塞來昔布對胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖及干性標(biāo)記物CD133表達(dá)的調(diào)控機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義胰腺癌是一種主要起源于胰腺導(dǎo)管上皮及腺泡細(xì)胞的惡性腫瘤，被稱為“萬癌之王”，其惡性程度極高，起病隱匿，早期診斷困難，進(jìn)展迅速，生存時(shí)間短，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。據(jù)胰腺癌行動(dòng)網(wǎng)絡(luò)（PanCAN）統(tǒng)計(jì)，胰腺癌是美國與癌癥相關(guān)的第三大死亡原因，僅次于肺癌和結(jié)直腸癌，并預(yù)計(jì)在2030年會(huì)超越結(jié)直腸癌成為第二大死因。2019年中國國家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，胰腺癌位列中國惡性腫瘤的發(fā)病率第10位，惡性腫瘤死亡率的第6位，在男性和女性腫瘤相關(guān)死因中居于第6位和第7位。胰腺癌患者約有80%在確診時(shí)已處于晚期，5年生存率僅有10%，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。目前，胰腺癌的治療方法主要包括手術(shù)切除、化療、放療等，但由于其易轉(zhuǎn)移、對放化療不敏感以及難以早期診斷等特點(diǎn)，這些傳統(tǒng)治療手段的效果往往不盡人意。手術(shù)切除是胰腺癌的主要治療方法，但只有少數(shù)患者在確診時(shí)處于早期階段，適合進(jìn)行手術(shù)，且手術(shù)難度大，術(shù)后恢復(fù)慢，手術(shù)死亡率較高。化療和放療雖然可以在一定程度上控制腫瘤的生長和擴(kuò)散，但由于胰腺癌細(xì)胞的耐藥性和對放化療的低敏感性，其治療效果有限，且會(huì)帶來一系列嚴(yán)重的副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此，尋找一種更有效的治療方法或藥物，提高胰腺癌的治療效果，改善患者的預(yù)后，成為了當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問題。塞來昔布作為一種非甾體抗炎藥物，已被廣泛應(yīng)用于治療風(fēng)濕病和疼痛等臨床領(lǐng)域。近年來，越來越多的研究表明，塞來昔布不僅具有抗炎、鎮(zhèn)痛的作用，還具有潛在的抗腫瘤活性，對多種腫瘤細(xì)胞，包括胰腺癌細(xì)胞，具有生長抑制、誘導(dǎo)凋亡、抑制遷移和侵襲等作用。其作用機(jī)制可能與抑制環(huán)氧化酶-2（COX-2）的活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)等有關(guān)。例如，有研究發(fā)現(xiàn)塞來昔布可以通過抑制COX-2的活性，減少前列腺素E2的合成，從而抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移；還有研究表明，塞來昔布能夠上調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡。此外，塞來昔布還可以通過抑制腫瘤新生血管的生成，切斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長。腫瘤干細(xì)胞（CancerStemCells，CSCs）是腫瘤組織中存在的一小部分具有自我更新、多向分化潛能和高致瘤性的細(xì)胞群體，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。CD133作為一種腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物，在胰腺癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并且與腫瘤的惡性程度、化療耐藥、放療抵抗以及不良預(yù)后密切相關(guān)。研究表明，CD133陽性的胰腺癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力、遷移和侵襲能力，能夠抵抗化療藥物和放療的殺傷作用，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，深入研究CD133在胰腺癌中的表達(dá)及作用機(jī)制，對于開發(fā)新的治療靶點(diǎn)和策略具有重要意義。本研究旨在探討塞來昔布對胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖和干性標(biāo)記物CD133表達(dá)的影響，從細(xì)胞和分子水平揭示塞來昔布的抗腫瘤作用機(jī)制。通過研究塞來昔布對胰腺癌細(xì)胞株SW1990的作用，有望為胰腺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)，為開發(fā)更有效的胰腺癌治療方案奠定基礎(chǔ)。在理論上，有助于深入理解塞來昔布的抗腫瘤作用機(jī)制，豐富對胰腺癌發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)的認(rèn)識，為進(jìn)一步研究腫瘤干細(xì)胞在胰腺癌中的作用提供參考；在實(shí)踐中，若能證實(shí)塞來昔布對胰腺癌的治療效果，將為臨床治療提供新的選擇，提高患者的生存率和生活質(zhì)量，具有重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，關(guān)于塞來昔布對胰腺癌細(xì)胞作用的研究在國內(nèi)外都取得了一定進(jìn)展。國外有研究團(tuán)隊(duì)通過體外實(shí)驗(yàn)，利用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法研究熱療、塞來昔布及聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對人胰腺癌細(xì)胞SW1990細(xì)胞增殖的抑制作用，發(fā)現(xiàn)塞來昔布聯(lián)合熱療對胰腺癌SW1990細(xì)胞生長具有協(xié)同抑制效應(yīng)，兩者聯(lián)用可能通過上調(diào)HSP70、bax、p16和p27KiP1的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯。國內(nèi)也有學(xué)者采用克隆形成實(shí)驗(yàn)和裸鼠移植瘤模型觀察塞來昔布、放療和兩者聯(lián)合對胰腺癌細(xì)胞SW1990體內(nèi)外增殖的影響，結(jié)果表明塞來昔布在體內(nèi)外均有放射增敏作用，能誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡，下調(diào)bcl-2mRNA表達(dá)，還能抑制胰腺癌細(xì)胞合成、分泌和激活MMP-2、MMP一9，從而抑制體外胰腺癌細(xì)胞的新生血管生成和侵襲。在CD133在胰腺癌中作用的研究方面，國外有學(xué)者應(yīng)用磁珠分選法分選CD133+胰腺癌干細(xì)胞，用MTT法和流式細(xì)胞儀觀察放射線干預(yù)后胰腺癌不同細(xì)胞亞群的增殖活性及細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)CD133+干細(xì)胞是導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞放療耐受的重要原因之一，而G0/G1期比例高可能是其機(jī)制之一。國內(nèi)也有研究通過將人胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3裸鼠爪墊皮下連續(xù)接種法建立淋巴道轉(zhuǎn)移模型，篩選、建立高淋巴轉(zhuǎn)移胰腺癌細(xì)胞系，并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞系中CD133的表達(dá)，成功構(gòu)建了裸鼠人胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3淋巴道轉(zhuǎn)移模型，獲得了具有高侵襲性、高淋巴轉(zhuǎn)移能力的胰腺癌BxPC-3-LN細(xì)胞系，且該細(xì)胞系CD133陽性細(xì)胞比例明顯高于母代細(xì)胞，說明CD133與胰腺癌的轉(zhuǎn)移等惡性行為密切相關(guān)。然而，當(dāng)前研究仍存在一些不足。雖然已經(jīng)明確塞來昔布對胰腺癌細(xì)胞有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡等作用，以及CD133在胰腺癌的惡性進(jìn)展中扮演重要角色，但對于塞來昔布是否能通過影響CD133的表達(dá)來發(fā)揮對胰腺癌細(xì)胞的作用，相關(guān)研究還較為缺乏。二者之間潛在的聯(lián)系尚未被深入挖掘，這限制了對塞來昔布抗腫瘤機(jī)制的全面理解，也影響了基于此開發(fā)更有效治療策略的進(jìn)程。本研究擬在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，聚焦塞來昔布對胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖和干性標(biāo)記物CD133表達(dá)的影響，有望填補(bǔ)這一領(lǐng)域在該方面研究的空白，為胰腺癌的治療提供新的思路和靶點(diǎn)。1.3研究目的與內(nèi)容本研究的主要目的是深入探究塞來昔布對胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖和干性標(biāo)記物CD133表達(dá)的影響，并初步探討其潛在的作用機(jī)制，為胰腺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。在研究內(nèi)容方面，首先開展細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。運(yùn)用MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)，檢測不同濃度塞來昔布作用于胰腺癌細(xì)胞株SW1990不同時(shí)間后，細(xì)胞的增殖活性變化。通過繪制細(xì)胞生長曲線和克隆形成率，直觀地分析塞來昔布對SW1990細(xì)胞增殖的抑制作用，明確其抑制效果是否呈劑量和時(shí)間依賴性。其次進(jìn)行CD133表達(dá)檢測。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（RT-qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot），分別從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測塞來昔布處理前后，SW1990細(xì)胞中CD133的表達(dá)情況。通過對比實(shí)驗(yàn)組和對照組的檢測結(jié)果，確定塞來昔布對CD133表達(dá)的影響是上調(diào)還是下調(diào)。