2025年病理生理學（分子病理）華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗技能試題及答案考試時間：______分鐘總分：______分姓名：______一、選擇題（請將正確選項前的字母填入括號內，每題2分，共20分）1.在PCR反應體系中，下列哪一項通常是需要優(yōu)化的參數(shù)？()A.DNA模板濃度B.引物退火溫度C.dNTPs濃度D.Taq酶濃度E.所有選項都需要優(yōu)化2.與傳統(tǒng)Sanger測序相比，二代測序技術的核心優(yōu)勢在于？()A.讀長更長B.覆蓋深度更高C.費用更低D.只能進行高通量測序E.結果更易于解讀3.進行WesternBlot實驗時，加入封閉液的主要目的是？()A.雜交DNA探針B.加熱變性蛋白質C.阻止一抗與非特異性位點結合D.增強辣根過氧化物酶活性E.稀釋樣品蛋白濃度4.下列哪種方法最適合用于研究基因的體內功能？()A.基因芯片分析B.RT-PCRC.基因敲除D.亞克隆到表達載體E.測序分析5.在設計PCR引物時，為了提高特異性，通常不推薦引物內部存在？()A.二級結構（如發(fā)夾）B.鈍末端C.重復序列D.3'端引物二聚體形成傾向E.G/C含量過高6.以下哪種技術主要基于核酸分子雜交原理？()A.流式細胞術B.基因測序C.聚合酶鏈式反應（PCR）D.核酸適配體技術E.基因芯片7.RT-PCR實驗中，需要使用哪種酶將RNA逆轉錄為cDNA？()A.DNA聚合酶B.RNA聚合酶C.質粒連接酶D.逆轉錄酶（如M-MLV,AMV）E.Taq酶8.WesternBlot結果中，出現(xiàn)多條與預期條帶位置不符的雜帶，可能的原因是？()A.抗體濃度過高B.蛋白質降解C.電泳條件不當D.存在交叉反應E.所有選項都可能是原因9.CRISPR/Cas9技術進行基因編輯時，其核心識別和切割元件分別是？()A.RNA引物，DNA聚合酶B.gRNA，Cas9蛋白C.轉錄因子，RNA干擾分子D.原位雜交探針，限制性內切酶E.適配體，連接酶10.某研究想比較正常組織和腫瘤組織中某個基因的表達差異，以下哪種方法最常用？()A.基因測序B.DNA芯片雜交C.RT-qPCRD.WesternBlotE.電鏡觀察二、填空題（請將正確答案填入橫線上，每空2分，共20分）1.PCR的全稱是________，其基本反應體系通常包含模板DNA、引物、dNTPs和________酶。2.基因芯片技術通?；赺_______原理，可以用于檢測________或________的表達譜。3.在WesternBlot實驗中，將轉膜后的膜用封閉液處理是為了封閉________位點，防止一抗非特異性結合。4.實驗室中常用的核酸電泳技術是________電泳，其基本原理是利用核酸分子在________中遷移速度的差異。5.基因敲除（Knockout）是指通過特定技術使生物體中________的基因功能失活。6.RT-qPCR實驗中，實時監(jiān)測熒光信號變化的步驟稱為________階段，用于定量分析的標準曲線通常需要用________標準品構建。7.流式細胞術可以用來________和________細胞。8.核酸序列分析中，堿基的化學名稱是腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和________。9.基因敲低（Knockdown）技術常用的工具是________，其作用機制是________。10.將目的基因插入到載體（如質粒）中，并通過轉化等手段導入宿主細胞的過程稱為________。三、名詞解釋（請給出下列名詞的英文全稱和簡要解釋，每題3分，共15分）1.PCRAmplification2.qPCR(QuantitativePCR)3.WesternBlotting4.CRISPR/Cas95.GeneKnockout四、簡答題（請簡要回答下列問題，每題5分，共20分）1.簡述PCR反應的基本原理及其關鍵步驟。2.比較RT-PCR和qPCR在檢測基因表達方面的主要區(qū)別。3.在進行WesternBlot實驗時，為了保證實驗結果的可靠性，應關注哪些關鍵環(huán)節(jié)？