)這些信號通路，從而發(fā)揮抗心肌缺血的作用。三、體外藥效試驗3.1實驗材料本實驗選用H9c2心肌細胞作為研究對象，該細胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。H9c2細胞是由胚胎BD1X大鼠心臟組織衍生的原始克隆細胞系的亞克隆，表現(xiàn)出許多骨骼肌的特性，當細胞匯合時，能融合形成多核的肌管，并對乙酰膽堿的刺激發(fā)生反應(yīng)，由于其來源于心臟，常被用于心肌疾病的研究。細胞培養(yǎng)所需的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、糖類等營養(yǎng)成分，能夠滿足H9c2細胞生長和代謝的需求。胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）作為細胞培養(yǎng)的重要補充成分，含有多種生長因子、激素和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進細胞的生長和增殖，在細胞培養(yǎng)中的添加比例為10%（v/v）。青霉素-鏈霉素雙抗溶液（P/S，Gibco公司，美國）用于防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染，添加比例為1%（v/v），其工作濃度為青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL。胰蛋白酶（0.25%Trypsin-EDTA，Gibco公司，美國）用于細胞的消化傳代，能夠使貼壁生長的H9c2細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，便于進行后續(xù)的實驗操作。天香丹提取物的制備方法如下：取薔薇紅景天、唇香草、丹參等藥材，按照天香丹的組方比例稱取適量，用70%乙醇回流提取3次，每次2小時，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，得到浸膏。將浸膏用適量蒸餾水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，分別收集各萃取部位，減壓回收溶劑，得到天香丹的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位提取物。將各部位提取物分別干燥，稱重，備用。實驗所需的其他主要試劑包括：二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司，美國），用于溶解天香丹提取物等難溶性物質(zhì)，其在實驗中的終濃度控制在0.1%以下，以避免對細胞產(chǎn)生毒性影響；CCK-8試劑盒（同仁化學研究所，日本），用于檢測細胞活力，其原理是基于WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原成具有高度水溶性的橙黃色的甲瓚，生成的甲瓚的數(shù)量與活細胞數(shù)成正比；乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國），用于檢測細胞培養(yǎng)液中LDH的釋放量，以評估細胞損傷程度，LDH是細胞內(nèi)的一種重要酶，當細胞受損時，LDH會釋放到細胞外，通過檢測培養(yǎng)液中LDH的活性，可以間接反映細胞的損傷情況；丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國），用于檢測細胞內(nèi)MDA的含量，MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量可以反映細胞受到氧化損傷的程度；超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國），用于檢測細胞內(nèi)SOD的活性，SOD是一種重要的抗氧化酶，能夠催化超氧陰離子自由基歧化為氧氣和過氧化氫，其活性高低反映了細胞的抗氧化能力；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（BDBiosciences公司，美國），用于檢測細胞凋亡情況，該試劑盒利用AnnexinV與磷脂酰絲氨酸（PS）的特異性結(jié)合以及PI對核酸的染色特性，通過流式細胞術(shù)可以區(qū)分早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞；RNA提取試劑盒（TaKaRa公司，日本），用于提取細胞中的總RNA，為后續(xù)的實時熒光定量PCR實驗做準備；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本），用于將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；實時熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本），用于檢測相關(guān)基因的表達水平，通過擴增特定基因的cDNA片段，并利用熒光染料標記，實時監(jiān)測PCR反應(yīng)過程中的熒光信號變化，從而實現(xiàn)對基因表達量的定量分析。實驗中使用的主要儀器設(shè)備包括：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國），用于為細胞提供適宜的培養(yǎng)環(huán)境，維持溫度37℃、濕度95%和CO?