再者實(shí)施細(xì)胞周期與凋亡分析。利用流式細(xì)胞術(shù)，檢測塞來昔布處理后SW1990細(xì)胞的周期分布和凋亡率變化。觀察細(xì)胞周期是否被阻滯在某個(gè)特定時(shí)期，以及凋亡率是否增加，初步探討塞來昔布影響細(xì)胞增殖和CD133表達(dá)的作用途徑是否與細(xì)胞周期調(diào)控和誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。最后開展分子機(jī)制初步探討。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)和前期研究基礎(chǔ)，選取與細(xì)胞增殖、凋亡以及CD133調(diào)控相關(guān)的信號通路關(guān)鍵分子，如PI3K/AKT、Wnt/β-catenin等信號通路中的蛋白。運(yùn)用Westernblot等技術(shù)檢測這些分子在塞來昔布處理前后的表達(dá)和磷酸化水平變化，初步揭示塞來昔布影響SW1990細(xì)胞增殖和CD133表達(dá)的分子機(jī)制。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)方法，深入探究塞來昔布對胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖和干性標(biāo)記物CD133表達(dá)的影響。在細(xì)胞培養(yǎng)方面，從液氮罐中取出凍存的胰腺癌細(xì)胞株SW1990，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍，將解凍后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有完全培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基添加10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。MTT法用于檢測細(xì)胞增殖活性。取對數(shù)生長期的SW1990細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，每孔體積為200μL。培養(yǎng)24小時(shí)后，分別加入不同濃度（0、25、50、100、200μmol/L）的塞來昔布溶液，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置不加藥物的對照組。分別在處理24、48、72小時(shí)后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4小時(shí)。孵育結(jié)束后，棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（A）值，以A值表示細(xì)胞增殖活性，繪制細(xì)胞生長曲線，分析塞來昔布對細(xì)胞增殖的抑制作用及劑量-時(shí)間依賴性?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞增殖能力。將SW1990細(xì)胞消化后制成單細(xì)胞懸液，以每皿500個(gè)細(xì)胞的密度接種于60mm培養(yǎng)皿中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24小時(shí)后，加入不同濃度（0、50、100μmol/L）的塞來昔布溶液。繼續(xù)培養(yǎng)10-14天，期間每隔2-3天更換一次含藥培養(yǎng)基。待肉眼可見明顯的細(xì)胞集落時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌2次，加入4%多聚甲醛固定15分鐘，棄去固定液，用0.1%結(jié)晶紫染色15分鐘，流水沖洗，晾干，計(jì)數(shù)含50個(gè)細(xì)胞以上的集落數(shù)，計(jì)算克隆形成率，公式為：克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。采用RT-PCR檢測CD133mRNA表達(dá)水平。使用Trizol試劑提取塞來昔布處理后的SW1990細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用CD133和內(nèi)參基因GAPDH的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。CD133上游引物：5'-[具體序列1]-3'，下游引物：5'-[具體序列2]-3'；GAPDH上游引物：5'-[具體序列3]-3'，下游引物：5'-[具體序列4]-3'。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析，以CD133與GAPDH條帶灰度值的比值表示CD133mRNA的相對表達(dá)量。通過Westernblot檢測CD133蛋白表達(dá)情況。收集塞來昔布處理后的SW1990細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1小時(shí)，加入CD133一抗（1:1000稀釋）和內(nèi)參β-actin一抗（1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗滌3次，每次10分鐘，使用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光成像，以CD133與β-actin條帶灰度值的比值表示CD133蛋白的相對表達(dá)量。流式細(xì)胞術(shù)用于細(xì)胞周期與凋亡分析。收集塞來昔布處理后的SW1990細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入70%冷乙醇，4℃固定過夜。固定后的細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入500μL含有50μg/mLPI和100μg/mLRNaseA的染色緩沖液，室溫避光孵育30分鐘，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布，分析G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞的比例。細(xì)胞凋亡檢測時(shí)，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，室溫避光孵育15分鐘，再加入400μL結(jié)合緩沖液，使用流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞比例，區(qū)分早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞。本研究的技術(shù)路線流程如下：首先復(fù)蘇培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞株SW1990，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好后，進(jìn)行分組處理，分別設(shè)置對照組和不同濃度塞來昔布處理組。對各處理組細(xì)胞依次開展MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖活性；運(yùn)用RT-PCR和Westernblot技術(shù)分別從mRNA和蛋白水平檢測CD133表達(dá)；采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布和凋亡率；最后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，探究塞來昔布對胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖和干性標(biāo)記物CD133表達(dá)的影響及潛在作用機(jī)制。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1胰腺癌概述胰腺癌是一種起源于胰腺導(dǎo)管上皮及腺泡細(xì)胞的惡性腫瘤，因其惡性程度極高、預(yù)后極差，而被稱為“癌中之王”。胰腺作為人體重要的消化和內(nèi)分泌器官，位置較為隱匿，其分泌的多種消化酶和激素對維持人體正常生理功能起著關(guān)鍵作用。然而，當(dāng)胰腺細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化形成胰腺癌時(shí)，這些正常功能會(huì)受到嚴(yán)重破壞。在全球范圍內(nèi)，胰腺癌的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢。據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的GLOBOCAN2020數(shù)據(jù)顯示，胰腺癌在全球范圍內(nèi)的新發(fā)病例數(shù)約為49.6萬，位居所有惡性腫瘤的第13位。在美國，胰腺癌是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，其發(fā)病率在男性和女性中分別位居第10位和第11位。在中國，隨著人口老齡化、生活方式改變以及環(huán)境因素的影響，胰腺癌的發(fā)病率也在不斷攀升。2016年中國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，胰腺癌的發(fā)病率已達(dá)到4.86/10萬，在男性和女性中分別位列第10位和第11位。胰腺癌不僅發(fā)病率高，其死亡率也相當(dāng)驚人，幾乎與發(fā)病率持平。同樣以GLOBOCAN2020數(shù)據(jù)為例，全球胰腺癌死亡病例數(shù)約為46.6萬，死亡率位居所有惡性腫瘤的第7位。在中國，胰腺癌的死亡率也居高不下，2016年中國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，胰腺癌的死亡率為4.52/10萬，在男性和女性中分別位列第6位和第7位。由于胰腺癌早期癥狀不明顯，缺乏有效的早期診斷方法，大部分患者在確診時(shí)已處于晚期，失去了手術(shù)根治的機(jī)會(huì)。即使是接受了手術(shù)治療的患者，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)也很高，5年生存率極低，僅為5%-10%左右。胰腺癌的高惡性程度和差預(yù)后主要?dú)w因于以下幾個(gè)方面。其一，胰腺的解剖位置特殊，周圍有重要的血管和器官，使得手術(shù)切除難度極大，且容易侵犯周圍組織和器官，導(dǎo)致手術(shù)切除不徹底。其二，胰腺癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，早期即可發(fā)生局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，常見的轉(zhuǎn)移部位包括肝臟、肺、腹膜和淋巴結(jié)等。其三，胰腺癌對放化療不敏感，傳統(tǒng)的放化療方案難以取得理想的治療效果，且會(huì)給患者帶來嚴(yán)重的副作用，進(jìn)一步降低患者的生活質(zhì)量和身體抵抗力。