專題17基因工程

五年考情考情分析

基因工程2025年山東卷第25題近五年山東高考生物試卷，基因工程考點(diǎn)

2024年山東卷第13題考查頻繁。重點(diǎn)考查基因工程的基本工具，如

2024年山東卷第25題限制酶、DNA連接酶；基本操作程序，像目

2023年山東卷第25題的基因獲取、表達(dá)載體構(gòu)建等，常結(jié)合實(shí)際案

2022年山東卷第13題例，考查學(xué)生知識運(yùn)用與分析能力。題目難度

2022年山東卷第25題系數(shù)大；其中啟動子的插入位點(diǎn)和插入方向、

2021年山東卷第13題報告基因的表達(dá)等都需要學(xué)生有很強(qiáng)的理解

2021年山東卷第25題信息、獲取信息的能力、以及綜合運(yùn)用知識解

決問題的科學(xué)思維和科學(xué)探究能力，通過基因

工程考查學(xué)生的結(jié)構(gòu)與功能觀。

一、單選題

1．（2024·山東·高考真題）關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)，下列說法正確的是（）

A．整個提取過程中可以不使用離心機(jī)

B．研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，應(yīng)充分搖勻再倒入燒杯中

C．鑒定過程中DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變

D．僅設(shè)置一個對照組不能排除二苯胺加熱后可能變藍(lán)的干擾

2．（2022·山東·高考真題）關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)，下列說法錯誤的是（）

A．過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進(jìn)行是為了防止DNA降解

B．離心研磨液是為了加速DNA的沉淀

C．在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍(lán)色

D．粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)

3．（2021·山東·高考真題）粗提取DNA時，向雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，

過濾后所得濾液進(jìn)行下列處理后再進(jìn)行過濾，在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出

DNA相對含量較高的白色絲狀物的處理方式是（）

A．加入適量的木瓜蛋白酶

B．37～40℃的水浴箱中保溫10～15分鐘

C．加入與濾液體積相等的、體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻的酒精

D．加入NaCl調(diào)節(jié)濃度至2mol/L→過濾→調(diào)節(jié)濾液中NaCl濃度至0．14mol/L

二、解答題

4．（2025·山東·高考真題）種子休眠是抵御穗發(fā)芽的一種機(jī)制。通過對Ti質(zhì)粒的改造，利用

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將Ti質(zhì)粒上的T-DNA隨機(jī)整合到小麥基因組中，篩選到2個種子休眠相關(guān)基

因的插入失活純合突變體。與野生型相比，突變體種子的萌發(fā)率降低。小麥基因組序列信息

已知。

(1)Ti質(zhì)粒上與其在農(nóng)桿菌中的復(fù)制能力相關(guān)的結(jié)構(gòu)為。選用圖甲中的SmaI對抗除草

劑基因X進(jìn)行完全酶切，再選擇SmaI和對Ti質(zhì)粒進(jìn)行完全酶切，將產(chǎn)生的黏性末端

補(bǔ)平，補(bǔ)平時使用的酶是。利用DNA連接酶將酶切后的包含抗除草劑基因X的片段

與酶切并補(bǔ)平的Ti質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；經(jīng)卡那霉素篩選并提取

質(zhì)粒后再選用限制酶進(jìn)行完全酶切并電泳檢測，若電泳結(jié)果呈現(xiàn)一長一短2條帶，較

短的條帶長度近似為bp，則一定為正向重組質(zhì)粒。

(2)為證明這兩個突變體是由于T-DNA插入到小麥基因組中同一基因?qū)е碌?，提取基因組

DNA，經(jīng)酶切后產(chǎn)生含有T-DNA的基因組片段（圖乙）。在此酶切過程中，限于后續(xù)PCR

難以擴(kuò)增大片段DNA，最好使用識別序列為（填“4”“6”或“8”）個堿基對的限制酶，

且T-DNA中應(yīng)不含該酶的酶切位點(diǎn)。需首先將圖乙的片段，才能利用引物P1和P2

成功擴(kuò)增未知序列。PCR擴(kuò)增出未知序列后，進(jìn)行了一系列操作，其中可以判斷出2條片

段的未知序列是否屬于同一個基因的操作為（填“瓊脂糖凝膠電泳”或“測序和序列比

對”）。

(3)通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的含有野生型基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入突變植株，如果檢測到野生

型基因，（填“能”或“不能”）確定該植株的表型為野生型。

5．（2024·山東·高考真題）研究發(fā)現(xiàn)基因L能夠通過脫落酸信號途徑調(diào)控大豆的逆境響應(yīng)。

利用基因工程技術(shù)編輯基因L，可培育耐鹽堿大豆品系。在載體上的限制酶BsaI切點(diǎn)處插

入大豆基因L的向?qū)NA序列，將載體導(dǎo)入大豆細(xì)胞后，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可引導(dǎo)核酸酶特異性

結(jié)合基因組上的目標(biāo)序列并發(fā)揮作用。載體信息、目標(biāo)基因L部分序列及相關(guān)結(jié)果等如圖

所示。

(1)用PCR技術(shù)從大豆基因組DNA中擴(kuò)增目標(biāo)基因L時，所用的引物越短，引物特異性越

（填“高”或“低”）。限制酶在切開DNA雙鏈時，形成的單鏈突出末端為黏性末端，若用BsaI

酶切大豆基因組DNA，理論上可產(chǎn)生的黏性末端最多有種。載體信息如圖甲所示，

經(jīng)BsaI酶切后，載體上保留的黏性末端序列應(yīng)為5'--3'和5'--3'。

(2)重組載體通過農(nóng)桿菌導(dǎo)入大豆細(xì)胞，使用抗生素篩選到具有該抗生素抗性的植株

①～④。為了鑒定基因編輯是否成功，以上述抗性植株的DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)