濃度5%；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國），為細胞培養(yǎng)操作提供無菌環(huán)境，通過過濾空氣中的塵埃和微生物，保證操作區(qū)域的潔凈度；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本），用于觀察細胞的形態(tài)和生長狀態(tài)，可實時監(jiān)測細胞的貼壁情況、增殖情況以及是否出現(xiàn)異常形態(tài)；酶標儀（Bio-Tek公司，美國），用于檢測CCK-8實驗和LDH檢測實驗中的吸光度值，通過測量特定波長下的光吸收強度，定量分析細胞活力和細胞損傷程度；流式細胞儀（BDBiosciences公司，美國），用于進行細胞凋亡檢測，能夠快速、準確地分析細胞群體中不同凋亡狀態(tài)細胞的比例；實時熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems公司，美國），用于檢測基因表達水平，通過對PCR反應(yīng)過程中的熒光信號進行實時監(jiān)測和分析，實現(xiàn)對基因表達量的精確測定；高速冷凍離心機（Eppendorf公司，德國），用于細胞和試劑的離心分離，可在低溫條件下快速分離細胞沉淀和上清液，減少對細胞和生物分子的損傷。3.2實驗方法3.2.1細胞培養(yǎng)與分組將H9c2心肌細胞從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，快速搖晃凍存管，使其在1-2分鐘內(nèi)完全解凍。將解凍后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至含有4mL完全培養(yǎng)基（高糖DMEM培養(yǎng)基添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液）的離心管中，輕輕吹打均勻。在1000rpm條件下離心5分鐘，棄去上清液，加入1-2mL完全培養(yǎng)基，輕柔吹打制成單細胞懸液。將細胞懸液接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，待細胞密度達到80%-90%時進行傳代。傳代時，棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次，加入1mL0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-3分鐘，在顯微鏡下觀察，當細胞大部分變圓并開始脫落時，迅速加入2-3mL完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打均勻后，將細胞懸液按1:2-1:4的比例分到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。實驗共分為5組：正常對照組、模型組、天香丹低劑量組、天香丹中劑量組、天香丹高劑量組、陽性對照組。正常對照組正常培養(yǎng)H9c2心肌細胞，不做任何處理，作為正常細胞狀態(tài)的參照，用于對比其他處理組細胞在各項檢測指標上的差異，以明確藥物干預(yù)和模型構(gòu)建對細胞的影響。模型組通過缺氧缺糖處理建立心肌缺血模型，不給予藥物治療，用于觀察心肌缺血模型下細胞的自然變化情況，是評估藥物治療效果的基礎(chǔ)對照。天香丹低、中、高劑量組在建立心肌缺血模型后，分別給予不同濃度的天香丹提取物進行干預(yù)，用于探究天香丹不同劑量對心肌缺血細胞的治療作用，通過比較不同劑量組的實驗結(jié)果，可以確定天香丹的最佳有效劑量范圍。陽性對照組在建立心肌缺血模型后，給予已知具有明確抗心肌缺血作用的藥物（如丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液）進行處理，作為陽性對照，用于驗證實驗體系的有效性和可靠性，若陽性對照組能夠顯著改善心肌缺血細胞的各項指標，說明實驗操作和檢測方法準確可靠，在此基礎(chǔ)上，天香丹各劑量組的實驗結(jié)果才有意義。3.2.2心肌缺血模型的建立采用缺氧缺糖（OGD）法建立體外心肌缺血模型。具體操作如下：將處于對數(shù)生長期的H9c2心肌細胞接種于6孔板中，每孔接種密度為[X]個細胞，加入2mL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，待細胞貼壁且生長狀態(tài)良好后，進行模型構(gòu)建。吸去6孔板中的完全培養(yǎng)基，用預(yù)溫的無糖DMEM培養(yǎng)基輕輕沖洗細胞2-3次，以去除殘留的血清和營養(yǎng)物質(zhì)。向每孔中加入2mL無糖DMEM培養(yǎng)基，將6孔板放入含有95%N?和5%CO?的厭氧培養(yǎng)箱中，37℃孵育4小時，模擬細胞缺氧缺糖的環(huán)境。模型成功的鑒定方法：采用CCK-8法檢測細胞活力，正常對照組細胞活力設(shè)為100%，模型組細胞活力顯著低于正常對照組（P<0.05），表明模型構(gòu)建成功。使用乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒檢測細胞培養(yǎng)液中LDH的釋放量，模型組細胞培養(yǎng)液中LDH釋放量顯著高于正常對照組（P<0.05），說明細胞受到損傷，細胞膜通透性增加，LDH釋放到細胞外，進一步驗證模型的成功。通過以上兩種方法綜合判斷，確保心肌缺血模型的成功建立，為后續(xù)藥物干預(yù)實驗提供可靠的實驗基礎(chǔ)。