ICS65.020.30

CCSB41

DB50

重慶市地方標準

DB50/T1763—2024

四種致兔腹瀉病原菌檢測多重PCR法

2024-12-17發(fā)布2025-03-17實施

重慶市市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB50/T1763—2024

前??言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。

本文件由重慶市畜牧科學院提出。

本文件由重慶市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會歸口并組織實施。

本文件起草單位：重慶市畜牧科學院。

本文件主要起草人：楊柳、許國洋、牟豪、余遠迪、戴玉嬌、付利芝、李星、王永康、白運川。

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四種致兔腹瀉病原菌檢測多重PCR法

1范圍

本文件規(guī)定了四種致兔腹瀉病原菌檢測多重PCR法的檢測原理、儀器設(shè)備、試劑耗材、試劑配制、

方法步驟、結(jié)果描述及判定和生物安全要求。

本文件適用于兔糞便或腸容物中銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌和腸致病性大腸埃

希菌的檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，所注日期的引用文

件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用

于本文件。

GB/T6682分析實驗用水規(guī)格和實驗方法

GB19489實驗室生物安全通用要求

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

多重聚合酶鏈式反應(yīng)(多重PCR)Multiplepolymerasechainreaction

多重聚合酶鏈式反應(yīng)指通過一次PCR反應(yīng)同時對多個靶標進行擴增，結(jié)合一定的檢測手段對擴增產(chǎn)

物進行檢測，從而實現(xiàn)對多個靶標進行診斷的技術(shù)。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

PCR：聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerasechainreaction）

DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）

TAE：三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽（Tris（hydroxymethyl）aminomethaneacetatesalt）

eta：外毒素A（ExotoxinA）

nuc：耐熱核酸酶(Thermostablenuclease）

eae：大腸埃希菌緊密素（E.coliattachingandeffacing）

5檢測原理

用多重PCR法，對四種致兔腹瀉病原菌的特異基因進行擴增，用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

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6儀器設(shè)備

包括以下儀器設(shè)備：

a）PCR儀；

b）全自動凝膠成像儀；

c）電泳儀器；

d）超凈工作臺；

e）A2生物安全柜；

f）高速冷凍離心機；

g）電子天平：感量0.01g。

7試劑耗材

包括以下試劑耗材：

a）商品化的2TaqPCRMasterMix；

b）商品化的2TaqPCRMasterMix；

c）瓊脂糖；

d）商品化的DNA回收試劑盒；

e）商品化的50TAE緩沖液；

f）陽性質(zhì)控菌株：銅綠假單胞菌CVCC3796、產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC1128、金黃色葡萄球菌CVCC1882、

腸致病性大腸埃希菌CVCC1450；

g）陰性質(zhì)控：水；

h）引物：見表1。

注：除特別說明外，所有試劑為分析純或生化試劑；水為符合GB/T6682規(guī)定的一級水。

表1致兔腹瀉的銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌和腸致病性大腸埃希菌檢測引物

病原菌名稱目標基因引物序列產(chǎn)物大小（bp）

上游引物：5＇-AGTTGGTCGCTGAACTGGC-3＇

銅綠假單胞菌eta基因200

下游引物：5＇-TGCATCTCGTTGCTCTCGTG-3＇

上游引物：5＇-AGAGAACATGCATGAGCTTCAA-3＇

產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素基因313

下游引物：5＇-TGCGCTATCAACGGCAGTAA-3＇

上游引物：5＇-TGGCATATGTATGGCAATTGTTTCA-3＇

金黃色葡萄球菌nuc基因609

下游引物：5＇-GCTTGTGCTTCACTTTTTCTTAAA-3＇

腸致病性大腸埃希氏上游引物：5＇-CTCCGATTCCTCTGGTGACG-3＇

eae基因1053

菌下游引物：5＇-TGGCCTTGCCAGGAGTATTG-3＇

8試劑配制

8.11TAE緩沖液（1L）

取50TAE緩沖液20mL,加水950mL充分混勻，用水定容至1L，作好標記備用。

2

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8.21.0%瓊脂糖凝膠（100mL）

稱量瓊脂糖1.0g，加1TAE緩沖液100mL充分混勻，放入微波爐中融化，冷卻至60℃左右后

加入10μLGoldViewI核酸染料，輕輕搖勻后倒膠（避免產(chǎn)生氣泡），待膠完全凝固后備用。

9方法步驟

9.1樣品采集

采集糞便或腸容物等作為待測樣品，置于無菌采樣袋內(nèi)或拭子管中。

9.2運輸與保存

4℃冷藏保存，24h內(nèi)送實驗室檢測。

9.3DNA提取

按試劑盒說明書提取DNA作為模版，-80℃保存，備用。

9.4檢測

9.4.1反應(yīng)體系組成

檢測反應(yīng)體系配制見表2。

表2反應(yīng)體系配制表

體系組分用量（μL）

2TaqPCRMasterMix（含染料）12.50

銅綠假單胞菌上游引物（10μmol/L）0.25

銅綠假單胞菌下游引物（10μmol/L）0.25

產(chǎn)氣莢膜梭菌上游引物（10μmol/L）0.25

產(chǎn)氣莢膜梭菌下游引物（10μmol/L）0.25

金黃色葡萄球菌上游引物（10μmol/L）0.25

金黃色葡萄球下游引物（10μmol/L）0.25

腸致病性大腸埃希菌上游引物（10μmol/L）0.25

腸致病性大腸埃希菌下游引物（10μmol/L）0.25

DNA模板8.00

水2.50

總體積25.00

9.4.2反應(yīng)參數(shù)和程序

反應(yīng)參數(shù)和程序如下：

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a）95℃預變性5min；

b）95℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，共35個循環(huán)；

c）72℃終延伸10min。

9.4.3電泳檢測

將適量PCR產(chǎn)物加入到1.0%瓊脂糖凝膠加樣孔中，同時加入GoldBandDL2000Marker作參考，

并設(shè)陰性對照、陽性對照。

注：電泳條件：電壓10V/cm～20V/cm，時間25min～30min。

9.4.4拍照分析

用全自動凝膠成像儀對電泳膠拍照；參照DNA分子量標準，判斷PCR產(chǎn)物片段大小。

10結(jié)果描述及判定

10.1試驗成立的條件

陽性對照在200bp、313bp、609bp和1053bp處有特異性條帶；陰性對照無對應(yīng)擴增條帶，否則

試驗不成立。

10.2結(jié)果描述

10.2.1陰性判定

在試驗成立的前提下，檢測樣