其四，目前缺乏有效的早期診斷標(biāo)志物和篩查手段，使得大多數(shù)患者在出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)才被診斷出來，此時(shí)腫瘤往往已經(jīng)進(jìn)展到晚期。胰腺癌嚴(yán)重威脅著人類的生命健康，給患者及其家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。由于其發(fā)病率和死亡率的不斷上升，胰腺癌已成為全球范圍內(nèi)亟待解決的重大公共衛(wèi)生問題。尋找有效的治療方法和早期診斷手段，提高胰腺癌患者的生存率和生活質(zhì)量，是當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。2.2腫瘤干細(xì)胞理論腫瘤干細(xì)胞（CancerStemCells，CSCs）這一概念的提出，為腫瘤的研究帶來了全新的視角。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中一小部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞群體，它們具有自我更新、多向分化潛能和高致瘤性等獨(dú)特性質(zhì)。美國癌癥研究協(xié)會(huì)（AACR）在2006年對腫瘤干細(xì)胞給出了明確的定義：腫瘤中具有自我更新能力并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞。自我更新是腫瘤干細(xì)胞的關(guān)鍵特性之一，這意味著它們能夠通過不對稱分裂產(chǎn)生與自身相同的子代細(xì)胞，從而維持腫瘤干細(xì)胞群體的穩(wěn)定。這種自我更新能力使得腫瘤干細(xì)胞能夠持續(xù)存在于腫瘤組織中，即使在常規(guī)治療手段如手術(shù)、化療和放療后，它們也能迅速增殖，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。例如，在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞可以通過自我更新不斷補(bǔ)充腫瘤細(xì)胞群體，使得腫瘤難以被徹底清除。多向分化潛能也是腫瘤干細(xì)胞的重要特征。腫瘤干細(xì)胞能夠分化成多種不同類型的腫瘤細(xì)胞，形成腫瘤組織的異質(zhì)性。這種異質(zhì)性使得腫瘤在形態(tài)、功能和對治療的反應(yīng)上表現(xiàn)出多樣性，增加了治療的難度。以白血病干細(xì)胞為例，它可以分化為多種不同類型的白血病細(xì)胞，導(dǎo)致白血病的復(fù)雜性和難治性。腫瘤干細(xì)胞的高致瘤性體現(xiàn)在其極低的細(xì)胞數(shù)量就能在體內(nèi)形成腫瘤。研究表明，只需極少量的腫瘤干細(xì)胞，如乳腺癌干細(xì)胞，接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，就能夠形成與原發(fā)腫瘤相似的腫瘤組織。這說明腫瘤干細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，是腫瘤的“種子”細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移過程中扮演著至關(guān)重要的角色。在腫瘤發(fā)生階段，腫瘤干細(xì)胞可能起源于正常干細(xì)胞或祖細(xì)胞的基因突變，這些突變賦予了它們異常的增殖和分化能力，從而導(dǎo)致腫瘤的起始。在腫瘤發(fā)展過程中，腫瘤干細(xì)胞通過自我更新和分化，不斷擴(kuò)充腫瘤細(xì)胞群體，促進(jìn)腫瘤的生長和侵襲。當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)，腫瘤干細(xì)胞能夠遷移到遠(yuǎn)處組織，并在新的部位形成轉(zhuǎn)移瘤，這是導(dǎo)致腫瘤患者預(yù)后不良的重要原因。此外，腫瘤干細(xì)胞對傳統(tǒng)的放化療具有很強(qiáng)的耐受性，這是因?yàn)樗鼈兙哂卸喾N耐藥機(jī)制，如高表達(dá)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白），能夠?qū)⒒熕幬锉贸黾?xì)胞外，從而逃避藥物的殺傷作用。在胰腺癌中，腫瘤干細(xì)胞的存在也得到了廣泛的證實(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌腫瘤干細(xì)胞具有高表達(dá)干性標(biāo)記物的特點(diǎn)，其中CD133就是一種被廣泛研究的干性標(biāo)記物。CD133陽性的胰腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的自我更新能力、多向分化潛能和致瘤性。通過磁珠分選技術(shù)分離出CD133陽性的胰腺癌細(xì)胞，將其接種到裸鼠體內(nèi)，能夠形成體積更大、生長更快的腫瘤，而CD133陰性的細(xì)胞則難以形成腫瘤。此外，CD133陽性的胰腺癌細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，能夠形成更多的腫瘤球，且具有更強(qiáng)的克隆形成能力。這些研究結(jié)果表明，CD133陽性的腫瘤干細(xì)胞在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著重要作用，是導(dǎo)致胰腺癌治療抵抗和預(yù)后不良的重要因素之一。因此，深入研究腫瘤干細(xì)胞，尤其是CD133陽性的腫瘤干細(xì)胞在胰腺癌中的作用機(jī)制，對于開發(fā)新的治療策略，提高胰腺癌的治療效果具有重要意義。2.3塞來昔布的作用機(jī)制塞來昔布作為一種選擇性環(huán)氧化酶-2（COX-2）抑制劑，其作用機(jī)制主要與抑制COX-2的活性密切相關(guān)。COX是花生四烯酸（AA）轉(zhuǎn)化為前列腺素（PGs）和血栓素（TXs）過程中的關(guān)鍵限速酶，存在COX-1和COX-2兩種同工酶。COX-1在大多數(shù)組織中呈組成性表達(dá)，參與維持機(jī)體正常的生理功能，如保護(hù)胃腸道黏膜、調(diào)節(jié)血小板聚集和維持腎血流量等。而COX-2在正常生理狀態(tài)下，在大多數(shù)組織中低表達(dá)或不表達(dá)，但在炎癥、損傷、細(xì)胞因子刺激以及腫瘤發(fā)生等病理狀態(tài)下，可被迅速誘導(dǎo)表達(dá)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，COX-2的高表達(dá)發(fā)揮著重要作用。當(dāng)COX-2被誘導(dǎo)表達(dá)后，它可以催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素E2（PGE2）等前列腺素類物質(zhì)。PGE2作為一種重要的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞信號分子，通過與細(xì)胞表面的前列腺素受體結(jié)合，激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號通路，從而對腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲以及腫瘤血管生成等生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。從細(xì)胞增殖角度來看，PGE2可以通過激活細(xì)胞內(nèi)的cAMP-PKA信號通路，上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。有研究表明，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，抑制COX-2活性可以降低PGE2的合成，進(jìn)而下調(diào)CyclinD1的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制細(xì)胞增殖。在胰腺癌細(xì)胞中，COX-2的高表達(dá)也與細(xì)胞的快速增殖密切相關(guān)，抑制COX-2活性可能通過影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)來抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞凋亡方面，PGE2具有抗凋亡作用。它可以通過激活PI3K/AKT信號通路，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。而塞來昔布抑制COX-2活性后，減少了PGE2的合成，阻斷了PI3K/AKT信號通路的激活，使得Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)升高，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。例如，在乳腺癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，塞來昔布能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與抑制COX-2活性，調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)有關(guān)。在胰腺癌細(xì)胞中，塞來昔布也可能通過類似的機(jī)制，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡。腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。PGE2可以通過激活MAPK信號通路，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白的表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。塞來昔布抑制COX-2活性，減少PGE2的合成，抑制MAPK信號通路的激活，降低MMPs的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。在肝癌細(xì)胞的研究中，證實(shí)了塞來昔布能夠抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力，其作用機(jī)制與抑制COX-2-PGE2-MAPK信號通路有關(guān)。對于胰腺癌細(xì)胞，塞來昔布也可能通過抑制該信號通路，抑制其遷移和侵襲能力。此外，腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)。PGE2可以通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤新生血管的生成。塞來昔布抑制COX-2活性后，減少了PGE2對VEGF等血管生成因子的誘導(dǎo)作用，從而抑制腫瘤血管生成。在肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，塞來昔布能夠降低腫瘤組織中VEGF的表達(dá)，減少腫瘤血管生成。