免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法措施一、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法概述

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)是研究免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能及其與疾病關(guān)系的核心手段。通過(guò)一系列標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)方法，可以定量或定性分析免疫應(yīng)答、免疫細(xì)胞、免疫分子等關(guān)鍵要素。本部分將系統(tǒng)介紹免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本原則、常用技術(shù)及操作規(guī)范，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

（一）實(shí)驗(yàn)基本原則

1.嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件

(1)溫度控制：大多數(shù)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)需在37℃恒溫條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，需使用水浴鍋或CO?培養(yǎng)箱。

(2)pH調(diào)節(jié)：細(xì)胞培養(yǎng)液pH值需維持在7.2-7.4，可通過(guò)添加Hepes緩沖液或碳酸氫鈉進(jìn)行校正。

(3)無(wú)菌操作：所有涉及細(xì)胞或體液的實(shí)驗(yàn)必須使用無(wú)菌技術(shù)，操作前需用70%酒精消毒工作臺(tái)面。

2.標(biāo)準(zhǔn)化樣本處理

(1)樣本采集：血液樣本需使用肝素抗凝，避免EDTA等干擾免疫分子活性的試劑。

(2)分離純化：通過(guò)密度梯度離心（如Ficoll-Paque）分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。

(3)儲(chǔ)存條件：凍存細(xì)胞需使用DMSO（終濃度5%）作為保護(hù)劑，置于-80℃保存。

（二）免疫細(xì)胞分析技術(shù)

1.流式細(xì)胞術(shù)（FCM）

(1)樣本制備：使用Ficoll分離PBMC，重懸后加入抗CD3、CD4等熒光抗體。

(2)設(shè)備參數(shù)：設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)488nm，檢測(cè)FL1（綠）、FL2（橙）、FL3（紅）通道。

(3)數(shù)據(jù)分析：通過(guò)FACS軟件計(jì)算CD4+/CD8+比例（正常值1.0-2.0），監(jiān)測(cè)活化標(biāo)記物CD25表達(dá)。

2.免疫組化技術(shù)

(1)樣本固定：組織樣本需用4%多聚甲醛固定20分鐘，PBS清洗3次。

(2)抗體孵育：37℃封閉1小時(shí)后，加入兔抗人IgG抗體（工作濃度1:100），4℃過(guò)夜。

(3)顯色反應(yīng)：使用DAB顯色劑，顯微鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)染色（棕黃色為陽(yáng)性）。

二、免疫分子檢測(cè)方法

（一）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）

1.標(biāo)準(zhǔn)操作流程

(1)固定階段：96孔板包被抗IgE抗體（100μl/孔），4℃過(guò)夜。

(2)結(jié)合階段：用稀釋樣本（1:10）孵育2小時(shí)，棄液后洗滌3次。

(3)顯色階段：加入TMB底物，避光反應(yīng)15分鐘后測(cè)定450nm吸光度。

2.數(shù)據(jù)處理

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：使用已知濃度的IgE標(biāo)準(zhǔn)品（0-100ng/ml）作圖。

(2)結(jié)果計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度，乘以稀釋倍數(shù)得到原始值。

(3)精密度控制：每個(gè)樣本需設(shè)置復(fù)孔（n≥3），計(jì)算變異系數(shù)（<10%）。

（二）WesternBlot技術(shù)

1.蛋白質(zhì)印跡步驟

(1)電泳分離：SDS分離蛋白質(zhì)（100-200μg/泳道），恒壓100V電泳2小時(shí)。

(2)轉(zhuǎn)膜操作：使用半干轉(zhuǎn)膜儀（30V，1小時(shí)），封閉液（5%BSA）室溫孵育1小時(shí)。

(3)抗體檢測(cè)：加入抗NF-κB抗體（1:500），室溫孵育1小時(shí)后洗滌。

2.定量分析

(1)化學(xué)發(fā)光：使用ECL底物曝光，凝膠成像儀掃描灰度值。

(2)校準(zhǔn)方法：通過(guò)內(nèi)參β-actin校正蛋白條帶強(qiáng)度。

(3)比較計(jì)算：實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組灰度比值（>1.5為顯著差異）。

