ICS67.120

C53

DB34

安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB34/T822—2020

代替DB34/T822-2008

動(dòng)物組織中地西泮的殘留測(cè)定酶聯(lián)免疫

吸附法

DeterminationofdiazepamresidueinanimaltissuesEnzyme-linked

immunosorbentassay

文稿版次選擇

2020-08-03發(fā)布2020-09-03實(shí)施

安徽省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB34/T822—2020

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)代替DB34/T822-2008《動(dòng)物組織中地西泮的殘留測(cè)定－酶聯(lián)免疫吸附法》，除編輯性修改

外主要技術(shù)變化如下：

——修改了標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng)，刪除了標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng)中的連接符“-”；

——修改了試劑和溶液內(nèi)容（見(jiàn)第4章）；

——將上一版本第3章試樣制備和7.1樣品處理合并為第6章試樣制備，優(yōu)化了樣品處理方法（見(jiàn)

第6章）；

——增加了勻漿機(jī)、離心機(jī)的參數(shù)要求（見(jiàn)5.2和5.3）；

——修改百分吸光度值為相對(duì)吸光度，增加了稀釋倍數(shù)換算描述（見(jiàn)第8章）；

——提高了檢測(cè)靈敏度，檢測(cè)限修改為1.0μg/kg（見(jiàn)9.1），且刪除了靈敏度在第1章中的表述；

——修改確認(rèn)方法表述（見(jiàn)10.2）。

本標(biāo)準(zhǔn)由安徽省獸藥飼料監(jiān)察所提出。

本標(biāo)準(zhǔn)由安徽省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：安徽省獸藥飼料監(jiān)察所、安徽華測(cè)檢測(cè)技術(shù)有限公司、寧國(guó)市金鼎家庭農(nóng)場(chǎng)、合

肥市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心、安徽華澳生物技術(shù)有限公司、安徽省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心、合肥市

動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所、安徽省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站、銅陵市義安區(qū)畜牧獸醫(yī)局、寧國(guó)市自然資源和規(guī)劃局。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：許世富、鄭新勇、李生龍、卞紅正、何廣、汪桃花、徐勇、許曉靖、孫德祥、

劉紅云、何為俊、王美娟。

I

DB34/T822—2020

動(dòng)物組織中地西泮的殘留測(cè)定酶聯(lián)免疫吸附法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動(dòng)物肌肉、肝臟、腎臟中地西泮殘留測(cè)定的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于動(dòng)物肌肉、肝臟、腎臟中地西泮殘留的快速測(cè)定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3原理

殘留在組織中的地西泮經(jīng)提取后，用于酶聯(lián)免疫分析。試樣中的地西泮抗原與包被于微孔板中的地

西泮特異性抗體進(jìn)行免疫競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)，加入一定量的顯色底物和終止液，在450nm處進(jìn)行吸光度測(cè)量，

試樣中地西泮的含量與顏色成反比。換算后可以獲得樣本中地西泮的含量。

4試劑和溶液

4.1除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為符合GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水。

4.2競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)免疫法地西泮檢測(cè)試劑盒2℃～8℃冰箱中保存。