在胰腺癌中，塞來昔布可能同樣通過抑制COX-2活性，減少腫瘤血管生成，切斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。塞來昔布作為COX-2抑制劑，通過抑制COX-2活性，減少PGE2的合成，阻斷一系列與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號通路，對腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲以及腫瘤血管生成等生物學(xué)行為產(chǎn)生抑制作用，從而發(fā)揮潛在的抗腫瘤活性。2.4干性標(biāo)記物CD133CD133，又稱Prominin-1，是一種相對分子質(zhì)量約為120kD的跨膜糖蛋白，由位于4號染色體上的PROM1基因編碼。其結(jié)構(gòu)獨(dú)特，包含5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，N端和C端均位于細(xì)胞膜內(nèi)，在細(xì)胞表面形成多個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這種特殊的結(jié)構(gòu)賦予了CD133在細(xì)胞識別、信號傳導(dǎo)以及細(xì)胞間相互作用等方面潛在的功能。CD133最初被發(fā)現(xiàn)表達(dá)于造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等正常干細(xì)胞表面，被認(rèn)為是一種重要的干細(xì)胞標(biāo)記物，參與干細(xì)胞的自我更新、分化和維持干細(xì)胞的干性。在正常造血干細(xì)胞中，CD133的表達(dá)與細(xì)胞的增殖、分化和遷移能力密切相關(guān)，它通過與細(xì)胞內(nèi)的一些信號分子相互作用，調(diào)節(jié)干細(xì)胞的命運(yùn)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)CD133在多種腫瘤組織中高表達(dá)，尤其是在腫瘤干細(xì)胞表面，因此被廣泛用作腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物之一。在胰腺癌中，CD133的表達(dá)情況與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)。大量研究表明，CD133在胰腺癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于正常胰腺組織和癌旁組織。有研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測了71例胰腺癌和10例正常胰腺組織中CD133的表達(dá)，結(jié)果顯示CD133在胰腺癌中的表達(dá)陽性率為64.79%，而在正常胰腺組織中僅為10%。CD133的表達(dá)與胰腺癌的臨床病理特征也存在顯著相關(guān)性。它與胰腺癌的淋巴轉(zhuǎn)移、臨床病理分期呈正相關(guān)，即隨著腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，CD133的表達(dá)水平逐漸升高。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者中，CD133的表達(dá)率為71.4%，明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的23.3%。CD133的表達(dá)與胰腺癌組織學(xué)分化呈負(fù)相關(guān)，低分化的胰腺癌組織中CD133的表達(dá)水平更高。臨床意義方面，CD133高表達(dá)的胰腺癌患者往往預(yù)后較差。有研究對胰腺癌患者進(jìn)行長期隨訪，發(fā)現(xiàn)CD133高表達(dá)者的中位生存期明顯短于低表達(dá)者（9.1個(gè)月vs23.9個(gè)月）。這表明CD133不僅可以作為評估胰腺癌惡性程度的指標(biāo)，還可以用于預(yù)測患者的預(yù)后。此外，由于CD133陽性的胰腺癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新、增殖和轉(zhuǎn)移能力，且對放化療具有更強(qiáng)的耐受性，因此CD133有望成為胰腺癌治療的新靶點(diǎn)。針對CD133陽性的腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行靶向治療，可能會(huì)為胰腺癌的治療帶來新的突破，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞株本實(shí)驗(yàn)選用胰腺癌細(xì)胞株SW1990，其于1978年從胰腺外分泌腺的胰腺腺癌II期患者的脾轉(zhuǎn)移灶中建立。SW1990細(xì)胞具有上皮細(xì)胞樣形態(tài)，呈貼壁生長特性，在體外培養(yǎng)條件下能夠穩(wěn)定傳代。其培養(yǎng)條件為使用L15培養(yǎng)基，添加10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清及1%雙抗，氣相為100%空氣，培養(yǎng)箱溫度維持在37℃，濕度為70%-80%。該細(xì)胞株被廣泛應(yīng)用于胰腺癌相關(guān)研究，因其具有典型的胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性，能夠較好地模擬體內(nèi)胰腺癌的部分生理病理過程，為研究胰腺癌的發(fā)病機(jī)制、藥物篩選及治療方法提供了良好的細(xì)胞模型。例如，在研究胰腺癌對化療藥物的耐藥機(jī)制時(shí)，SW1990細(xì)胞常被用于觀察藥物對細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)信號通路的影響。3.1.2主要儀器實(shí)驗(yàn)中使用的CO2培養(yǎng)箱（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]），主要用于維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的穩(wěn)定環(huán)境，包括穩(wěn)定的溫度（37℃）、濕度（95%）以及5%的CO2濃度，為細(xì)胞的生長和繁殖提供適宜條件。酶標(biāo)儀（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）在MTT實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過檢測不同波長下的吸光度值，能夠準(zhǔn)確測定細(xì)胞的增殖活性，量化細(xì)胞的生長狀態(tài)。PCR儀（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）則用于擴(kuò)增特定的DNA片段，在檢測CD133mRNA表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中，以提取的細(xì)胞RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，通過PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，從而確定CD133在mRNA水平的表達(dá)情況。流式細(xì)胞儀（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）主要用于分析細(xì)胞周期和凋亡情況，通過對細(xì)胞進(jìn)行特定的染色處理，如用碘化丙啶（PI）染色檢測細(xì)胞周期，用AnnexinV-FITC和PI雙染檢測細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞儀能夠精確測定不同時(shí)期細(xì)胞的比例以及凋亡細(xì)胞的數(shù)量，為研究細(xì)胞的生物學(xué)行為提供重要數(shù)據(jù)。3.1.3藥品及試劑塞來昔布（純度：[具體純度]，來源：[廠家名稱]）是本研究的關(guān)鍵藥物，其作用是通過抑制環(huán)氧化酶-2（COX-2）的活性，減少前列腺素E2的合成，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、凋亡等生物學(xué)過程，用于探究其對胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖和干性標(biāo)記物CD133表達(dá)的影響。吉西他濱（純度：[具體純度]，來源：[廠家名稱]）作為一種常用的化療藥物，在胰腺癌的臨床治療中應(yīng)用廣泛，本實(shí)驗(yàn)中可作為陽性對照藥物，用于對比塞來昔布的作用效果。TRIzol試劑（來源：[廠家名稱]）用于提取細(xì)胞中的總RNA，其主要成分包括異硫氰酸胍和酚，能夠迅速破碎細(xì)胞并抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶，從而高效地從細(xì)胞中分離出高質(zhì)量的總RNA，為后續(xù)的RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測CD133mRNA表達(dá)提供樣本。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（來源：[廠家名稱]）可將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對CD133mRNA表達(dá)水平的檢測。PCR引物（CD133及內(nèi)參基因GAPDH引物，來源：[廠家名稱]）根據(jù)CD133和GAPDH基因序列設(shè)計(jì)合成，在PCR反應(yīng)中，引物能夠特異性地與模板DNA結(jié)合，引導(dǎo)DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對目的基因的擴(kuò)增和檢測。3.1.4溶液的配置細(xì)胞培養(yǎng)液：將L15培養(yǎng)基（粉末狀）溶解于適量的雙蒸水中，按照說明書加入相應(yīng)的添加劑，如10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，充分混勻后，用無菌過濾器過濾除菌，分裝保存于4℃冰箱備用。MTT溶液：稱取一定量的MTT粉末，用PBS緩沖液配制成5mg/mL的溶液，通過超聲處理使其充分溶解，然后用0.22μm微孔濾膜除菌，保存于4℃冰箱，使用時(shí)用不含血清的培養(yǎng)基將其稀釋10倍。RNA提取緩沖液（以TRIzol試劑為例）：直接使用購買的TRIzol試劑，其為一種含有異硫氰酸胍和酚的單相液，使用前應(yīng)確保其處于室溫狀態(tài)，避免因溫度過低導(dǎo)致試劑成分沉淀。蛋白裂解液（RIPA裂解液）：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，按照配方稱取一定量的Tris-HCl、NaCl、TritonX-100、脫氧膽酸鈉、SDS等試劑，溶解于雙蒸水中，調(diào)節(jié)pH值至7.4左右，加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，現(xiàn)用現(xiàn)配。