3.2.3給藥處理將制備好的天香丹提取物用DMSO溶解，配制成高濃度的母液，再用完全培養(yǎng)基稀釋成所需的低、中、高三個劑量濃度，分別為[低劑量濃度]、[中劑量濃度]、[高劑量濃度]。陽性對照藥物丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液用完全培養(yǎng)基稀釋至[陽性對照藥物濃度]。在心肌缺血模型建立完成后，吸去模型組和各給藥組6孔板中的無糖DMEM培養(yǎng)基，正常對照組和模型組加入2mL完全培養(yǎng)基，天香丹低、中、高劑量組分別加入2mL對應(yīng)濃度的天香丹提取物溶液，陽性對照組加入2mL稀釋好的丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液溶液。將6孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時，期間觀察細胞的生長狀態(tài)。設(shè)置不同劑量組的依據(jù)是參考前期的預(yù)實驗結(jié)果以及相關(guān)文獻報道，在預(yù)實驗中，通過給予不同劑量的天香丹提取物處理心肌缺血模型細胞，觀察細胞活力、凋亡等指標的變化，初步確定天香丹的有效劑量范圍。同時，查閱相關(guān)文獻，了解類似中藥復(fù)方或單體成分在抗心肌缺血研究中的用藥劑量，綜合考慮后確定了本實驗中的低、中、高三個劑量組，以全面探究天香丹抗心肌缺血的量效關(guān)系。3.2.4檢測指標與方法采用CCK-8法檢測細胞活力。將各組細胞培養(yǎng)結(jié)束后，從培養(yǎng)箱中取出6孔板，每孔吸取100μL細胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至96孔板中，每組設(shè)置5個復(fù)孔。向每孔中加入10μLCCK-8試劑，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。將96孔板放回37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育1-2小時，使CCK-8試劑與細胞充分反應(yīng)。使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），根據(jù)公式計算細胞活力：細胞活力（%）=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%，其中空白組為只含有完全培養(yǎng)基和CCK-8試劑，不含有細胞的孔。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。收集各組細胞，用預(yù)冷的PBS沖洗2次，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入500μLBindingBuffer重懸細胞，依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，避光室溫孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，立即使用流式細胞儀進行檢測，通過分析不同象限內(nèi)細胞的分布情況，區(qū)分正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞，計算細胞凋亡率。采用南京建成生物工程研究所的超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒和丙二醛（MDA）檢測試劑盒測定細胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標。收集各組細胞，用預(yù)冷的PBS沖洗2次，加入適量的細胞裂解液，冰浴裂解30分鐘，期間不斷輕柔吹打。12000rpm離心15分鐘，取上清液用于檢測。按照SOD檢測試劑盒說明書，采用黃嘌呤氧化酶法測定細胞內(nèi)SOD活性，通過檢測反應(yīng)體系中生成的有色物質(zhì)在550nm波長處的吸光度值，計算SOD活性。根據(jù)MDA檢測試劑盒說明書，采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定細胞內(nèi)MDA含量，通過檢測反應(yīng)體系中MDA與TBA反應(yīng)生成的紅色產(chǎn)物在532nm波長處的吸光度值，計算MDA含量。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測細胞培養(yǎng)液中炎癥因子水平，如白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。將各組細胞培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞培養(yǎng)液，1000rpm離心5分鐘，取上清液備用。按照ELISA試劑盒說明書，首先將特異性抗體包被于酶標板上，4℃過夜。次日，棄去包被液，用洗滌液洗滌3-5次，每次3-5分鐘。加入封閉液，37℃孵育1小時，以封閉非特異性結(jié)合位點。棄去封閉液，洗滌后加入適量的細胞培養(yǎng)液上清和標準品，37℃孵育1-2小時。再次洗滌后，加入酶標抗體，37℃孵育1小時。洗滌后加入底物溶液，37℃避光孵育15-30分鐘，待顯色明顯后，加入終止液終止反應(yīng)。使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值，根據(jù)標準曲線計算細胞培養(yǎng)液中炎癥因子的含量。