4.簡述基因敲除技術的基本原理及其在研究基因功能中的作用。五、論述題（請結合所學知識，深入分析并回答下列問題，每題10分，共20分）1.試述實時熒光定量PCR（qPCR）技術的基本原理，并說明其在基因表達分析中的優(yōu)勢和需要注意的關鍵因素。2.以研究某基因在腫瘤發(fā)生中的作用為例，設計一個包含分子病理學實驗技術的初步研究方案，并說明選擇這些技術的理由。試卷答案一、選擇題1.B2.B3.C4.C5.A6.E7.D8.E9.B10.C二、填空題1.聚合酶鏈式反應，Taq2.分子雜交，mRNA，miRNA3.非特異性4.瓊脂糖，電場5.有義6.苂光檢測，絕對定量7.分析，分選8.胸腺嘧啶9.小干擾RNA（siRNA），干擾RNA（RNAi）沉默10.基因克隆三、名詞解釋1.PCRAmplification:PolymeraseChainReactionAmplification.一種在體外快速擴增特定DNA片段的技術，通過變性、退火、延伸三個步驟的循環(huán)，使目標DNA片段呈指數(shù)級擴增。2.qPCR(QuantitativePCR):QuantitativePolymeraseChainReaction.一種實時監(jiān)測PCR擴增過程的定量技術，通過熒光信號累積來定量起始模板DNA或RNA的濃度。3.WesternBlotting:WesternBlotting.一種用于檢測生物樣品中特定蛋白質的技術，基本步驟包括蛋白質電泳分離、轉移至膜、與特異性抗體結合、再與標記的二抗結合，最后通過化學發(fā)光或熒光信號檢測。4.CRISPR/Cas9:ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats/CRISPR-associatedprotein9.一種近年來發(fā)展迅速的基因編輯技術，利用向導RNA（gRNA）引導Cas9蛋白到目標DNA位點進行切割，實現(xiàn)基因敲除、插入等修飾。5.GeneKnockout:GeneKnockout.基因敲除。通過特定技術（如CRISPR/Cas9或傳統(tǒng)靶向載體）使生物體基因組中特定基因的等位基因被破壞（通常插入無效突變），導致該基因功能失活的研究技術。四、簡答題1.簡述PCR反應的基本原理及其關鍵步驟。PCR（聚合酶鏈式反應）利用DNA聚合酶在體外模擬體內DNA復制過程，特異性地擴增目的DNA片段?；驹硎腔贒NA雙螺旋結構解旋后，兩條鏈可以作為模板合成新的互補鏈。關鍵步驟包括：①變性（Denaturation）：加熱至95℃左右，使DNA雙鏈解旋成單鏈；②退火（Annealing）：降溫至引物退火溫度（通常50-65℃），引物與模板DNA單鏈特異性結合；③延伸（Extension）：升溫至DNA聚合酶最適溫度（通常72℃），Taq酶以dNTP為原料，沿著模板鏈合成新的互補鏈。以上三步循環(huán)重復30-40次，使目的DNA片段呈指數(shù)級擴增。2.比較RT-PCR和qPCR在檢測基因表達方面的主要區(qū)別。RT-PCR（逆轉錄聚合酶鏈式反應）是將RNA模板逆轉錄成cDNA，然后以cDNA為模板進行PCR擴增，用于檢測和相對定量mRNA表達水平。qPCR（實時熒光定量PCR）是在PCR反應體系中加入熒光染料或探針，實時監(jiān)測PCR過程中熒光信號的積累，實現(xiàn)核酸模板的絕對定量。主要區(qū)別在于：①定量能力：qPCR可實現(xiàn)定量，RT-PCR通常為半定量或相對定量；②靈敏度：qPCR通常更靈敏；③實驗過程：qPCR需要逆轉錄步驟（如果是檢測RNA），且在反應過程中進行熒光監(jiān)測，結果實時獲??；RT-PCR完成PCR擴增后需通過凝膠電泳等方法檢測結果。3.在進行WesternBlot實驗時，為了保證實驗結果的可靠性，應關注哪些關鍵環(huán)節(jié)？