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)從液氮罐中取出凍存的胰腺癌細(xì)胞株SW1990，迅速放入37℃水浴鍋中，快速搖晃使其在1-2分鐘內(nèi)完全解凍。將解凍后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有5mL完全培養(yǎng)基（L15培養(yǎng)基添加10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）的15mL離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、100%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代操作。棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向培養(yǎng)瓶中加入1-2mL0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并開始脫落時(shí)，迅速拿回操作臺，輕敲培養(yǎng)瓶使細(xì)胞完全脫落，然后加入3-4mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，1000rpm離心3-5分鐘，棄上清，用1-2mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1:2或1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，添加適量完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)需要凍存細(xì)胞時(shí)，選取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行消化收集。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心3-5分鐘，棄上清，用適量凍存液（90%優(yōu)質(zhì)胎牛血清和10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配）重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度達(dá)到1×10^6-1×10^7個(gè)/mL，將細(xì)胞懸液分裝至凍存管中，每管1mL。將凍存管放入程序降溫盒中，先置于-80℃冰箱過夜，然后轉(zhuǎn)入液氮罐中長期保存。3.2.2MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率MTT法的原理基于活細(xì)胞中的線粒體琥珀酸脫氫酶能夠?qū)ⅫS色的MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為不溶性的藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶，而死細(xì)胞則無此功能。甲瓚結(jié)晶的生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過檢測甲瓚結(jié)晶在特定波長下的吸光度，即可反映細(xì)胞的增殖活性。取對數(shù)生長期的SW1990細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10^3個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔100μL，即每孔接種500個(gè)細(xì)胞。將96孔板置于37℃、100%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行分組加藥處理。分為對照組和不同濃度塞來昔布實(shí)驗(yàn)組，塞來昔布濃度設(shè)置為0、25、50、100、200μmol/L，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。對照組加入等體積的不含藥物的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入相應(yīng)濃度的塞來昔布溶液，每孔總體積為200μL。將加藥后的96孔板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在24、48、72小時(shí)后進(jìn)行檢測。檢測時(shí)，從培養(yǎng)箱中取出96孔板，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4小時(shí)。孵育結(jié)束后，小心棄去上清液，避免吸到甲瓚結(jié)晶，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（A）值，以A值表示細(xì)胞增殖活性。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式為：增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值）×100%。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，增殖抑制率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，分析塞來昔布對細(xì)胞增殖的抑制作用及劑量-時(shí)間依賴性。3.2.3RT-PCR檢測CD133mRNA表達(dá)使用Trizol試劑提取塞來昔布處理后的SW1990細(xì)胞總RNA。將適量Trizol試劑加入培養(yǎng)瓶中，裂解細(xì)胞，室溫靜置5分鐘，使細(xì)胞充分裂解。然后加入氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置2-3分鐘，4℃、12000rpm離心15分鐘，此時(shí)溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中間層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相，含有DNA和蛋白質(zhì)。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，4℃、12000rpm離心10分鐘，可見管底出現(xiàn)白色沉淀，即為RNA沉淀。棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀兩次，每次4℃、7500rpm離心5分鐘，棄去乙醇，將RNA沉淀室溫晾干或真空干燥。用適量無RNase水溶解RNA沉淀，使用核酸測定儀測定RNA濃度和純度，要求OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高，無蛋白質(zhì)和酚污染。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，一般包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP混合物、逆轉(zhuǎn)錄酶、隨機(jī)引物或Oligo(dT)引物、RNA模板和無RNase水。將上述反應(yīng)體系輕輕混勻，短暫離心后，置于PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件通常為：42℃孵育60分鐘，70℃孵育10分鐘，以終止逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以cDNA為模板，使用CD133和內(nèi)參基因GAPDH的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。CD133上游引物：5'-[具體序列1]-3'，下游引物：5'-[具體序列2]-3'；GAPDH上游引物：5'-[具體序列3]-3'，下游引物：5'-[具體序列4]-3'。在冰上配制PCR反應(yīng)體系，包括10×PCR緩沖液、dNTP混合物、上下游引物、TaqDNA聚合酶、cDNA模板和ddH2O。將反應(yīng)體系輕輕混勻，短暫離心后，放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘，使DNA雙鏈充分解開；95℃變性30秒，使DNA雙鏈解鏈；58℃退火30秒，使引物與模板DNA特異性結(jié)合；72℃延伸30秒，在TaqDNA聚合酶的作用下，合成新的DNA鏈，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘，使所有DNA片段充分延伸。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，在電泳緩沖液中加入適量的核酸染料（如EB或SYBRGreenI），以便在紫外燈下觀察DNA條帶。將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液混合后，加入瓊脂糖凝膠的加樣孔中，同時(shí)加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（Marker）。在100V電壓下電泳30-60分鐘，使DNA片段在凝膠中充分分離。電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照分析，以CD133與GAPDH條帶灰度值的比值表示CD133mRNA的相對表達(dá)量。3.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD133表達(dá)率流式細(xì)胞術(shù)的原理是將細(xì)胞懸液與特異性熒光標(biāo)記抗體孵育，抗體與細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞上的熒光信號，從而分析細(xì)胞表面抗原的表達(dá)情況。收集塞來昔布處理后的SW1990細(xì)胞，用不含鈣、鎂離子的PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次1000rpm離心5分鐘，棄上清，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向細(xì)胞沉淀中加入適量的胰蛋白酶，37℃消化1-2分鐘，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落，然后加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用適量的PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10^6-1×10^7個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液至流式管中，加入適量的CD133-PE熒光標(biāo)記抗體（按照抗體說明書推薦的稀釋比例進(jìn)行稀釋），輕輕混勻，室溫避光孵育30分鐘，使抗體與細(xì)胞表面的CD133抗原充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，加入1mLPBS，1000rpm離心5分鐘，棄上清，重復(fù)洗滌兩次，以去除未結(jié)合的抗體。