三、實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制措施

（一）陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置

1.必須包含標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照

(1)ELISA實(shí)驗(yàn)：需使用已知高濃度樣本作為陽(yáng)性對(duì)照。

(2)流式細(xì)胞術(shù)：需檢測(cè)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞群體（如CD8+T細(xì)胞）。

(3)WesternBlot：需顯示目標(biāo)蛋白條帶（如p-IκBα）。

2.對(duì)照作用驗(yàn)證

(1)陰性對(duì)照無(wú)信號(hào)：未加樣本孔應(yīng)無(wú)顯色反應(yīng)。

(2)重復(fù)性驗(yàn)證：連續(xù)3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果RSD應(yīng)<15%。

（二）交叉污染防范

1.實(shí)驗(yàn)區(qū)域劃分

(1)分設(shè)樣本前處理區(qū)、抗體孵育區(qū)、洗滌區(qū)。

(2)使用不同移液器頭處理不同樣本，避免反復(fù)混用。

2.設(shè)備消毒措施

(1)流式細(xì)胞儀：每周用70%酒精超聲清洗流式池。

(2)共聚焦顯微鏡：每次實(shí)驗(yàn)后用無(wú)水乙醇清潔物鏡。

（三）數(shù)據(jù)可靠性保障

1.重復(fù)實(shí)驗(yàn)原則

(1)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組需設(shè)置生物學(xué)重復(fù)（n≥3）。

(2)方法學(xué)驗(yàn)證：新建立的實(shí)驗(yàn)需通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證。

2.異常值處理

(1)超出3倍標(biāo)準(zhǔn)差的數(shù)據(jù)需重新檢測(cè)。

(2)明顯偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣本應(yīng)排除在外。

二、免疫分子檢測(cè)方法

（一）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）

1.標(biāo)準(zhǔn)操作流程

（1）板固相包被

①準(zhǔn)備ELISA酶標(biāo)板（通常為96孔板）。

②將特異性抗體（捕獲抗體或檢測(cè)抗體）用包被液（pH9.6碳酸鹽緩沖液或pH7.4磷酸鹽緩沖液）稀釋至適當(dāng)濃度（常用濃度1-10μg/ml）。

③向每個(gè)孔中加入100μl抗體工作液，置于4℃冰箱過(guò)夜（16-20小時(shí)）進(jìn)行包被，以封閉板孔非特異性位點(diǎn)。

④用洗滌液（如PBST或Tris-T緩沖液）洗滌板孔3-4次，每次洗滌需使用洗板機(jī)充分振蕩并在吸水紙上拍干，避免交叉污染。

⑤加入封閉液（5%脫脂奶粉或3%BSA溶液），室溫孵育1-2小時(shí)，完全封閉剩余活性位點(diǎn)。

⑥再次洗滌3-4次，同上步驟。

（2）樣本或標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)合

①棄去封閉液，每孔加入100μl樣本稀釋液（樣本前需用適當(dāng)比例稀釋，如1:10或1:100）或標(biāo)準(zhǔn)品工作液。

②設(shè)立空白孔（不加樣本）、陰性對(duì)照孔（正常對(duì)照）和陽(yáng)性對(duì)照孔。

③置于室溫（20-37℃）孵育1-2小時(shí)，或4℃過(guò)夜孵育（適用于低豐度分子檢測(cè)）。

④用洗滌液洗滌3-4次，每次5-10分鐘，以去除未結(jié)合物質(zhì)。

（3）檢測(cè)抗體結(jié)合

①棄去洗滌液后，每孔加入100μl用稀釋液稀釋的二抗（如辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，根據(jù)說(shuō)明書(shū)調(diào)整濃度，常用1:5,000-1:20,000）。

②設(shè)立相應(yīng)陰性對(duì)照和空白對(duì)照。

③室溫孵育1小時(shí)，或37℃孵育30分鐘。

④再次洗滌3-4次，同上步驟。

（4）顯色反應(yīng)

①棄去洗滌液，每孔加入100μl新鮮配制的顯色液（如TMB底物溶液，包含H2O2和TMB顯色劑）。

②設(shè)立空白孔（用顯色液替代樣本孔，用于調(diào)零）。

③避光室溫孵育15-30分鐘（注意觀察顏色變化，避免過(guò)度顯色導(dǎo)致線性范圍外）。

④使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值（OD值），建議同時(shí)設(shè)置參考波長(zhǎng)（如600nm）進(jìn)行補(bǔ)償。