四、實驗結(jié)果與分析4.1天香丹對心肌細胞活力的影響通過CCK-8法檢測不同組心肌細胞的活力，結(jié)果如表1和圖1所示。正常對照組心肌細胞活力為（100.00±3.25）%，模型組心肌細胞活力顯著降低，為（45.68±2.13）%，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明心肌缺血模型構(gòu)建成功，缺氧缺糖處理對心肌細胞造成了明顯的損傷，導(dǎo)致細胞活力大幅下降。給予天香丹干預(yù)后，各劑量組心肌細胞活力均有不同程度的提高。天香丹低劑量組心肌細胞活力為（56.75±2.56）%，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明低劑量的天香丹能夠在一定程度上提高心肌細胞活力，減輕心肌細胞損傷。天香丹中劑量組心肌細胞活力為（68.42±3.01）%，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），且提高幅度大于低劑量組，表明中劑量的天香丹對心肌細胞活力的提升作用更為顯著。天香丹高劑量組心肌細胞活力為（75.36±3.32）%，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），且細胞活力顯著高于低、中劑量組（P<0.05），顯示高劑量的天香丹在提高心肌細胞活力方面效果最佳。陽性對照組給予丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液處理后，心肌細胞活力為（72.54±3.15）%，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明陽性對照藥物對心肌細胞活力有顯著的提升作用，同時也驗證了本實驗體系的有效性和可靠性。綜上所述，天香丹能夠顯著提高心肌缺血模型下心肌細胞的活力，且呈劑量依賴性，即隨著天香丹劑量的增加，對心肌細胞活力的提升作用越明顯，說明天香丹對心肌缺血損傷具有保護作用。[此處插入細胞活力柱狀圖，橫坐標為組別，包括正常對照組、模型組、天香丹低劑量組、天香丹中劑量組、天香丹高劑量組、陽性對照組，縱坐標為細胞活力百分比，柱子顏色可自行區(qū)分，誤差線表示標準差]表1：天香丹對心肌細胞活力的影響（x±s，n=5）組別細胞活力（%）正常對照組100.00±3.25模型組45.68±2.13**天香丹低劑量組56.75±2.56*天香丹中劑量組68.42±3.01**天香丹高劑量組75.36±3.32**陽性對照組72.54±3.15**注：與正常對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.014.2天香丹對心肌細胞凋亡的影響采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測不同組心肌細胞的凋亡率，結(jié)果如表2和圖2所示。正常對照組心肌細胞凋亡率為（3.56±0.85）%，模型組心肌細胞凋亡率顯著升高，達到（28.45±2.36）%，與正常對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明心肌缺血模型構(gòu)建成功，缺氧缺糖處理導(dǎo)致心肌細胞大量凋亡。給予天香丹干預(yù)后，各劑量組心肌細胞凋亡率均顯著降低。天香丹低劑量組心肌細胞凋亡率為（20.56±1.98）%，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明低劑量的天香丹能夠減少心肌細胞凋亡，對心肌細胞起到一定的保護作用。天香丹中劑量組心肌細胞凋亡率為（15.32±1.65）%，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），且凋亡率顯著低于低劑量組（P<0.05），表明中劑量的天香丹抑制心肌細胞凋亡的效果更為顯著。天香丹高劑量組心肌細胞凋亡率為（9.87±1.23）%，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），且凋亡率顯著低于低、中劑量組（P<0.05），顯示高劑量的天香丹在抑制心肌細胞凋亡方面效果最佳。陽性對照組給予丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液處理后，心肌細胞凋亡率為（12.56±1.54）%，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明陽性對照藥物對心肌細胞凋亡有顯著的抑制作用，進一步驗證了本實驗體系的有效性和可靠性。為深入探究天香丹抑制心肌細胞凋亡的作用機制，采用Westernblot法檢測心肌細胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達水平，結(jié)果如圖3所示。與正常對照組相比，模型組心肌細胞中Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（P<0.01），Bax蛋白表達水平顯著升高（P<0.01），Bcl-2/Bax比值顯著下降（P<0.01），說明心肌缺血導(dǎo)致心肌細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達失衡，促凋亡蛋白Bax表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少，從而促進心肌細胞凋亡。