細胞實驗室操作規(guī)范一、實驗室安全1.個人防護-進入細胞實驗室必須穿著實驗室專用的白大褂，且白大褂應(yīng)保持清潔，定期清洗和更換。白大褂應(yīng)完全覆蓋身體前側(cè)，袖口扣緊，防止細胞培養(yǎng)液等濺到身上。-佩戴一次性手套，手套應(yīng)無破損。在接觸不同細胞樣本、試劑或進行不同操作步驟前后，都要更換手套，避免交叉污染。如手套有明顯污染或破損，應(yīng)立即更換。-佩戴護目鏡，尤其是在進行可能產(chǎn)生氣溶膠或液體飛濺的操作時，如離心管打開、移液器吹打等，以保護眼睛免受細胞培養(yǎng)液、試劑等的傷害。-長發(fā)應(yīng)束起，避免頭發(fā)接觸到實驗操作臺面或細胞培養(yǎng)物。2.實驗室環(huán)境安全-實驗室應(yīng)保持整潔，每天實驗結(jié)束后，要對操作臺面、地面等進行清潔和消毒。使用75%酒精擦拭操作臺面，用含氯消毒劑拖地。-實驗室的通風系統(tǒng)應(yīng)保持良好運行，確保室內(nèi)空氣流通，及時排出有害氣體和異味。定期檢查通風設(shè)備的性能，如有故障及時維修。-消防設(shè)備應(yīng)定期檢查和維護，確保其處于可用狀態(tài)。滅火器應(yīng)放置在明顯且易于取用的位置，實驗室人員應(yīng)熟悉滅火器的使用方法。-實驗室的水電設(shè)施應(yīng)定期檢查，避免出現(xiàn)漏電、漏水等安全隱患。電器設(shè)備使用完畢后應(yīng)及時關(guān)閉電源，避免長時間待機。二、細胞培養(yǎng)操作規(guī)范1.細胞復蘇-從液氮罐中取出凍存的細胞管時，要佩戴隔熱手套，防止凍傷。迅速將細胞管放入37℃水浴鍋中，輕輕晃動，使細胞快速解凍。解凍時間一般不超過1分鐘。-解凍后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至含有適量完全培養(yǎng)基的離心管中，1000-1200rpm離心5-10分鐘，棄去上清液。注意離心速度和時間要根據(jù)細胞類型進行適當調(diào)整。-用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞接種到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種密度要根據(jù)細胞類型和實驗需求進行合理調(diào)整。2.細胞傳代-當細胞生長至對數(shù)生長期且匯合度達到80%-90%時，進行傳代操作。首先，吸去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2-3次，以去除殘留的血清和代謝產(chǎn)物。-加入適量的胰蛋白酶-EDTA消化液，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使消化液均勻覆蓋細胞表面。將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-5分鐘，具體消化時間根據(jù)細胞類型而定。在顯微鏡下觀察細胞，當細胞變圓、開始脫離瓶壁時，立即加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化。-用移液器輕輕吹打細胞，使細胞完全分散成單個細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000-1200rpm離心5-10分鐘，棄去上清液。-用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細胞，按照適當?shù)谋壤龑⒓毎臃N到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)。3.細胞凍存-選擇處于對數(shù)生長期的健康細胞進行凍存。吸去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗細胞2-3次。