（5）終止反應(yīng)

①每孔加入50-100μl終止液（如2MH2SO4或1MHCl），立即混勻。

②終止液會(huì)終止酶促反應(yīng)，使顏色由藍(lán)色（TMB氧化態(tài)）變?yōu)辄S色（TMB還原態(tài)），顏色深淺與樣本濃度成正比。

③立即使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處再次測(cè)定吸光度值。

2.數(shù)據(jù)處理

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

①使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（如IgG標(biāo)準(zhǔn)品，濃度范圍0-1000ng/ml，設(shè)5-7個(gè)濃度梯度）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

②對(duì)每個(gè)濃度點(diǎn)的復(fù)孔OD值進(jìn)行平均值計(jì)算，并扣除空白孔吸光度值。

③以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X軸），平均OD值為縱坐標(biāo)（Y軸），使用Excel等軟件繪制線性回歸曲線。

④計(jì)算回歸方程（Y=aX+b）和R2值（理想值≥0.98），確保線性關(guān)系良好。

（2）樣本濃度計(jì)算

①將待測(cè)樣本的復(fù)孔OD平均值扣除空白孔吸光度值后，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算出樣本的濃度值。

②樣本濃度=a×(樣本OD值-空白OD值)+b。

③將計(jì)算結(jié)果乘以樣本稀釋倍數(shù)，得到樣本原始濃度。

（3）精密度控制

①每個(gè)樣本至少設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。

②計(jì)算變異系數(shù)（CV=SD/平均值×100%），要求CV<10%，否則需重新檢測(cè)。

③對(duì)所有樣本進(jìn)行批內(nèi)和批間精密度評(píng)估，確保實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性。

（二）WesternBlot技術(shù)

1.蛋白質(zhì)印跡步驟

（1）樣品制備與變性

①組織或細(xì)胞裂解：使用RIPA裂解緩沖液（含PMSF、螯合劑等）冰上裂解細(xì)胞或組織（如加入蛋白酶抑制劑混合物），勻漿后離心取上清。

②蛋白質(zhì)定量：使用BCA或Bradford法測(cè)定樣品中總蛋白濃度，根據(jù)上樣量要求（通常20-50μg/泳道）進(jìn)行稀釋。

③蛋白質(zhì)變性：向樣品中加入等體積的2×SDS上樣緩沖液（含β-巰基乙醇或DTT），100℃變性5-10分鐘。

④上樣準(zhǔn)備：將變性后的樣品與LoadingBuffer混合均勻，每泳道加入15-20μl，加樣前可在樣品中加入溴酚藍(lán)和二甲苯青FF作為分子量標(biāo)記。

（2）SDS電泳分離

①準(zhǔn)備凝膠：根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量選擇合適濃度的SDS凝膠（如12%-15%），制備分離膠和濃縮膠。

②裂解液上樣：小心將樣品混合物加入梳子孔中，確保加樣量均勻。

③電泳參數(shù)設(shè)置：

a.緩沖液：使用Tris-Glycine緩沖液（濃縮膠）和Tris-Glycine-SDS緩沖液（分離膠）。

b.電壓：濃縮膠80V，分離膠100-120V。

c.時(shí)間：濃縮膠30-45分鐘至溴酚藍(lán)跑至膠底部，分離膠根據(jù)凝膠厚度（1cm膠約1-1.5小時(shí)）。

④注意事項(xiàng)：電泳過(guò)程中保持冷，可使用冷卻液循環(huán)系統(tǒng)。

（3）蛋白轉(zhuǎn)移至膜

①準(zhǔn)備轉(zhuǎn)移裝置：在轉(zhuǎn)移槽中加入冰冷的轉(zhuǎn)移緩沖液（含20%甲醇），預(yù)冷30分鐘。

②轉(zhuǎn)移膜準(zhǔn)備：PVDF膜或NC膜用甲醇浸泡15分鐘，再用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡1小時(shí)。