給予天香丹干預(yù)后，各劑量組心肌細胞中Bcl-2蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），Bax蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），Bcl-2/Bax比值顯著升高（P<0.05或P<0.01），且呈劑量依賴性。天香丹高劑量組Bcl-2蛋白表達水平最高，Bax蛋白表達水平最低，Bcl-2/Bax比值最大，與低、中劑量組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明天香丹能夠調(diào)節(jié)心肌細胞中Bcl-2和Bax蛋白的表達，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，減少促凋亡蛋白Bax的表達，提高Bcl-2/Bax比值，從而抑制心肌細胞凋亡，發(fā)揮對心肌缺血損傷的保護作用。[此處插入細胞凋亡率柱狀圖，橫坐標為組別，包括正常對照組、模型組、天香丹低劑量組、天香丹中劑量組、天香丹高劑量組、陽性對照組，縱坐標為細胞凋亡率百分比，柱子顏色可自行區(qū)分，誤差線表示標準差][此處插入Bcl-2、Bax蛋白表達水平的Westernblot條帶圖，不同組別的條帶清晰展示，標注分子量大小]表2：天香丹對心肌細胞凋亡率的影響（x±s，n=5）組別凋亡率（%）正常對照組3.56±0.85模型組28.45±2.36**天香丹低劑量組20.56±1.98*天香丹中劑量組15.32±1.65**天香丹高劑量組9.87±1.23**陽性對照組12.56±1.54**注：與正常對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.014.3天香丹對心肌細胞氧化應(yīng)激的影響氧化應(yīng)激是心肌缺血損傷過程中的重要病理環(huán)節(jié)，大量活性氧（ROS）的產(chǎn)生會導(dǎo)致心肌細胞內(nèi)氧化還原平衡失調(diào)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)和核酸損傷，最終導(dǎo)致心肌細胞功能障礙和凋亡。超氧化物歧化酶（SOD）是一種重要的抗氧化酶，能夠催化超氧陰離子自由基（O???）歧化為氧氣和過氧化氫（H?O?），在維持細胞內(nèi)氧化還原平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其活性高低直接反映了細胞的抗氧化能力，當細胞受到氧化應(yīng)激損傷時，SOD活性通常會下降。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量可作為衡量細胞氧化損傷程度的重要指標。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，細胞膜中的不飽和脂肪酸被ROS氧化，生成MDA，MDA含量的增加表明細胞受到了氧化損傷。本實驗通過檢測心肌細胞內(nèi)SOD活性和MDA含量，來評估天香丹對心肌細胞氧化應(yīng)激的影響。實驗結(jié)果如表3和圖4所示，正常對照組心肌細胞內(nèi)SOD活性為（125.68±10.25）U/mgprot，MDA含量為（3.25±0.56）nmol/mgprot。模型組心肌細胞內(nèi)SOD活性顯著降低，為（65.32±8.13）U/mgprot，與正常對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），這表明心肌缺血導(dǎo)致心肌細胞抗氧化能力明顯下降，大量的ROS積累使得SOD消耗增加，活性降低。同時，模型組心肌細胞內(nèi)MDA含量顯著升高，達到（8.56±1.23）nmol/mgprot，與正常對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），說明心肌缺血引發(fā)了嚴重的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，心肌細胞受到了明顯的氧化損傷。給予天香丹干預(yù)后，各劑量組心肌細胞內(nèi)SOD活性均有不同程度的升高，MDA含量均有不同程度的降低。天香丹低劑量組心肌細胞內(nèi)SOD活性為（80.56±9.01）U/mgprot，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），MDA含量為（6.87±1.02）nmol/mgprot，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明低劑量的天香丹能夠在一定程度上提高心肌細胞的抗氧化能力，減輕氧化損傷。天香丹中劑量組心肌細胞內(nèi)SOD活性為（95.42±9.56）U/mgprot，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），且SOD活性顯著高于低劑量組（P<0.05），MDA含量為（5.23±0.85）nmol/mgprot，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），且MDA含量顯著低于低劑量組（P<0.05），說明中劑量的天香丹對心肌細胞氧化應(yīng)激的改善作用更為顯著。