-加入胰蛋白酶-EDTA消化液消化細胞，方法同細胞傳代。消化后加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000-1200rpm離心5-10分鐘，棄去上清液。-用預冷的凍存液（一般為含10%DMSO的完全培養(yǎng)基）重懸細胞，調(diào)整細胞密度至1×10?-1×10?個/ml。將細胞懸液分裝入凍存管中，每管1-1.5ml。-將凍存管放入程序降溫盒中，置于-80℃冰箱過夜，然后轉(zhuǎn)移至液氮罐中長期保存。三、無菌操作技術(shù)1.超凈工作臺的使用-使用前，提前30分鐘打開超凈工作臺的紫外燈進行消毒。消毒結(jié)束后，關(guān)閉紫外燈，打開風機，讓超凈工作臺運行5-10分鐘，使空氣流通并去除臭氧。-操作前，用75%酒精擦拭超凈工作臺的臺面和內(nèi)壁，將所需的實驗物品放入超凈工作臺內(nèi)，擺放整齊。實驗物品應(yīng)盡量靠近工作臺的中心區(qū)域，避免在邊緣操作。-在超凈工作臺內(nèi)操作時，應(yīng)避免大幅度的動作，減少空氣擾動。手臂應(yīng)緩慢移動，避免快速揮動。-操作過程中，盡量保持超凈工作臺內(nèi)物品的整潔，用過的物品及時清理，避免堆積。2.移液器的使用-使用前，檢查移液器的量程是否符合實驗要求，調(diào)節(jié)移液器的刻度。移液器應(yīng)垂直拿取，避免傾斜。-安裝移液器吸頭時，應(yīng)將吸頭緊密安裝在移液器上，確保無漏氣現(xiàn)象。吸取液體時，將移液器吸頭垂直插入液體中，緩慢按下移液器按鈕，吸取所需體積的液體。-放出液體時，將移液器吸頭靠在容器內(nèi)壁，緩慢松開按鈕，使液體緩慢流出。放出液體后，在容器內(nèi)壁停留1-2秒，確保液體完全流出。-使用完畢后，將移液器調(diào)至最大量程，安裝好保護套，放置在移液器架上。定期對移液器進行校準和維護。3.培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板的操作-打開培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板的蓋子時，應(yīng)將蓋子倒扣在超凈工作臺的臺面上，避免蓋子上的灰塵或細菌污染培養(yǎng)物。-向培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中添加液體時，移液器吸頭不要接觸培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板的瓶口或孔邊緣，防止污染。-操作結(jié)束后，及時蓋上培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板的蓋子，確保密封良好。四、試劑和耗材的管理1.試劑的儲存-不同類型的試劑應(yīng)分類儲存，如培養(yǎng)基、血清、抗生素等應(yīng)分別儲存。試劑應(yīng)按照說明書的要求儲存于合適的溫度和環(huán)境中，如有些試劑需要冷藏（2-8℃），有些試劑需要冷凍（-20℃或-80℃）。-試劑瓶上應(yīng)標明試劑名稱、濃度、儲存日期、有效期等信息。過期的試劑應(yīng)及時清理和銷毀，避免使用。-試劑的儲存容器應(yīng)密封良好，防止試劑揮發(fā)或受到污染。對于易潮解的試劑，應(yīng)儲存于干燥器中。2.耗材的使用和管理-一次性耗材如培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、移液器吸頭、離心管等應(yīng)在使用前檢查是否有破損或污染。如有問題，應(yīng)及時更換。-使用后的一次性耗材應(yīng)放入專用的垃圾袋或利器盒中，按照生物廢棄物的處理方法進行處理。-非一次性耗材如玻璃器皿等，使用后應(yīng)及時清洗和消毒。清洗后的玻璃器皿應(yīng)晾干或烘干，然后進行高壓蒸汽滅菌處理。五、實驗記錄和數(shù)據(jù)處理1.