ICS65.020.20

CCSB16

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T2188—2021

農(nóng)桿菌介導(dǎo)油菜黑脛病菌（Leptosphaeria

biglobosa）遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)規(guī)程

TechnicalcodeofpracticeforAgrobacteriumtumefaciens-Mediated

TransformationinLeptosphaeriabiglobosa

2021-05-25發(fā)布2021-06-25實(shí)施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T2188—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧廳提出。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC20）歸口。

本文件起草單位：內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院、內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)信息中心。

本文件主要起草人：宋培玲、李子欽、史志丹、賈曉清、皇甫海燕、燕孟嬌、楊永青、郝麗芬、郭

晨、皇甫九茹、羅軍。

I

DB15/T2188—2021

農(nóng)桿菌介導(dǎo)油菜黑脛病菌（Leptosphaeriabiglobosa）遺傳轉(zhuǎn)化技

術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了農(nóng)桿菌介導(dǎo)油菜黑脛病菌（L.biglobosa）的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)參數(shù)。

本文件適用于油菜黑脛病菌（L.biglobosa）的遺傳轉(zhuǎn)化。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

油菜黑脛病phomastemcanker

由小球腔菌屬弱致病性病原菌（Leptosphaeriabiglobosa）引起的系統(tǒng)性侵染病害，主要危害油

菜莖上部，染病莖稈，病斑早期呈灰色，有黑色邊界，莖稈干枯時(shí)病斑呈灰白色，有時(shí)肉眼可見小黑點(diǎn)，

即無性生殖世代(Phomalingam)子實(shí)體－分生孢子器。

3.2

農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation

農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化（ATMT）是一種依據(jù)農(nóng)桿菌能夠侵染植物的特點(diǎn)將外源基因?qū)胫参锘蚪M中

使目的基因表達(dá)的方法。

4儀器和用具

4.1儀器

電子天平、超凈工作臺(tái)、生物顯微鏡、熒光顯微鏡、離心機(jī)、搖床、純水儀、生化培養(yǎng)箱、冰箱、

高壓滅菌鍋、液氮罐、凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀。

4.2用具

燒杯、、三角瓶、量筒、酒精燈、鑷子、血球計(jì)數(shù)板、接種針、載玻片、蓋玻片、移液器、吸頭、

離心管、培養(yǎng)皿、紗布、漏斗。

5試劑和培養(yǎng)基

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DB15/T2188—2021

5.1試劑

乙酰丁香酮（AS）、2-嗎啉乙磺酸（MES）、潮霉素（Hyg）、卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）、

頭孢噻肟鈉（Cef）、葡萄糖、酵母粉、胰蛋白胨、瓊脂粉、NaCl、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4、

CaCl2·H2O、FeSO4·7H2O、DNA提取試劑盒、瓊脂糖、Taq酶、PCR引物、DL2000DNAMarker。

5.2培養(yǎng)基類型

馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（LB）、共培養(yǎng)培養(yǎng)基（CM）、誘導(dǎo)培養(yǎng)基（IM）、

篩選培養(yǎng)基（SM）。

6遺傳轉(zhuǎn)化方法

6.1用于篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的潮霉素濃度

用孔徑為5mm的打孔器打取黑脛病菌菌餅，接種于含有潮霉素質(zhì)量濃度梯度為0μg/mL、25μg/mL、

50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL的PDA平板上，于25℃下培養(yǎng)7d～12d，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)

化子的潮霉素濃度。

采用菌餅接種法篩選出能夠完全抑制黑脛病菌生長(zhǎng)的潮霉素濃度為50μg/mL。

6.2農(nóng)桿菌菌液制備

將含目標(biāo)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌（如pCHs-GFP）菌株在含（25mg/mL）的卡那霉素和利福平的LB培養(yǎng)基上活

化，3d后挑取單菌落接種于含有上述2種抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm震蕩培養(yǎng)。待

農(nóng)桿菌菌液濃度OD600值為0.6時(shí)，轉(zhuǎn)入IM液體培養(yǎng)基中用于遺傳轉(zhuǎn)化。

6.3分生孢子懸浮液制備

PDA平板活化黑脛病菌，待產(chǎn)孢后，在平板上加2ml～3mL無菌水，靜置10min，無菌載玻片輕刮

平板表面，2層滅菌紗布（經(jīng)緯：21×21/30×28）過濾，血球計(jì)數(shù)板計(jì)算濾液中分生孢子數(shù)，無菌水調(diào)

制懸浮液（106個(gè)/mL），用于遺傳轉(zhuǎn)化。

6.4黑脛病菌遺傳轉(zhuǎn)化

將上述準(zhǔn)備好的孢子懸浮液與農(nóng)桿菌菌液1：1等體積充分混合，取200μL混合液均勻涂布在鋪有

玻璃濾紙（0.6μm～0.8μm）的IM固體平板（含200μmol/mLAS）上，25℃共培養(yǎng)，4d后將玻璃

濾紙揭下，反鋪到含有頭孢噻肟（100mg/mL）和潮霉素（50μg/mL）的SM培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)10d，

獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

7陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的鑒定

7.1陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性鑒定

隨機(jī)挑選數(shù)個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)接到PDA平板上，連續(xù)繼代五代后，再重新轉(zhuǎn)接到潮霉素濃度為50μ

g/mL的PDA平板上，確定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性。

7.2陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定

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DB15/T2188—2021

將上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子和野生型菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，25℃下培養(yǎng)14d，收集菌絲，用

真菌DNA提取試劑盒提取DNA。以野生型菌株DNA為陰性對(duì)照，質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，采用潮霉素抗性基因特

異性引物（hyg）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

hyg抗性基因引物序列“5’-GATGTAGGAGGGCGTGGATA-3’，5’-CTCTGATAGAGTTGGTCAAG-3’”

hyg抗性基因引物反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，56℃退火40s，72℃延伸40s，

35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

PCR反應(yīng)體系(25μL)：基因組DNA10ng，hyg抗性基因上下游引物（0.2μM）各0.5μL，2×EasyTaq

PCRSuperMixforPAGE12.5μL，ddH2O10.5μL。

凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增出與特異hyg基因（712bp）大小一致的片段，確定為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

7.3陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的綠色熒光鑒定

轉(zhuǎn)化質(zhì)粒如帶有g(shù)fp標(biāo)記，可用綠色熒光進(jìn)行鑒定。挑取穩(wěn)定遺傳且PC