1、Feynman_R匯合度(confluenee)也許是我們實驗室的翻譯，實際上就是指細(xì)胞占培養(yǎng)表 面的比例，如果細(xì)胞鋪滿了整個容器，我們就認(rèn)為它們 100%匚合，也就是匯合 度 100%最近的一個實驗是：3X106細(xì)胞電轉(zhuǎn)后，我把電激杯中的細(xì)胞分別接種1/4000 和1/1000和1/300到24孔板中，48小時后加g418篩選，這個時候接種了 1/300 細(xì)胞的孔會大約50%匚合，而理論上接種了 1/4000細(xì)胞的孔會4M右匯合，今 天是篩選后第9天，觀察到1/4000孔有兩三個小克隆，按道理1/300孔會有20-30 個克隆，但實際的情況是它們幾乎全部死光了，僅有少數(shù)存活細(xì)胞！所以我認(rèn)為匯

2、合度對g418篩選影響很大，這耽誤了我將一個多月。jia ngql同意菊花與刀對你的建議。我的感覺 G418篩選時間太長，到后來 一般會對細(xì)胞生長有影響。以下是一些建議，供參考：首先需要擴增細(xì)胞，凍存部分中間產(chǎn)物細(xì)胞后，再做克隆化比較合適，否則 一旦污染就會全軍覆沒。一般57天后G418就可以減半維持。勤換液，去除死細(xì)胞，可以減少對存活細(xì)胞的影響。血清濃度可以高到20%，質(zhì)量要好。進行真核轉(zhuǎn)染的一般程序：克隆目的基因(經(jīng)測序驗證)一準(zhǔn)備真核表達載體-將目的基因插入表達載 體中-轉(zhuǎn)染-篩選-鑒定下面以pcDNA3為載體，p16為目的基因，介紹真核轉(zhuǎn)染的實驗操作。一、試劑準(zhǔn)備1、HBS (Hepe

3、s-buffered saline ) : 876mg NaCl溶于 90ml ddHzO,加入 1M Hepes,調(diào) pH 到 7.4,補 ddHO至 100ml, pH7.4，濾過除菌。2、核酸貯存液，過濾除菌。3、培養(yǎng)基：含血清或不含血清的，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的正常培養(yǎng)。二、操作步驟(一) 克隆目的基因1、根據(jù)GenBank檢索的目的基因序列，設(shè)計擴增引物，并在上、下游引物的5'-端分別引入酶切位點BamH和Xhol,行RT-PCR2、回收特異性擴增片段，連入 T載體。3、轉(zhuǎn)化DH5x,質(zhì)粒制備。4、酶切初步鑒定，測序證實。（二）真核重組表達載體的構(gòu)建：pcDNA3載體帶有在大腸桿菌中

4、復(fù)制的原核序列、便于挑選帶重組質(zhì)粒細(xì)菌 的抗生素抗性基因，以及表達外源 DNA序列所必需的所有真核表達組件。重組質(zhì)粒與pcDNA3分別用BamH和Xhol雙酶切回收插入片段和pcDNA3線性片段T4連接酶連接轉(zhuǎn)化DH5x質(zhì)粒制備BamH和Xhol雙酶切鑒定。（三）重組pcDNA3轉(zhuǎn)染SHG-44細(xì)胞：1、G418篩選濃度測定：SHG-44培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板G418分別用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各濃度 3 復(fù)孔，設(shè)正常 對照3復(fù)孔。以10-14天細(xì)胞全部死亡的濃度為篩選濃度，結(jié)果為 200mg/Lo2、在轉(zhuǎn)染實驗前天接種

5、細(xì)胞，各種細(xì)胞的平板密度依據(jù)各種細(xì)胞的生長率 和細(xì)胞形狀而定。進行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)達到60%-808覆蓋。一般要求，6孔培養(yǎng)皿（35mm，每孔1-2ml培養(yǎng)基3X105細(xì)胞。依據(jù)不同大小培養(yǎng)板調(diào)整每平方厘 米的細(xì)胞數(shù)量。典型貼壁細(xì)胞平板密度培養(yǎng)板大小生長面積（cni）大約細(xì)胞數(shù)培養(yǎng)基谷積（ml）組織培養(yǎng)皿（的0mr）286. 6X1055-66孔培養(yǎng)板（|）35mr）i9.553X101-212孔培養(yǎng)板©22.6mm41. 3X1050. 5-124孔培養(yǎng)板（松mr）i0. 50. 6X050. 25-0 . 53、SHG-44細(xì)胞的轉(zhuǎn)染：(1) 轉(zhuǎn)染當(dāng)天，加入脂質(zhì)體/ DNA混合物之

6、前的短時間內(nèi)，更換1ml新鮮 的有血清或無血清培養(yǎng)基。(2) 準(zhǔn)備不同比例的DOSPERDNA昆合物，以確定每個細(xì)胞系的最佳比例。 溶液A:用HBS稀釋DNA(pcDNA3重組pcDNA3各1.5用 到總體積50 pl(30/ml)。溶液B:用HBSffi釋6J脂質(zhì)體到終容積50 p (120pg/ml)?；旌先芤篈和B,輕柔混合(不要振蕩)，室溫孵育 15min,以便脂質(zhì)體/DNA 混合物形成。(3) 不要移去培養(yǎng)基，逐滴加入100 P脂質(zhì)體/DNA混合物(從培養(yǎng)孔一邊 到另一邊)，邊加邊輕搖培養(yǎng)板。(4) 37 T 孵育 6hr。(5) 6hr后更換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，加入2-3ml新鮮生長培養(yǎng)基。(6) 轉(zhuǎn)染24hr后施加篩選壓力，改用含 G418的培 養(yǎng)基培養(yǎng)。4、G418篩選：在G418篩選