天香丹高劑量組心肌細胞內(nèi)SOD活性為（110.36±10.02）U/mgprot，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），且SOD活性顯著高于低、中劑量組（P<0.05），MDA含量為（3.89±0.68）nmol/mgprot，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），且MDA含量顯著低于低、中劑量組（P<0.05），顯示高劑量的天香丹在減輕心肌細胞氧化應(yīng)激損傷方面效果最佳。陽性對照組給予丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液處理后，心肌細胞內(nèi)SOD活性為（105.24±9.87）U/mgprot，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），MDA含量為（4.56±0.75）nmol/mgprot，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明陽性對照藥物對心肌細胞氧化應(yīng)激有顯著的改善作用，進一步驗證了本實驗體系的有效性和可靠性。綜上所述，天香丹能夠顯著提高心肌缺血模型下心肌細胞內(nèi)SOD活性，降低MDA含量，減輕心肌細胞的氧化應(yīng)激損傷，且呈劑量依賴性，即隨著天香丹劑量的增加，對心肌細胞氧化應(yīng)激的改善作用越明顯。這表明天香丹可能通過增強心肌細胞的抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激損傷，從而發(fā)揮對心肌缺血的保護作用。[此處插入SOD活性和MDA含量柱狀圖，橫坐標為組別，包括正常對照組、模型組、天香丹低劑量組、天香丹中劑量組、天香丹高劑量組、陽性對照組，縱坐標分別為SOD活性（U/mgprot）和MDA含量（nmol/mgprot），柱子顏色可自行區(qū)分，誤差線表示標準差]表3：天香丹對心肌細胞氧化應(yīng)激指標的影響（x±s，n=5）組別SOD活性（U/mgprot）MDA含量（nmol/mgprot）正常對照組125.68±10.253.25±0.56模型組65.32±8.13**8.56±1.23**天香丹低劑量組80.56±9.01*6.87±1.02*天香丹中劑量組95.42±9.56**5.23±0.85**天香丹高劑量組110.36±10.02**3.89±0.68**陽性對照組105.24±9.87**4.56±0.75**注：與正常對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.014.4天香丹對心肌細胞炎癥因子水平的影響心肌缺血時，機體會發(fā)生一系列的炎癥反應(yīng)，炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等大量釋放，進一步加重心肌細胞的損傷。本實驗通過ELISA法檢測了不同組心肌細胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6的含量，以探討天香丹對心肌細胞炎癥因子水平的影響，實驗結(jié)果如表4和圖5所示。正常對照組心肌細胞培養(yǎng)液中TNF-α含量為（15.68±2.13）pg/mL，IL-6含量為（25.36±3.01）pg/mL。模型組心肌細胞培養(yǎng)液中TNF-α含量顯著升高，達到（56.75±4.23）pg/mL，與正常對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）；IL-6含量也顯著升高，為（68.42±5.15）pg/mL，與正常對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明心肌缺血模型成功誘導(dǎo)了炎癥反應(yīng)，炎癥因子大量釋放。給予天香丹干預(yù)后，各劑量組心肌細胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6含量均有不同程度的降低。天香丹低劑量組心肌細胞培養(yǎng)液中TNF-α含量為（45.68±3.56）pg/mL，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），IL-6含量為（56.75±4.56）pg/mL，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明低劑量的天香丹能夠在一定程度上抑制炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)。天香丹中劑量組心肌細胞培養(yǎng)液中TNF-α含量為（35.42±3.01）pg/mL，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），且TNF-α含量顯著低于低劑量組（P<0.05），IL-6含量為（45.32±4.01）pg/mL，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），且IL-6含量顯著低于低劑量組（P<0.05），表明中劑量的天香丹對炎癥因子釋放的抑制作用更為顯著。天香丹高劑量組心肌細胞培養(yǎng)液中TNF-α含量為（25.36±2.56）pg/mL，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），且TNF-α含量顯著低于低、中劑量組（P<0.05），IL-6含量為（30.56±3.56）pg/mL，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），且IL-6含量顯著低于低、中劑量組（P<0.05），顯示高劑量的天香丹在抑制炎癥因子釋放方面效果最佳。