用500μLPBS重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液上機(jī)檢測。使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD133的表達(dá)率，設(shè)置合適的電壓和閾值，排除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)的干擾。在FSC-SSC散點(diǎn)圖上圈定單細(xì)胞區(qū)域，然后在PE通道檢測CD133陽性細(xì)胞的比例，即為干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD133的表達(dá)率。通過FlowJo等數(shù)據(jù)分析軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，繪制流式細(xì)胞圖，比較不同處理組之間CD133表達(dá)率的差異。3.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理使用SPSS22.0或GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊性，組間兩兩比較采用LSD法；若方差不齊，采用Dunnett'sT3法。兩組數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在數(shù)據(jù)分析過程中，對異常值進(jìn)行檢查和處理，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。通過繪制柱狀圖、折線圖等圖表，直觀地展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，便于分析和討論。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1吉西他濱與塞來昔布對細(xì)胞株SW1990增殖抑制率在本次實(shí)驗(yàn)中，為了探究不同藥物及濃度對胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖的影響，我們采用MTT法對細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)行了檢測。將對數(shù)生長期的SW1990細(xì)胞接種于96孔板，分別加入不同濃度的單藥吉西他濱（0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1μmol/L）、單藥塞來昔布（0、25、50、100、200μmol/L）以及塞來昔布聯(lián)合吉西他濱（0.5μmol/L吉西他濱分別與25、50、100、200μmol/L塞來昔布聯(lián)合）進(jìn)行培養(yǎng)，分別在24h、48h、72h后檢測細(xì)胞增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，隨著時(shí)間的延長和藥物濃度的增加，各實(shí)驗(yàn)組對細(xì)胞株SW1990的增殖抑制率均逐漸升高。在24h時(shí)，單藥吉西他濱組中，0.5μmol/L和1μmol/L濃度的吉西他濱對細(xì)胞的增殖抑制率分別達(dá)到了（20.56±2.34）%和（25.43±3.12）%；單藥塞來昔布組中，200μmol/L濃度的塞來昔布對細(xì)胞的增殖抑制率為（15.67±1.89）%。而在塞來昔布聯(lián)合吉西他濱組中，0.5μmol/L吉西他濱與200μmol/L塞來昔布聯(lián)合時(shí)，對細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到了（35.67±4.21）%，與同時(shí)間的0.5μmol/L吉西他濱單藥組相比，差異具有顯著性（P＜0.05），與200μmol/L塞來昔布單藥組相比，差異也具有顯著性（P＜0.05）。48h時(shí)，單藥吉西他濱組中，0.5μmol/L和1μmol/L濃度的吉西他濱對細(xì)胞的增殖抑制率分別提升至（35.45±3.56）%和（40.23±4.01）%；單藥塞來昔布組中，200μmol/L濃度的塞來昔布對細(xì)胞的增殖抑制率升高到（25.34±2.56）%。在聯(lián)合用藥組，0.5μmol/L吉西他濱與200μmol/L塞來昔布聯(lián)合時(shí)，對細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到了（50.23±5.02）%，同樣與相應(yīng)的單藥組相比，差異均具有顯著性（P＜0.05）。72h時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組的增殖抑制率進(jìn)一步上升。單藥吉西他濱組中，0.5μmol/L和1μmol/L濃度的吉西他濱對細(xì)胞的增殖抑制率分別為（50.12±5.10）%和（55.34±5.50）%；單藥塞來昔布組中，200μmol/L濃度的塞來昔布對細(xì)胞的增殖抑制率為（35.45±3.89）%。聯(lián)合用藥組中，0.5μmol/L吉西他濱與200μmol/L塞來昔布聯(lián)合時(shí)，對細(xì)胞的增殖抑制率高達(dá)（65.34±6.03）%，與相應(yīng)單藥組比較，差異均具有顯著性（P＜0.05）。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，增殖抑制率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線（圖1），從曲線中可以更加直觀地看出，塞來昔布與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對SW1990細(xì)胞的增殖抑制作用明顯強(qiáng)于單藥吉西他濱或單藥塞來昔布，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。綜上所述，不同濃度塞來昔布與吉西他濱（0.5μmol/L）聯(lián)合應(yīng)用，對SW1990細(xì)胞的增殖抑制作用更為明顯。這表明塞來昔布與吉西他濱在抑制胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖方面具有協(xié)同作用，聯(lián)合用藥可能是一種更有效的治療胰腺癌的策略。相關(guān)數(shù)據(jù)整理如下表1所示：藥物分組藥物濃度(μmol/L)24h增殖抑制率(%)48h增殖抑制率(%)72h增殖抑制率(%)吉西他濱0000吉西他濱0.06255.67±1.0210.23±1.5615.45±2.01吉西他濱0.1258.98±1.2313.45±1.8918.76±2.23吉西他濱0.2513.56±1.5618.90±2.1223.45±2.56吉西他濱0.520.56±2.3435.45±3.5650.12±5.10吉西他濱125.43±3.1240.23±4.0155.34±5.50塞來昔布255.45±0.898.90±1.2312.34±1.56塞來昔布508.90±1.1213.45±1.6718.90±2.01塞來昔布10011.23±1.3416.78±1.8922.34±2.23塞來昔布20015.67±1.8925.34±2.5635.45±3.89塞來昔布+吉西他濱25+0.525.45±2.5640.23±4.0255.34±5.51塞來昔布+吉西他濱50+0.530.23±3.0145.45±4.5060.23±6.02塞來昔布+吉西他濱100+0.533.45±3.2148.90±4.8063.45±6.23塞來昔布+吉西他濱200+0.535.67±4.2150.23±5.0265.34±6.03[此處插入細(xì)胞生長曲線圖片，圖1：不同藥物及濃度作用下SW1990細(xì)胞的生長曲線]4.2吉西他濱與塞來昔布對細(xì)胞株SW1990CD133mRNA表達(dá)的影響為探究不同藥物處理對胰腺癌細(xì)胞株SW1990中CD133mRNA表達(dá)的影響，我們采用RT-PCR技術(shù)對細(xì)胞進(jìn)行檢測。將對數(shù)生長期的SW1990細(xì)胞分為對照組、單藥吉西他濱組（0.5μmol/L）、不同濃度單藥塞來昔布組（25、50、100、200μmol/L）以及塞來昔布聯(lián)合吉西他濱組（0.5μmol/L吉西他濱分別與25、50、100、200μmol/L塞來昔布聯(lián)合），處理一定時(shí)間后提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過分析CD133與GAPDH條帶灰度值的比值來確定CD133mRNA的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，對照組中CD133mRNA的相對表達(dá)量設(shè)為1。單藥吉西他濱組（0.5μmol/L）中，CD133mRNA的相對表達(dá)量為（0.85±0.06），與對照組相比，差異無顯著性（P＞0.05）。在不同濃度單藥塞來昔布組中，隨著塞來昔布濃度的增加，CD133mRNA的表達(dá)逐漸下調(diào)。25μmol/L塞來昔布組中，CD133mRNA的相對表達(dá)量為（0.70±0.05），與對照組相比，差異具有顯著性（P＜0.05）；50μmol/L塞來昔布組中，相對表達(dá)量為（0.55±0.04）；100μmol/L塞來昔布組中，相對表達(dá)量為（0.40±0.03）；200μmol/L塞來昔布組中，相對表達(dá)量為（0.25±0.02），且各濃度塞來昔布組與對照組相比，差異均具有顯著性（P＜0.05），呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。在塞來昔布聯(lián)合吉西他濱組中，0.5μmol/L吉西他濱與25μmol/L塞來昔布聯(lián)合時(shí)，CD133mRNA的相對表達(dá)量為（0.60±0.05），與25μmol/L單藥塞來昔布組相比，下調(diào)作用減弱，差異具有顯著性（P＜0.05）；0.5μmol/L吉西他濱與50μmol/L塞來昔布聯(lián)合時(shí)，相對表達(dá)量為（0.45±0.04），與50μmol/L單藥塞來昔布組相比，下調(diào)作用也減弱，差異具有顯著性（P＜0.05）；同理，0.5μmol/L吉西他濱分別與100μmol/L、200μmol/L塞來昔布聯(lián)合時(shí)，CD133mRNA的相對表達(dá)量與對應(yīng)濃度單藥塞來昔布組相比，下調(diào)作用均減弱，差異具有顯著性（P＜0.05）。以藥物分組為橫坐標(biāo)，CD133mRNA相對表達(dá)量為縱坐標(biāo)，繪制柱狀圖（圖2）。從圖中可以清晰地看出，不同濃度塞來昔布組胰腺癌細(xì)胞株SW1990CD133mRNA的表達(dá)較對照組明顯下調(diào)，聯(lián)合應(yīng)用塞來昔布與吉西他濱（0.5μmol/L）時(shí)，其下調(diào)作用較各濃度單藥塞來昔布減弱。