③裝配系統(tǒng)：依次放置海綿、濾紙（浸濕）、PVDF膜（有劃痕面朝上）、濾紙、海綿，夾緊。

④轉(zhuǎn)移參數(shù)設(shè)置：

a.電壓：0.1-0.2A/cm2，恒流。

b.時(shí)間：1-2小時(shí)（根據(jù)蛋白大小和轉(zhuǎn)移效率調(diào)整）。

c.溫度：4℃冷轉(zhuǎn)移。

⑤轉(zhuǎn)移后處理：取出膜，用轉(zhuǎn)移緩沖液漂洗5分鐘，用TBST緩沖液洗滌10分鐘。

（4）膜封閉

①封閉液準(zhǔn)備：5%脫脂奶粉或3%BSA溶于TBST緩沖液，可加入0.1%吐溫-20。

②封閉操作：將膜置于封閉液中，室溫?fù)u床孵育1-2小時(shí)，或4℃過(guò)夜（推薦）。

③封閉效果檢查：封閉后用TBST洗滌膜，若背景清晰則封閉成功，若背景高則需延長(zhǎng)封閉時(shí)間或更換封閉液。

（5）一抗孵育

①一抗稀釋：根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)選擇合適濃度（如1:500-1:2000），用TBST將抗體稀釋。

②孵育操作：將膜置于含一抗的TBST溶液中，4℃孵育過(guò)夜，或室溫孵育1-2小時(shí)（需設(shè)定合適條件）。

③保存：若室溫孵育，期間需每隔30分鐘搖動(dòng)一次。

（6）洗滌

①洗滌步驟：用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10分鐘，室溫或室溫下洗滌效果更佳。

②洗滌次數(shù)：建議洗滌4-6次，每次更換新鮮洗滌液。

（7）二抗孵育

①二抗稀釋：選擇與一抗物種匹配的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記的二抗，按說(shuō)明書(shū)稀釋（如1:5000-1:10000）。

②孵育操作：將膜置于含二抗的TBST溶液中，室溫?fù)u床孵育1小時(shí)。

③洗滌：同上步驟，洗滌3-4次。

（8）化學(xué)發(fā)光檢測(cè)

①底物準(zhǔn)備：新鮮配制ECL發(fā)光液（增強(qiáng)型或非增強(qiáng)型），按需加入增強(qiáng)液（如增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒）。

②檢測(cè)操作：將膜置于裝有底物的塑料袋中，避光反應(yīng)1-5分鐘。

③信號(hào)采集：使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（如ECL成像儀）采集圖像，注意曝光時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，避免信號(hào)飽和。

④底物再生：可重復(fù)使用底物2-3次，但需每次新鮮配制。

（9）膜保存

①信號(hào)穩(wěn)定后，可將膜用封閉液封閉，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

②長(zhǎng)期保存需使用封閉液封閉后，加入0.1%疊氮鈉，-80℃保存。

2.數(shù)據(jù)處理

（1）灰度值定量

①使用凝膠成像分析軟件（如ImageLab,QuantityOne）對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行灰度值掃描分析。

②設(shè)定感興趣區(qū)域（ROI），自動(dòng)或手動(dòng)進(jìn)行灰度積分。

③選取內(nèi)參條帶（如β-actin、β-tubulin）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正。

（2）定量計(jì)算

①目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量=目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

②若進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，需設(shè)置多個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組重復(fù)檢測(cè)3-5次。

（3）結(jié)果驗(yàn)證

①檢查條帶是否存在可重復(fù)的條帶增寬、缺失或拖尾現(xiàn)象。

②需與已知蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)照，確保條帶位置正確。

③可通過(guò)改變上樣量或?qū)嶒?yàn)條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

一、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法概述

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)是研究免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能及其與疾病關(guān)系的核心手段。通過(guò)一系列標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)方法，可以定量或定性分析免疫應(yīng)答、免疫細(xì)胞、免疫分子等關(guān)鍵要素。本部分將系統(tǒng)介紹免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本原則、常用技術(shù)及操作規(guī)范，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

（一）實(shí)驗(yàn)基本原則

1.嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件

(1)溫度控制：大多數(shù)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)需在37℃恒溫條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，需使用水浴鍋或CO?培養(yǎng)箱。