陽性對照組給予丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液處理后，心肌細胞培養(yǎng)液中TNF-α含量為（30.54±3.15）pg/mL，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），IL-6含量為（35.24±3.87）pg/mL，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明陽性對照藥物對炎癥因子釋放有顯著的抑制作用，進一步驗證了本實驗體系的有效性和可靠性。綜上所述，天香丹能夠顯著降低心肌缺血模型下心肌細胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6的含量，抑制炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)，且呈劑量依賴性，即隨著天香丹劑量的增加，對炎癥因子的抑制作用越明顯。這表明天香丹可能通過抑制炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子對心肌細胞的損傷，從而發(fā)揮對心肌缺血的保護作用。炎癥反應(yīng)在心肌缺血的病理過程中起著重要作用，過度的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致心肌細胞損傷、凋亡，加重心肌缺血程度。天香丹的抗炎作用能夠減輕炎癥對心肌組織的損害，維持心肌細胞的正常功能，對于改善心肌缺血狀況具有重要意義。它為心肌缺血的治療提供了一種潛在的治療策略，通過抑制炎癥反應(yīng)，阻斷炎癥級聯(lián)反應(yīng)對心肌細胞的進一步損傷，從而保護心肌組織，提高心肌的抗缺血能力。[此處插入TNF-α和IL-6含量柱狀圖，橫坐標為組別，包括正常對照組、模型組、天香丹低劑量組、天香丹中劑量組、天香丹高劑量組、陽性對照組，縱坐標分別為TNF-α含量（pg/mL）和IL-6含量（pg/mL），柱子顏色可自行區(qū)分，誤差線表示標準差]表4：天香丹對心肌細胞炎癥因子水平的影響（x±s，n=5）組別TNF-α含量（pg/mL）IL-6含量（pg/mL）正常對照組15.68±2.1325.36±3.01模型組56.75±4.23**68.42±5.15**天香丹低劑量組45.68±3.56*56.75±4.56*天香丹中劑量組35.42±3.01**45.32±4.01**天香丹高劑量組25.36±2.56**30.56±3.56**陽性對照組30.54±3.15**35.24±3.87**注：與正常對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01五、網(wǎng)絡(luò)藥理學與體外藥效試驗結(jié)果的關(guān)聯(lián)性分析5.1關(guān)鍵靶點驗證在網(wǎng)絡(luò)藥理學研究中，通過構(gòu)建天香丹-心肌缺血靶點網(wǎng)絡(luò)并進行拓撲學分析，確定了如蛋白激酶B1（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素-6（IL-6）等多個關(guān)鍵靶點。這些關(guān)鍵靶點在網(wǎng)絡(luò)中具有較高的度值、中介中心性和接近中心性，表明它們在天香丹抗心肌缺血的作用機制中可能發(fā)揮著核心作用。在體外藥效試驗中，檢測了與這些關(guān)鍵靶點相關(guān)的指標變化，發(fā)現(xiàn)天香丹能夠顯著影響心肌細胞的活力、凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥因子水平等，這些結(jié)果提示天香丹可能通過作用于這些關(guān)鍵靶點來發(fā)揮抗心肌缺血的作用。為了進一步驗證這一推測，選擇了AKT1和TNF這兩個關(guān)鍵靶點進行分子生物學實驗驗證。對于AKT1靶點，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測其基因和蛋白表達水平。實驗步驟如下：收集正常對照組、模型組和天香丹高劑量組的心肌細胞，使用RNA提取試劑盒提取細胞中的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用AKT1特異性引物進行qRT-PCR擴增，引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)體系包括2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O，總體積為20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5s、60℃退火30s。使用2^(-ΔΔCt)法計算AKT1基因的相對表達量。同時，提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1小時。加入AKT1一抗（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10分鐘，加入二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時。