WesternBlot結果的可靠性依賴于多個環(huán)節(jié)的精確控制：①蛋白質樣品的提取與裂解：確保樣品均一，無雜蛋白干擾，蛋白質濃度適宜；②SDS電泳分離：凝膠濃度選擇合適，電泳條件（電壓、時間）穩(wěn)定，確保蛋白質有效分離；③蛋白轉移：轉膜條件（電壓、時間、溫度）優(yōu)化，確保蛋白質完全、均勻地從凝膠轉移到膜上；④膜封閉：封閉時間、溫度、封閉劑濃度合適，有效封閉非特異性位點，防止一抗非特異性結合；⑤抗體孵育：一抗、二抗?jié)舛葍?yōu)化，孵育條件（時間、溫度）適宜，確保特異性結合；⑥信號檢測：化學發(fā)光或熒光檢測系統(tǒng)穩(wěn)定，曝光時間合適，避免過曝或欠曝；⑦結果分析：灰度值定量應客觀，重復實驗次數(shù)足夠，結果具有統(tǒng)計學意義。4.簡述基因敲除技術的基本原理及其在研究基因功能中的作用?；蚯贸℅eneKnockout）技術通過引入特定的突變（通常是移碼突變、無義突變或插入大片段DNA，導致基因功能喪失），使目標基因在基因組中失活。基本原理是將包含同源臂和選擇標記的靶向載體（通?；谫|粒）導入宿主細胞，通過同源重組或非同源末端連接（NHEJ，常導致小規(guī)模插入突變）替換掉基因組中目標基因的部分或全部序列，從而產生不能表達或表達異常蛋白質的基因敲除突變體。在研究基因功能中，通過構建基因敲除小鼠、細胞系等模型，觀察其表型變化，可以推斷該基因在特定生物學過程中的作用和功能。五、論述題1.試述實時熒光定量PCR（qPCR）技術的基本原理，并說明其在基因表達分析中的優(yōu)勢和需要注意的關鍵因素。實時熒光定量PCR（qPCR）技術利用熒光染料（如SYBRGreenI，能結合雙鏈DNA并發(fā)出熒光）或特異性熒光探針（如TaqMan探針，探針自身熒光在解離時發(fā)出），在PCR擴增過程中實時監(jiān)測熒光信號的變化?；驹硎牵篜CR每擴增一條雙鏈DNA，熒光信號就相應增加一份。通過在PCR循環(huán)早期設置一個熒光閾值（Threshold），并將達到該閾值時的循環(huán)數(shù)（Ct值，CycleThreshold）作為起始模板量的對數(shù)轉換指標。Ct值與起始模板量呈負相關，通過構建標準曲線（使用已知濃度的模板），可以實現(xiàn)起始模板的絕對定量或不同樣品間相對表達量的比較。qPCR在基因表達分析中的優(yōu)勢包括：①高靈敏度：能檢測到極微量的核酸模板；②高特異性：使用特異性引物和探針，能有效避免非特異性擴增；③快速：反應和結果分析過程相對較快；④動態(tài)范圍寬：可檢測樣品中模板濃度的較大范圍變化；⑤定量準確：可實現(xiàn)絕對或相對定量，重復性好。需要注意的關鍵因素包括：①特異性：引物和探針設計必須高度特異性，避免非特異性結合或引物二聚體形成；②RNA質量：RNA樣品需無降解，無基因組DNA污染；③逆轉錄效率（如果是檢測RNA）：需保證所有RNA都有效逆轉錄為cDNA，且效率一致；④標準曲線：構建標準曲線的模板制備、擴增條件需與樣品一致；⑤試劑和耗材：保證試劑無污染，耗材無菌無核酸降解；⑥重復實驗：確保結果的可靠性和統(tǒng)計學意義。2.以研究某基因在腫瘤發(fā)生中的作用為例，設計一個包含分子病理學實驗技術的初步研究方案，并說明選擇這些技術的理由。研究方案：①樣本收集與分組：收集腫瘤組織及其對應的癌旁正常組織樣本，根據(jù)臨床病理特征（如腫瘤類型、分期、分級）進行分組。②mRNA表達水平檢測：使用RT-qPCR技術檢測腫瘤組織和癌旁組織中目標基因的mRNA表達水平，分析其表達差異。理由：qPCR靈敏、特異、可定量，適用于檢測mRNA表達變化，是研究基因功能最常用的方法之一。③蛋白表達水平檢測：使用WesternBlot技術檢測腫瘤組織和癌旁組織中目標基因編碼蛋白的表達水平及可能的翻譯后修飾（如磷酸化）。理由：蛋白是生命活動的主要執(zhí)行者，檢測蛋白表達水平可以直接反映基因功能狀態(tài)，WesternBlot是檢測蛋白表達的經(jīng)典且廣泛應用的技術。④免疫組化（IHC）檢測：在石蠟切片上進行免疫組化染色，觀察目標蛋白在腫瘤組織中的定位（細胞核、細胞質、細胞膜）和表達強度，并結合組織學特征分析。理由：IHC可以在原位觀察蛋白表達與腫瘤細胞形態(tài)、分布的關系，提供更直觀的組織病理學信息，有助于理解基因功能在腫瘤微環(huán)境中的影響。⑤（可選）相關性分析：分析目標基因mRNA/蛋白表達水平與臨床病理參數(shù)（如腫瘤分期、淋巴結