實驗記錄-每次實驗都應(yīng)詳細記錄實驗日期、實驗人員、實驗目的、實驗方法、實驗步驟、實驗結(jié)果等信息。實驗記錄應(yīng)使用鋼筆或中性筆書寫，字跡清晰，不得涂改。如需要修改，應(yīng)在錯誤的內(nèi)容上劃一條橫線，在旁邊注明正確的內(nèi)容，并簽名和注明修改日期。-對于細胞培養(yǎng)實驗，應(yīng)記錄細胞的來源、培養(yǎng)條件、傳代次數(shù)、細胞形態(tài)等信息。對于實驗結(jié)果，應(yīng)記錄觀察到的現(xiàn)象、測量的數(shù)據(jù)等。-實驗記錄應(yīng)保存完整，便于后續(xù)的查詢和分析?？梢詫嶒炗涗浾沓呻娮游臋n，進行備份。2.數(shù)據(jù)處理-對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析時，應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計方法。根據(jù)數(shù)據(jù)的類型（如計量資料、計數(shù)資料）和實驗設(shè)計（如單因素設(shè)計、多因素設(shè)計）選擇相應(yīng)的統(tǒng)計方法。-使用統(tǒng)計軟件（如SPSS、GraphPadPrism等）進行數(shù)據(jù)處理和分析。在使用統(tǒng)計軟件時，應(yīng)正確輸入數(shù)據(jù)，選擇合適的分析選項。-對實驗結(jié)果進行圖表制作時，應(yīng)選擇合適的圖表類型（如柱狀圖、折線圖、散點圖等）。圖表應(yīng)清晰、準確地反映實驗數(shù)據(jù)，圖表標題、坐標軸標簽等應(yīng)標注清楚。六、細胞實驗室常見問題及解決方法1.細胞污染問題-細菌污染：表現(xiàn)為培養(yǎng)液變渾濁，顯微鏡下可見大量的細菌。一旦發(fā)現(xiàn)細菌污染，應(yīng)立即丟棄被污染的細胞培養(yǎng)物，對相關(guān)的實驗物品進行消毒處理。預防細菌污染的方法包括嚴格遵守無菌操作技術(shù)、定期對實驗室環(huán)境進行消毒等。-真菌污染：表現(xiàn)為培養(yǎng)液中出現(xiàn)白色或黃色的絲狀菌落，顯微鏡下可見真菌的菌絲和孢子。對于真菌污染的細胞培養(yǎng)物，也應(yīng)及時丟棄。預防真菌污染可以通過保持實驗室環(huán)境干燥、避免在潮濕的環(huán)境中操作等方法。-支原體污染：支原體污染一般無明顯的肉眼可見變化，但會影響細胞的生長和代謝?？梢允褂弥гw檢測試劑盒定期對細胞進行檢測。如果發(fā)現(xiàn)支原體污染，可以使用支原體清除劑處理細胞，或丟棄被污染的細胞。2.細胞生長不良問題-培養(yǎng)基問題：培養(yǎng)基的成分、pH值、滲透壓等因素都會影響細胞的生長。應(yīng)確保培養(yǎng)基的質(zhì)量，按照說明書的要求配制和儲存培養(yǎng)基。定期檢查培養(yǎng)基的pH值和滲透壓，如有異常及時調(diào)整。-血清問題：血清的質(zhì)量對細胞的生長至關(guān)重要。應(yīng)選擇質(zhì)量可靠的血清，避免使用過期或質(zhì)量不佳的血清。血清在使用前應(yīng)進行滅活處理，以去除補體等成分。-培養(yǎng)條件問題：細胞的培養(yǎng)溫度、CO?濃度等培養(yǎng)條件應(yīng)嚴格控制。定期檢查培養(yǎng)箱的溫度和CO?濃度，確保其穩(wěn)定在合適的范圍內(nèi)。七、細胞實驗室操作規(guī)范的考核一、選擇題（每題3分，共30分）1.進入細胞實驗室不需要佩戴的防護用品是（）A.白大褂B.手套C.墨鏡D.護目鏡2.細胞復蘇時，水浴鍋的溫度一般為（）A.25℃B.37℃C.42℃D.56℃3.細胞傳代時，胰蛋白酶-EDTA消化液消化細胞的時間一般為（）A.1-5分鐘B.5-10分鐘C.10-15分鐘D.15-20分鐘4.細胞凍存時，凍存液中DMSO的濃度一般為（）A.5%B.10%C.15%D.20%5.