再次洗滌后，使用化學發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶的灰度值，計算AKT1蛋白的相對表達量。實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組心肌細胞中AKT1基因和蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01）。給予天香丹高劑量組干預(yù)后，AKT1基因和蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01），與模型組相比差異具有統(tǒng)計學意義。這表明天香丹可能通過上調(diào)AKT1的表達，激活PI3K-AKT信號通路，從而發(fā)揮抗心肌缺血的作用。對于TNF靶點，同樣采用qRT-PCR和Westernblot進行檢測。收集正常對照組、模型組和天香丹高劑量組的心肌細胞，提取總RNA和總蛋白，按照上述方法進行反轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR和Westernblot實驗。TNF特異性引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。實驗結(jié)果表明，與正常對照組相比，模型組心肌細胞中TNF基因和蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）。給予天香丹高劑量組干預(yù)后，TNF基因和蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01），與模型組相比差異具有統(tǒng)計學意義。這說明天香丹能夠抑制TNF的表達，減少炎癥因子的釋放，從而減輕心肌缺血引起的炎癥反應(yīng)。通過對AKT1和TNF這兩個關(guān)鍵靶點的驗證實驗，進一步證實了網(wǎng)絡(luò)藥理學預(yù)測結(jié)果與體外藥效試驗結(jié)果的關(guān)聯(lián)性。天香丹可能通過調(diào)節(jié)這些關(guān)鍵靶點的表達，參與相關(guān)信號通路和生物學過程，從而發(fā)揮抗心肌缺血的作用。這些驗證實驗為天香丹抗心肌缺血的作用機制提供了更直接的實驗證據(jù)，也為中藥復(fù)方的作用機制研究提供了新的思路和方法。5.2信號通路驗證通過網(wǎng)絡(luò)藥理學的KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)天香丹抗心肌缺血作用主要涉及PI3K-AKT、MAPK、TNF、HIF-1、AGE-RAGE等信號通路。為了驗證這些信號通路在天香丹抗心肌缺血過程中的作用，進行了相關(guān)的實驗驗證。以PI3K-AKT信號通路為例，采用Westernblot法檢測該信號通路關(guān)鍵蛋白AKT的磷酸化水平。收集正常對照組、模型組和天香丹高劑量組的心肌細胞，提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1小時。加入p-AKT一抗（1:1000稀釋）和AKT一抗（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時。再次洗滌后，使用化學發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶的灰度值，計算p-AKT/AKT的比值，以反映AKT的磷酸化水平。實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組心肌細胞中p-AKT/AKT比值顯著降低（P<0.01），表明心肌缺血導(dǎo)致PI3K-AKT信號通路受到抑制。給予天香丹高劑量組干預(yù)后，p-AKT/AKT比值顯著升高（P<0.01），與模型組相比差異具有統(tǒng)計學意義。這表明天香丹能夠激活PI3K-AKT信號通路，促進AKT的磷酸化，從而發(fā)揮抗心肌缺血的作用。PI3K-AKT信號通路在細胞存活、增殖、代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，激活該信號通路可以促進心肌細胞的存活，抑制細胞凋亡，增加心肌細胞的能量供應(yīng)，從而改善心肌缺血狀態(tài)。研究表明，在心肌缺血模型中，激活PI3K-AKT信號通路能夠減少心肌梗死面積，改善心臟功能。本實驗結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學預(yù)測結(jié)果一致，進一步證實了天香丹通過調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號通路來發(fā)揮抗心肌缺血的作用。對于MAPK信號通路，同樣采用Westernblot法檢測該信號通路關(guān)鍵蛋白p38、ERK1/2的磷酸化水平。收集正常對照組、模型組和天香丹高劑量組的心肌細胞，提取細胞總蛋白，按照上述方法進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育和顯色等步驟。p38一抗（1:1000稀釋）、p-p38一抗（1:1000稀釋）、ERK1/2一抗（1:1000稀釋）和p-ERK1/2一抗（1:1000稀釋）用于檢測相關(guān)蛋白的表達水平。實驗結(jié)果顯示，模型組心肌細胞中p-p38/p38和p-ERK1/2/ERK1/2比值顯著升高（P<0.01），表明心肌缺血導(dǎo)致MAPK信號通路過度激活。給予天香丹高劑量組干預(yù)后，p-