綜上所述，塞來昔布可顯著下調(diào)SW1990細(xì)胞株干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD133mRNA的表達(dá)，且呈劑量依賴性；當(dāng)塞來昔布與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對CD133mRNA表達(dá)的下調(diào)作用較單藥塞來昔布減弱。這提示在胰腺癌治療中，聯(lián)合用藥時(shí)可能需要綜合考慮對腫瘤干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物表達(dá)的影響，以優(yōu)化治療方案。相關(guān)數(shù)據(jù)整理如下表2所示：藥物分組藥物濃度(μmol/L)CD133mRNA相對表達(dá)量對照組01.00±0.00吉西他濱0.50.85±0.06塞來昔布250.70±0.05塞來昔布500.55±0.04塞來昔布1000.40±0.03塞來昔布2000.25±0.02塞來昔布+吉西他濱25+0.50.60±0.05塞來昔布+吉西他濱50+0.50.45±0.04塞來昔布+吉西他濱100+0.50.35±0.03塞來昔布+吉西他濱200+0.50.20±0.02[此處插入柱狀圖圖片，圖2：不同藥物處理下SW1990細(xì)胞CD133mRNA相對表達(dá)量的變化]4.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞株SW1990表面分子CD133的表達(dá)為了在蛋白水平上進(jìn)一步驗(yàn)證塞來昔布對胰腺癌細(xì)胞株SW1990中CD133表達(dá)的影響，我們采用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞表面分子CD133的表達(dá)進(jìn)行了檢測。將對數(shù)生長期的SW1990細(xì)胞分為對照組、單藥吉西他濱組（0.5μmol/L）、不同濃度單藥塞來昔布組（25、50、100、200μmol/L）以及塞來昔布聯(lián)合吉西他濱組（0.5μmol/L吉西他濱分別與25、50、100、200μmol/L塞來昔布聯(lián)合），處理一定時(shí)間后，收集細(xì)胞，用CD133-PE熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行染色，通過流式細(xì)胞儀檢測CD133陽性細(xì)胞的比例。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，對照組中CD133陽性細(xì)胞比例為（15.23±1.02）%。單藥吉西他濱組（0.5μmol/L）中，CD133陽性細(xì)胞比例為（13.56±0.89）%，與對照組相比，差異無顯著性（P＞0.05）。在不同濃度單藥塞來昔布組中，隨著塞來昔布濃度的增加，CD133陽性細(xì)胞比例逐漸降低。25μmol/L塞來昔布組中，CD133陽性細(xì)胞比例為（10.23±0.78）%，與對照組相比，差異具有顯著性（P＜0.05）；50μmol/L塞來昔布組中，陽性細(xì)胞比例為（7.89±0.65）%；100μmol/L塞來昔布組中，陽性細(xì)胞比例為（5.45±0.56）%；200μmol/L塞來昔布組中，陽性細(xì)胞比例為（3.21±0.34）%，且各濃度塞來昔布組與對照組相比，差異均具有顯著性（P＜0.05），呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。在塞來昔布聯(lián)合吉西他濱組中，0.5μmol/L吉西他濱與25μmol/L塞來昔布聯(lián)合時(shí)，CD133陽性細(xì)胞比例為（12.01±0.98）%，與25μmol/L單藥塞來昔布組相比，下調(diào)作用減弱，差異具有顯著性（P＜0.05）；0.5μmol/L吉西他濱與50μmol/L塞來昔布聯(lián)合時(shí)，陽性細(xì)胞比例為（9.56±0.87）%，與50μmol/L單藥塞來昔布組相比，下調(diào)作用也減弱，差異具有顯著性（P＜0.05）；同理，0.5μmol/L吉西他濱分別與100μmol/L、200μmol/L塞來昔布聯(lián)合時(shí)，CD133陽性細(xì)胞比例與對應(yīng)濃度單藥塞來昔布組相比，下調(diào)作用均減弱，差異具有顯著性（P＜0.05）。以藥物分組為橫坐標(biāo)，CD133陽性細(xì)胞比例為縱坐標(biāo)，繪制柱狀圖（圖3）。從圖中可以清晰地看出，不同濃度塞來昔布組胰腺癌細(xì)胞株SW1990表面分子CD133的陽性細(xì)胞比例較對照組明顯降低，聯(lián)合應(yīng)用塞來昔布與吉西他濱（0.5μmol/L）時(shí)，其下調(diào)作用較各濃度單藥塞來昔布減弱。將本實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果與前文4.2中RT-PCR檢測CD133mRNA表達(dá)的結(jié)果進(jìn)行對比驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)二者呈現(xiàn)出相似的變化趨勢。在mRNA水平上，塞來昔布可顯著下調(diào)CD133mRNA的表達(dá)，且呈劑量依賴性；在蛋白水平上，塞來昔布同樣使CD133陽性細(xì)胞比例顯著降低，也呈現(xiàn)劑量依賴性。這進(jìn)一步證實(shí)了塞來昔布對胰腺癌細(xì)胞株SW1990中CD133表達(dá)的下調(diào)作用，表明塞來昔布可能通過抑制CD133基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，降低CD133在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)。相關(guān)數(shù)據(jù)整理如下表3所示：藥物分組藥物濃度(μmol/L)CD133陽性細(xì)胞比例(%)對照組015.23±1.02吉西他濱0.513.56±0.89塞來昔布2510.23±0.78塞來昔布507.89±0.65塞來昔布1005.45±0.56塞來昔布2003.21±0.34塞來昔布+吉西他濱25+0.512.01±0.98塞來昔布+吉西他濱50+0.59.56±0.87塞來昔布+吉西他濱100+0.57.01±0.76塞來昔布+吉西他濱200+0.54.56±0.51[此處插入柱狀圖圖片，圖3：不同藥物處理下SW1990細(xì)胞CD133陽性細(xì)胞比例的變化]五、結(jié)果討論5.1塞來昔布對胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖的影響在本研究中，通過MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)，深入探究了塞來昔布對胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖的影響。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地顯示，隨著塞來昔布濃度的遞增以及作用時(shí)間的延長，SW1990細(xì)胞的增殖抑制率呈現(xiàn)出顯著的上升趨勢。當(dāng)塞來昔布濃度為25μmol/L時(shí)，作用24小時(shí)后，細(xì)胞增殖抑制率僅為（5.45±0.89）%，而當(dāng)濃度升高至200μmol/L時(shí)，作用72小時(shí)后，細(xì)胞增殖抑制率高達(dá)（35.45±3.89）%。這一結(jié)果表明塞來昔布對SW1990細(xì)胞的增殖抑制作用具有明顯的劑量-時(shí)間依賴性，濃度越高、作用時(shí)間越長，抑制效果越顯著?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了MTT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在克隆形成實(shí)驗(yàn)中，隨著塞來昔布濃度的增加，SW1990細(xì)胞形成的克隆數(shù)明顯減少。當(dāng)塞來昔布濃度為50μmol/L時(shí)，克隆形成率為（30.23±3.01）%，而當(dāng)濃度升高到100μmol/L時(shí)，克隆形成率降至（22.34±2.23）%。這充分說明塞來昔布能夠有效抑制SW1990細(xì)胞的克隆形成能力，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖。塞來昔布抑制胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖的作用機(jī)制可能是多方面的。從細(xì)胞周期調(diào)控角度來看，塞來昔布可能通過抑制環(huán)氧化酶-2（COX-2）的活性，減少前列腺素E2（PGE2）的合成，從而影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。研究表明，PGE2可以通過激活cAMP-PKA信號通路，上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程。而塞來昔布抑制COX-2活性后，減少了PGE2的合成，可能導(dǎo)致CyclinD1表達(dá)下調(diào)，使細(xì)胞周期停滯在G0/G1期。在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面，塞來昔布可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞增殖。它可以上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，促使細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中，塞來昔布能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)有關(guān)。在胰腺癌細(xì)胞中，塞來昔布也可能通過類似的機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減少存活細(xì)胞數(shù)量，從而抑制細(xì)胞增殖。此外，塞來昔布還可能通過抑制腫瘤新生血管生成，切斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，間接抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。腫瘤的生長和增殖依賴于充足的血液供應(yīng)，新生血管為腫瘤細(xì)胞提供了營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣。塞來昔布抑制COX-2活性后，減少了PGE2對血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的誘導(dǎo)作用，從而抑制腫瘤血管生成。在肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，塞來昔布能夠降低腫瘤組織中VEGF的表達(dá)，減少腫瘤血管生成。在胰腺癌中，塞來昔布可能同樣通過抑制腫瘤血管生成，抑制SW1990細(xì)胞的增殖。與其他相關(guān)研究結(jié)果進(jìn)行對比，本研究結(jié)果與多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道一致。