(2)pH調(diào)節(jié)：細(xì)胞培養(yǎng)液pH值需維持在7.2-7.4，可通過(guò)添加Hepes緩沖液或碳酸氫鈉進(jìn)行校正。

(3)無(wú)菌操作：所有涉及細(xì)胞或體液的實(shí)驗(yàn)必須使用無(wú)菌技術(shù)，操作前需用70%酒精消毒工作臺(tái)面。

2.標(biāo)準(zhǔn)化樣本處理

(1)樣本采集：血液樣本需使用肝素抗凝，避免EDTA等干擾免疫分子活性的試劑。

(2)分離純化：通過(guò)密度梯度離心（如Ficoll-Paque）分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。

(3)儲(chǔ)存條件：凍存細(xì)胞需使用DMSO（終濃度5%）作為保護(hù)劑，置于-80℃保存。

（二）免疫細(xì)胞分析技術(shù)

1.流式細(xì)胞術(shù)（FCM）

(1)樣本制備：使用Ficoll分離PBMC，重懸后加入抗CD3、CD4等熒光抗體。

(2)設(shè)備參數(shù)：設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)488nm，檢測(cè)FL1（綠）、FL2（橙）、FL3（紅）通道。

(3)數(shù)據(jù)分析：通過(guò)FACS軟件計(jì)算CD4+/CD8+比例（正常值1.0-2.0），監(jiān)測(cè)活化標(biāo)記物CD25表達(dá)。

2.免疫組化技術(shù)

(1)樣本固定：組織樣本需用4%多聚甲醛固定20分鐘，PBS清洗3次。

(2)抗體孵育：37℃封閉1小時(shí)后，加入兔抗人IgG抗體（工作濃度1:100），4℃過(guò)夜。

(3)顯色反應(yīng)：使用DAB顯色劑，顯微鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)染色（棕黃色為陽(yáng)性）。

二、免疫分子檢測(cè)方法

（一）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）

1.標(biāo)準(zhǔn)操作流程

(1)固定階段：96孔板包被抗IgE抗體（100μl/孔），4℃過(guò)夜。

(2)結(jié)合階段：用稀釋樣本（1:10）孵育2小時(shí)，棄液后洗滌3次。

(3)顯色階段：加入TMB底物，避光反應(yīng)15分鐘后測(cè)定450nm吸光度。

2.數(shù)據(jù)處理

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：使用已知濃度的IgE標(biāo)準(zhǔn)品（0-100ng/ml）作圖。

(2)結(jié)果計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度，乘以稀釋倍數(shù)得到原始值。

(3)精密度控制：每個(gè)樣本需設(shè)置復(fù)孔（n≥3），計(jì)算變異系數(shù)（<10%）。

（二）WesternBlot技術(shù)

1.蛋白質(zhì)印跡步驟

(1)電泳分離：SDS分離蛋白質(zhì)（100-200μg/泳道），恒壓100V電泳2小時(shí)。

(2)轉(zhuǎn)膜操作：使用半干轉(zhuǎn)膜儀（30V，1小時(shí)），封閉液（5%BSA）室溫孵育1小時(shí)。

(3)抗體檢測(cè)：加入抗NF-κB抗體（1:500），室溫孵育1小時(shí)后洗滌。

2.定量分析

(1)化學(xué)發(fā)光：使用ECL底物曝光，凝膠成像儀掃描灰度值。

(2)校準(zhǔn)方法：通過(guò)內(nèi)參β-actin校正蛋白條帶強(qiáng)度。

(3)比較計(jì)算：實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組灰度比值（>1.5為顯著差異）。

三、實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制措施

（一）陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置

1.必須包含標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照

(1)ELISA實(shí)驗(yàn)：需使用已知高濃度樣本作為陽(yáng)性對(duì)照。

(2)流式細(xì)胞術(shù)：需檢測(cè)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞群體（如CD8+T細(xì)胞）。

(3)WesternBlot：需顯示目標(biāo)蛋白條帶（如p-IκBα）。

2.對(duì)照作用驗(yàn)證

(1)陰性對(duì)照無(wú)信號(hào)：未加樣本孔應(yīng)無(wú)顯色反應(yīng)。

(2)重復(fù)性驗(yàn)證：連續(xù)3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果RSD應(yīng)<15%。