超凈工作臺使用前，紫外燈消毒的時間一般為（）A.10分鐘B.20分鐘C.30分鐘D.60分鐘6.移液器吸取液體時，吸頭應(yīng)（）A.傾斜插入液體中B.垂直插入液體中C.隨意插入液體中D.先傾斜再垂直插入液體中7.培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板的蓋子打開后，應(yīng)（）A.正放在超凈工作臺的臺面上B.倒扣在超凈工作臺的臺面上C.拿在手中D.放在實驗臺上8.試劑儲存時，易潮解的試劑應(yīng)儲存于（）A.冰箱中B.干燥器中C.常溫下D.液氮罐中9.實驗記錄應(yīng)使用（）書寫A.鉛筆B.圓珠筆C.鋼筆或中性筆D.彩筆10.細胞污染中，支原體污染一般（）A.培養(yǎng)液變渾濁B.出現(xiàn)白色或黃色的絲狀菌落C.無明顯的肉眼可見變化D.細胞迅速死亡二、填空題（每題3分，共30分）1.細胞實驗室個人防護用品包括白大褂、手套、護目鏡和______。2.細胞復蘇時，將細胞管放入______℃水浴鍋中快速解凍。3.細胞傳代時，用______緩沖液沖洗細胞以去除殘留的血清和代謝產(chǎn)物。4.細胞凍存時，先將凍存管放入______中，置于-80℃冰箱過夜，然后轉(zhuǎn)移至液氮罐中長期保存。5.超凈工作臺使用前，應(yīng)提前______分鐘打開紫外燈進行消毒。6.移液器使用完畢后，應(yīng)將移液器調(diào)至______量程。7.培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板操作時，移液器吸頭不要接觸培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板的______邊緣。8.試劑應(yīng)按照說明書的要求儲存于合適的______和環(huán)境中。9.實驗記錄應(yīng)保存完整，便于后續(xù)的______和分析。10.細胞污染中，細菌污染表現(xiàn)為培養(yǎng)液______。三、判斷題（每題2分，共20分）1.進入細胞實驗室可以不穿白大褂。（）2.細胞復蘇時，解凍時間可以超過2分鐘。（）3.細胞傳代時，消化時間越長越好。（）4.超凈工作臺使用時，紫外燈可以一直開著。（）5.移液器吸頭安裝不緊密也不會影響實驗結(jié)果。（）6.培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板的蓋子打開后，可以隨便放置。（）7.試劑可以隨意混合儲存。（）8.實驗記錄可以隨意涂改。（）9.細胞生長不良一定是培養(yǎng)基的問題。（）10.發(fā)現(xiàn)細胞污染后，應(yīng)立即丟棄被污染的細胞培養(yǎng)物。（）四、簡答題（每題10分，共20分）1.簡述細胞復蘇的操作步驟。2.簡述無菌操作技術(shù)在細胞實驗室中的重要性及主要措施。答案一、選擇題1.C2.B3.A4.B5.C6.B7.B8.B9.C10.C二、填空題1.束發(fā)帶2.373.PBS4.程序降溫盒5.306.最大7.瓶口或孔8.溫度9.查詢10.變渾濁三、判斷題1.×2.×3.×4.×5.×6.×7.×8.×9.×10.√四、簡答題1.細胞復蘇的操作步驟如下：-從液氮罐中取出凍存的細胞管時，佩戴隔熱手套，迅速將細胞管放入37℃水浴鍋中，輕輕晃動，使細胞快速解凍，解凍時間一般不超過1分鐘。-解凍后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至含有適量完全培養(yǎng)基的離心管中，1000-1200rpm離心5-10分鐘，棄去上清液。-用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞接種到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.無菌操作技術(shù)在細胞實驗室中的重要性：細胞培養(yǎng)是一個嚴格的無菌過程，無菌操作技術(shù)可以防止細菌、真菌、支原體