4.2.1微孔板：包被有地西泮抗體。

4.2.2地西泮標(biāo)準(zhǔn)溶液：1μg/mL。

4.2.3地西泮標(biāo)準(zhǔn)工作液：0μg/L，0.1μg/L，0.2μg/L，0.4μg/L，0.8μg/L，1.6μg/L。

4.2.4酶標(biāo)二抗。

4.2.5抗體工作液。

4.2.6濃縮復(fù)溶液：0.5％磷酸鹽緩沖液。

4.2.7濃縮洗滌液：含1.0％吐溫20的磷酸鹽緩沖液（pH為7.4）。

4.2.8底物A液：TMB緩沖液。

4.2.9底物B液：雙氧水溶液。

4.2.10顯色劑。

4.2.11終止液：2mol/L的硫酸溶液。

4.3洗滌工作液：用水20倍稀釋廠商提供的濃縮洗滌液。

4.4復(fù)溶工作液：用水2倍稀釋廠商提供的濃縮復(fù)溶液。

4.50.1mol/L氫氧化鈉溶液：稱(chēng)取0.4g氫氧化鈉，加水定容至100mL，混勻備用。

4.6正己烷。

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DB34/T822—2020

5儀器設(shè)備

5.1酶標(biāo)儀（帶450nm濾光片）。

5.2勻漿機(jī)：≥10000rpm。

5.3離心機(jī)：≥5000rpm。

5.4分析天平：感量0.01g。

5.5氮吹儀。

5.6振蕩器。

5.7離心管：20mL。

5.8微量移液器及配套吸頭：（單道50μL，100μL，1000μL，多道50μL～300μL）。

6試樣制備

6.1樣品處理

動(dòng)物肌肉、肝臟、腎臟，去筋后切成小塊，制成肉糜后，10000rpm均質(zhì)2min，取2g±0.05

g均質(zhì)樣品，加入0.1mol/L氫氧化鈉溶液（4.5）8mL，震蕩混勻5min，5000rpm離心10min，

取1mL上清液于另一離心管中，加入10mL正己烷（4.6），震蕩混勻5min，5000rpm離心5min，

取上層正己烷5mL，50℃氮?dú)獯蹈桑?mL樣品復(fù)溶工作液（4.4）溶解，取50μL上清液用于檢

測(cè)。

6.2樣品貯存

將試樣按照測(cè)試和備用分別存放于-20℃～-16℃條件下保存。

7測(cè)定步驟

7.1測(cè)定在室溫20℃～25℃條件下操作，測(cè)定之前將試劑盒以及所有試劑在室溫（20℃～25℃）下放

置1h～2h。

7.2按標(biāo)準(zhǔn)樣品和測(cè)定樣品數(shù)量，取孔條插入微孔架，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄下標(biāo)準(zhǔn)和樣

品的位置。

7.3在標(biāo)準(zhǔn)品和樣品孔條中，分別加入50μL相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液。

7.4在所有孔中加入抗體工作液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)

30min。

7.5揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加入洗滌工作液（4.3）250μL/孔，充分洗滌4次～5次，每次

間隔10s，傾出板孔內(nèi)洗滌液，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破）。

7.6加入酶標(biāo)二抗100μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min，取出

重復(fù)洗板步驟（7.5）。

7.7加入底物液A液50μL/孔，再加入底物液B液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃

避光環(huán)境中反應(yīng)15min（在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色為15min；若顏色較淺，可延

長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到20min或更長(zhǎng)，但不得超過(guò)25min；反之，則減短反應(yīng)時(shí)間）。

7.8加入終止液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，5min內(nèi)在450nm下檢測(cè)吸光度值。

8結(jié)果判定與表述

2

DB34/T822—2020

用獲得的標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液吸光度值的比值進(jìn)行計(jì)算，見(jiàn)式（1）：

按式（1）計(jì)算相對(duì)吸光度值：

B

相對(duì)吸光度值（％）=×100％..............................(1)

B0

式中：

B——標(biāo)準(zhǔn)溶液或供試樣品的吸光度值；

Bo——空白（濃度為0標(biāo)準(zhǔn)溶液）的吸光度值。

將計(jì)算的相對(duì)吸光度值（％）對(duì)應(yīng)地西泮標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（μg/L）的自然對(duì)數(shù)作半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲

線圖，對(duì)應(yīng)的試樣濃度可從校正曲線算出。結(jié)果乘上相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即得樣品中地西泮藥物含量。

9檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度

9.1靈敏度

本方法在動(dòng)物肌肉、肝臟、腎臟中的檢測(cè)限為1.0μg/kg。

9.2準(zhǔn)確度

本方法在2.0μg/kg添加濃度水平上的回收率為80％～100％。

9.3精密度

本方法的批內(nèi)變異系數(shù)CV％≤10％，批間變異系數(shù)CV％≤15％。

10其他

10.1本方法動(dòng)物組織稀釋倍數(shù)為10。

10.2本方法為快速測(cè)定法，檢測(cè)結(jié)果小于1.0μg/kg時(shí)可判為未檢出，大于或等于