（二）交叉污染防范

1.實(shí)驗(yàn)區(qū)域劃分

(1)分設(shè)樣本前處理區(qū)、抗體孵育區(qū)、洗滌區(qū)。

(2)使用不同移液器頭處理不同樣本，避免反復(fù)混用。

2.設(shè)備消毒措施

(1)流式細(xì)胞儀：每周用70%酒精超聲清洗流式池。

(2)共聚焦顯微鏡：每次實(shí)驗(yàn)后用無(wú)水乙醇清潔物鏡。

（三）數(shù)據(jù)可靠性保障

1.重復(fù)實(shí)驗(yàn)原則

(1)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組需設(shè)置生物學(xué)重復(fù)（n≥3）。

(2)方法學(xué)驗(yàn)證：新建立的實(shí)驗(yàn)需通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證。

2.異常值處理

(1)超出3倍標(biāo)準(zhǔn)差的數(shù)據(jù)需重新檢測(cè)。

(2)明顯偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣本應(yīng)排除在外。

二、免疫分子檢測(cè)方法

（一）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）

1.標(biāo)準(zhǔn)操作流程

（1）板固相包被

①準(zhǔn)備ELISA酶標(biāo)板（通常為96孔板）。

②將特異性抗體（捕獲抗體或檢測(cè)抗體）用包被液（pH9.6碳酸鹽緩沖液或pH7.4磷酸鹽緩沖液）稀釋至適當(dāng)濃度（常用濃度1-10μg/ml）。

③向每個(gè)孔中加入100μl抗體工作液，置于4℃冰箱過(guò)夜（16-20小時(shí)）進(jìn)行包被，以封閉板孔非特異性位點(diǎn)。

④用洗滌液（如PBST或Tris-T緩沖液）洗滌板孔3-4次，每次洗滌需使用洗板機(jī)充分振蕩并在吸水紙上拍干，避免交叉污染。

⑤加入封閉液（5%脫脂奶粉或3%BSA溶液），室溫孵育1-2小時(shí)，完全封閉剩余活性位點(diǎn)。

⑥再次洗滌3-4次，同上步驟。

（2）樣本或標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)合

①棄去封閉液，每孔加入100μl樣本稀釋液（樣本前需用適當(dāng)比例稀釋，如1:10或1:100）或標(biāo)準(zhǔn)品工作液。

②設(shè)立空白孔（不加樣本）、陰性對(duì)照孔（正常對(duì)照）和陽(yáng)性對(duì)照孔。

③置于室溫（20-37℃）孵育1-2小時(shí)，或4℃過(guò)夜孵育（適用于低豐度分子檢測(cè)）。

④用洗滌液洗滌3-4次，每次5-10分鐘，以去除未結(jié)合物質(zhì)。

（3）檢測(cè)抗體結(jié)合

①棄去洗滌液后，每孔加入100μl用稀釋液稀釋的二抗（如辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，根據(jù)說(shuō)明書(shū)調(diào)整濃度，常用1:5,000-1:20,000）。

②設(shè)立相應(yīng)陰性對(duì)照和空白對(duì)照。

③室溫孵育1小時(shí)，或37℃孵育30分鐘。

④再次洗滌3-4次，同上步驟。

（4）顯色反應(yīng)

①棄去洗滌液，每孔加入100μl新鮮配制的顯色液（如TMB底物溶液，包含H2O2和TMB顯色劑）。

②設(shè)立空白孔（用顯色液替代樣本孔，用于調(diào)零）。

③避光室溫孵育15-30分鐘（注意觀察顏色變化，避免過(guò)度顯色導(dǎo)致線性范圍外）。

④使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值（OD值），建議同時(shí)設(shè)置參考波長(zhǎng)（如600nm）進(jìn)行補(bǔ)償。

（5）終止反應(yīng)

①每孔加入50-100μl終止液（如2MH2SO4或1MHCl），立即混勻。

②終止液會(huì)終止酶促反應(yīng)，使顏色由藍(lán)色（TMB氧化態(tài)）變?yōu)辄S色（TMB還原態(tài)），顏色深淺與樣本濃度成正比。