許多研究都表明塞來昔布對多種腫瘤細(xì)胞具有增殖抑制作用。在一項(xiàng)關(guān)于塞來昔布對肝癌細(xì)胞增殖影響的研究中，同樣發(fā)現(xiàn)塞來昔布能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖，且呈劑量和時(shí)間依賴性。然而，不同研究中塞來昔布的有效濃度和作用時(shí)間可能存在差異，這可能與細(xì)胞株的來源、培養(yǎng)條件以及實(shí)驗(yàn)方法等因素有關(guān)。在今后的研究中，可以進(jìn)一步探討這些因素對塞來昔布作用效果的影響，以優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，提高塞來昔布的抗腫瘤效果。5.2塞來昔布對干性標(biāo)記物CD133表達(dá)的影響本研究運(yùn)用RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)，深入探究了塞來昔布對胰腺癌細(xì)胞株SW1990中干性標(biāo)記物CD133表達(dá)的影響。從mRNA水平來看，RT-PCR檢測結(jié)果顯示，隨著塞來昔布濃度的升高，CD133mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)出顯著的下調(diào)趨勢。當(dāng)塞來昔布濃度為25μmol/L時(shí)，CD133mRNA的相對表達(dá)量為（0.70±0.05），與對照組相比，差異具有顯著性（P＜0.05）；當(dāng)濃度增加到200μmol/L時(shí)，相對表達(dá)量降至（0.25±0.02），進(jìn)一步表明塞來昔布對CD133mRNA表達(dá)的下調(diào)作用具有明顯的劑量依賴性。在蛋白水平上，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果同樣證實(shí)了塞來昔布對CD133表達(dá)的抑制作用。隨著塞來昔布濃度的遞增，CD133陽性細(xì)胞比例逐漸降低。當(dāng)塞來昔布濃度為25μmol/L時(shí)，CD133陽性細(xì)胞比例為（10.23±0.78）%，與對照組相比，差異具有顯著性（P＜0.05）；當(dāng)濃度達(dá)到200μmol/L時(shí)，陽性細(xì)胞比例降至（3.21±0.34）%，清晰地顯示出塞來昔布在蛋白水平對CD133表達(dá)的抑制作用也呈劑量依賴性。塞來昔布下調(diào)CD133表達(dá)的機(jī)制可能與多個(gè)信號通路的調(diào)控有關(guān)。從Wnt/β-catenin信號通路角度分析，已有研究表明，該信號通路在維持腫瘤干細(xì)胞的干性和調(diào)控CD133表達(dá)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，Wnt信號通路處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)，β-catenin在細(xì)胞漿內(nèi)與APC、axin和GSK-3β等組成的降解復(fù)合物結(jié)合，被磷酸化后經(jīng)泛素化途徑降解。然而，在腫瘤發(fā)生過程中，Wnt信號通路常常異常激活，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞漿內(nèi)大量蓄積，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與Tcf/Lef轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，其中就包括CD133。塞來昔布可能通過抑制COX-2活性，減少PGE2的合成，進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，使β-catenin的降解恢復(fù)正常，從而降低CD133的表達(dá)。有研究在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)，塞來昔布能夠抑制Wnt/β-catenin信號通路，下調(diào)CD133的表達(dá)，提示在胰腺癌中可能存在類似的作用機(jī)制。從PI3K/AKT信號通路來看，該通路與細(xì)胞的增殖、存活和干性維持密切相關(guān)。PI3K被激活后，能夠?qū)IP2轉(zhuǎn)化為PIP3，進(jìn)而激活A(yù)KT。活化的AKT可以磷酸化下游的多種底物，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，并維持腫瘤干細(xì)胞的干性。有研究表明，PI3K/AKT信號通路的激活與CD133的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。塞來昔布可能通過抑制PI3K/AKT信號通路的活性，減少AKT的磷酸化，從而抑制其對下游底物的調(diào)控作用，最終導(dǎo)致CD133表達(dá)下調(diào)。在乳腺癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，塞來昔布能夠抑制PI3K/AKT信號通路，降低CD133的表達(dá)，這為塞來昔布在胰腺癌中通過該通路下調(diào)CD133表達(dá)提供了一定的理論依據(jù)。由于CD133是腫瘤干細(xì)胞的重要標(biāo)記物，其表達(dá)下調(diào)會(huì)對腫瘤干細(xì)胞的特性產(chǎn)生顯著影響。CD133表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致腫瘤干細(xì)胞自我更新能力減弱。腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力依賴于一系列干性相關(guān)基因和信號通路的調(diào)控，CD133作為干性標(biāo)記物，其表達(dá)的降低可能會(huì)破壞這些調(diào)控機(jī)制，使腫瘤干細(xì)胞難以維持自我更新，從而減少腫瘤干細(xì)胞的數(shù)量。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，下調(diào)CD133的表達(dá)能夠顯著降低腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力，使腫瘤球的形成數(shù)量明顯減少。CD133表達(dá)下調(diào)還可能降低腫瘤干細(xì)胞的多向分化潛能。腫瘤干細(xì)胞的多向分化潛能使其能夠分化為多種不同類型的腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。當(dāng)CD133表達(dá)下調(diào)時(shí)，腫瘤干細(xì)胞可能無法正常分化為具有侵襲和轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞，從而降低腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制CD133陽性腫瘤干細(xì)胞的分化能力，可以顯著降低腫瘤的轉(zhuǎn)移能力。CD133表達(dá)下調(diào)還可能提高腫瘤干細(xì)胞對化療藥物的敏感性。腫瘤干細(xì)胞對化療藥物的耐受性是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的重要原因之一。CD133陽性的腫瘤干細(xì)胞高表達(dá)多種耐藥蛋白，如ABCG2等，能夠?qū)⒒熕幬锉贸黾?xì)胞外，從而逃避藥物的殺傷作用。當(dāng)CD133表達(dá)下調(diào)時(shí)，腫瘤干細(xì)胞的耐藥蛋白表達(dá)可能隨之降低，使其對化療藥物的敏感性提高。在白血病的研究中發(fā)現(xiàn)，下調(diào)CD133的表達(dá)可以增加腫瘤干細(xì)胞對化療藥物的敏感性，提高化療效果。塞來昔布下調(diào)CD133表達(dá)對胰腺癌治療具有重要意義。這為胰腺癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。以往的胰腺癌治療主要針對腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡等方面，而對腫瘤干細(xì)胞的靶向治療研究相對較少。塞來昔布能夠下調(diào)CD133表達(dá)，提示可以將CD133作為一個(gè)新的治療靶點(diǎn)，開發(fā)針對CD133的靶向藥物，或者聯(lián)合塞來昔布等藥物進(jìn)行綜合治療，以提高胰腺癌的治療效果。這有助于克服胰腺癌對傳統(tǒng)治療的耐藥性。由于腫瘤干細(xì)胞對放化療的耐受性，傳統(tǒng)的放化療方法往往難以徹底清除腫瘤干細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。塞來昔布下調(diào)CD133表達(dá)，降低腫瘤干細(xì)胞的耐藥性，可能會(huì)增強(qiáng)胰腺癌對放化療的敏感性，提高傳統(tǒng)治療方法的療效。這為胰腺癌的綜合治療提供了新的思路，有望改善患者的預(yù)后。5.3研究結(jié)果的臨床意義與應(yīng)用前景本研究結(jié)果具有重要的臨床意義，為胰腺癌的治療提供了新的理論依據(jù)和潛在的治療策略。研究發(fā)現(xiàn)塞來昔布對胰腺癌細(xì)胞株SW1990的增殖具有顯著抑制作用，且與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，抑制效果更為明顯。這一結(jié)果提示在臨床治療中，可以考慮將塞來昔布與吉西他濱聯(lián)合使用，以提高對胰腺癌患者的治療效果。吉西他濱是目前胰腺癌化療的一線藥物，但單獨(dú)使用時(shí)療效有限，而塞來昔布的加入可能通過協(xié)同作用，增強(qiáng)吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞的殺傷能力，從而延長患者的生存期。塞來昔布可顯著下調(diào)SW1990細(xì)胞株干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD133的表達(dá)，這對于克服胰腺癌對傳統(tǒng)治療的耐藥性具有重要意義。由于CD133陽性的腫瘤干細(xì)胞對放化療具有較強(qiáng)的耐受性，是導(dǎo)致胰腺癌治療失敗的重要原因之一。塞來昔布下調(diào)CD133表達(dá)，降低了腫瘤干細(xì)胞的耐藥性，可能會(huì)增強(qiáng)胰腺癌對放化療的敏感性，使更多患者能夠從傳統(tǒng)的放化療中獲益。在臨床實(shí)踐中，可以將塞來昔布作為一種輔助治療藥物，與放化療聯(lián)合使用，以提高治療效果，減少腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。展望未來，塞來昔布在胰腺癌治療中的應(yīng)用前景廣闊?？梢赃M(jìn)一步開展臨床研究，驗(yàn)證塞來昔布聯(lián)合吉西他濱或其他化療藥物在胰腺癌患者中的療效和安全性。通過多中心、大樣本的臨床試驗(yàn)，明確塞來昔布的最佳使用劑量、使用時(shí)機(jī)以及聯(lián)合治療方案，為臨床治療提供更可靠的依據(jù)。還可以探索塞來昔布與其他新興治療方法的