③立即使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處再次測(cè)定吸光度值。

2.數(shù)據(jù)處理

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

①使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（如IgG標(biāo)準(zhǔn)品，濃度范圍0-1000ng/ml，設(shè)5-7個(gè)濃度梯度）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

②對(duì)每個(gè)濃度點(diǎn)的復(fù)孔OD值進(jìn)行平均值計(jì)算，并扣除空白孔吸光度值。

③以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X軸），平均OD值為縱坐標(biāo)（Y軸），使用Excel等軟件繪制線性回歸曲線。

④計(jì)算回歸方程（Y=aX+b）和R2值（理想值≥0.98），確保線性關(guān)系良好。

（2）樣本濃度計(jì)算

①將待測(cè)樣本的復(fù)孔OD平均值扣除空白孔吸光度值后，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算出樣本的濃度值。

②樣本濃度=a×(樣本OD值-空白OD值)+b。

③將計(jì)算結(jié)果乘以樣本稀釋倍數(shù)，得到樣本原始濃度。

（3）精密度控制

①每個(gè)樣本至少設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。

②計(jì)算變異系數(shù)（CV=SD/平均值×100%），要求CV<10%，否則需重新檢測(cè)。

③對(duì)所有樣本進(jìn)行批內(nèi)和批間精密度評(píng)估，確保實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性。

（二）WesternBlot技術(shù)

1.蛋白質(zhì)印跡步驟

（1）樣品制備與變性

①組織或細(xì)胞裂解：使用RIPA裂解緩沖液（含PMSF、螯合劑等）冰上裂解細(xì)胞或組織（如加入蛋白酶抑制劑混合物），勻漿后離心取上清。

②蛋白質(zhì)定量：使用BCA或Bradford法測(cè)定樣品中總蛋白濃度，根據(jù)上樣量要求（通常20-50μg/泳道）進(jìn)行稀釋。

③蛋白質(zhì)變性：向樣品中加入等體積的2×SDS上樣緩沖液（含β-巰基乙醇或DTT），100℃變性5-10分鐘。

④上樣準(zhǔn)備：將變性后的樣品與LoadingBuffer混合均勻，每泳道加入15-20μl，加樣前可在樣品中加入溴酚藍(lán)和二甲苯青FF作為分子量標(biāo)記。

（2）SDS電泳分離

①準(zhǔn)備凝膠：根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量選擇合適濃度的SDS凝膠（如12%-15%），制備分離膠和濃縮膠。

②裂解液上樣：小心將樣品混合物加入梳子孔中，確保加樣量均勻。

③電泳參數(shù)設(shè)置：

a.緩沖液：使用Tris-Glycine緩沖液（濃縮膠）和Tris-Glycine-SDS緩沖液（分離膠）。

b.電壓：濃縮膠80V，分離膠100-120V。

c.時(shí)間：濃縮膠30-45分鐘至溴酚藍(lán)跑至膠底部，分離膠根據(jù)凝膠厚度（1cm膠約1-1.5小時(shí)）。

④注意事項(xiàng)：電泳過(guò)程中保持冷，可使用冷卻液循環(huán)系統(tǒng)。

（3）蛋白轉(zhuǎn)移至膜

①準(zhǔn)備轉(zhuǎn)移裝置：在轉(zhuǎn)移槽中加入冰冷的轉(zhuǎn)移緩沖液（含20%甲醇），預(yù)冷30分鐘。

②轉(zhuǎn)移膜準(zhǔn)備：PVDF膜或NC膜用甲醇浸泡15分鐘，再用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡1小時(shí)。

③裝配系統(tǒng)：依次放置海綿、濾紙（浸濕）、PVDF膜（有劃痕面朝上）、濾紙、海綿，夾緊。

④轉(zhuǎn)移參數(shù)設(shè)置：

a.電壓：0.1-0.2A/cm2，恒流。

b.時(shí)間：1-2小時(shí)（根據(jù)蛋白大小和轉(zhuǎn)移效率調(diào)整）。

c.溫度：4℃冷轉(zhuǎn)移。

⑤轉(zhuǎn)移后處理：取出膜，用轉(zhuǎn)移緩沖液漂洗5分鐘，用TBST緩沖液洗滌10分鐘。

（4）膜封閉

①封閉液準(zhǔn)備：5%脫脂奶