基因L，部分序列信息及可選用的酶切位點(diǎn)如圖乙所示，PCR產(chǎn)物完全酶切后的電泳結(jié)果如

圖丙所示。據(jù)圖可判斷選用的限制酶是，其中純合的突變植株是（填序號）。

(3)實(shí)驗(yàn)中獲得1株基因L成功突變的純合植株，該植株具有抗生素抗性，檢測發(fā)現(xiàn)其體細(xì)

胞中只有1條染色體有T-DNA插入。用抗生素篩選這個植株的自交子代，其中突變位點(diǎn)純

合且對抗生素敏感的植株所占比例為，篩選出的敏感植株可用于后續(xù)的品種選育。

6．（2023·山東·高考真題）科研人員構(gòu)建了可表達(dá)J-V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進(jìn)行了檢測，

該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示，其中V5編碼序列表達(dá)標(biāo)簽短肽V5。

(1)與圖甲中啟動子結(jié)合的酶是。除圖甲中標(biāo)出的結(jié)構(gòu)外，作為載體，質(zhì)粒還

需具備的結(jié)構(gòu)有（答出2個結(jié)構(gòu)即可）。

(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒后，為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進(jìn)行PCR檢測，若

僅用一對引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物。已知J基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈，由

此可知引物F1與圖甲中J基因的（填“a鏈”或“b鏈”）相應(yīng)部分的序列相同。

(3)重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測相應(yīng)蛋白是否

表達(dá)以及表達(dá)水平，結(jié)果如圖乙所示。其中，出現(xiàn)條帶1證明細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了，條

帶2所檢出的蛋白（填“是”或“不是”）由重組質(zhì)粒上的J基因表達(dá)的。

7．（2022·山東·高考真題）某種類型的白血病由蛋白P引發(fā)，蛋白UBC可使P被蛋白酶識

別并降解，藥物A可通過影響這一過程對該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機(jī)

理，需構(gòu)建重組載體以獲得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，

FLAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合，

但不影響P或P△的功能。

(1)為構(gòu)建重組載體，需先設(shè)計(jì)引物，通過PCR特異性擴(kuò)增P基因。用于擴(kuò)增P基因的引物

需滿足的條件是、為使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割，需在引物上添加相應(yīng)的限制酶識

別序列，該限制酶識別序列應(yīng)添加在引物的（填“3'端”或“5'端”）。

(2)PCR擴(kuò)增得到的P基因經(jīng)酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個融合基因，

如圖甲所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導(dǎo)入細(xì)胞后，融合

基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因

對應(yīng)的氨基酸序列與P不同。據(jù)圖甲分析，出現(xiàn)該問題的原因是。修改擴(kuò)增P基因

時使用的帶有EcoRⅠ識別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是。

(3)融合蛋白表達(dá)成功后，將FLAG-P、FLAG-P△、藥物A和UBC按照圖乙中的組合方式

分成5組。各組樣品混勻后分別流經(jīng)含F(xiàn)LAG抗體的介質(zhì)，分離出與介質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)并用

UBC抗體檢測，檢測結(jié)果如圖丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③

組結(jié)果的差異推測，藥物A的作用是；由②④組或③⑤組的差異推測，P△中缺失的

特定序列的作用是。

(4)根據(jù)以上結(jié)果推測，藥物A治療該病的機(jī)理是。

8．（2021·山東·高考真題）人類γ基因啟動子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)，

該位點(diǎn)結(jié)合BCL11A蛋白后，γ基因的表達(dá)被抑制。通過改變該結(jié)合位點(diǎn)的序列，解除對γ

基因表達(dá)的抑制，可對某種地中海貧血癥進(jìn)行基因治療?？蒲腥藛T擴(kuò)增了γ基因上游不同長

度的片段，將這些片段分別插入表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和熒光檢測，以確定BCL11A蛋白結(jié)

合位點(diǎn)的具體位置。相關(guān)信息如圖所示。

（1）為將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)熒光蛋白基因表達(dá)，需在引物末端添加限制酶識

別序列。據(jù)圖可知，在F1～F7末端添加的序列所對應(yīng)的限制酶是，在R末端添加的

序列所對應(yīng)的限制酶是。本實(shí)驗(yàn)中，從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個過程共需要

種酶。

（2）將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去BCL11A基因的受體細(xì)胞，成功轉(zhuǎn)化后，含F(xiàn)1～F6與R擴(kuò)

增產(chǎn)物的載體表達(dá)熒光蛋白，受體細(xì)胞有熒光，含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光。

含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光的原因是。

（3）向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，含F(xiàn)1～F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光，而

含F(xiàn)5～F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光。若γ基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對應(yīng)

的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)序列，據(jù)此結(jié)果可推測，BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)位

于，理由是。

一、單選題

1．（2025·山東濰坊·三模）融合PCR技術(shù)采用具有互補(bǔ)末端的引物，形成具有重疊鏈的PCR

產(chǎn)物，通過PCR產(chǎn)物重疊鏈的延伸，從而將不同來源的任意DNA片段連接起來（如圖）。

下列說法錯誤的是（）

A．基因甲至少經(jīng)3個循環(huán)才能獲得含引物P2的雙鏈等長DNA

B．不能為提高擴(kuò)增效率把四種引物同時加入一個擴(kuò)增體系

C．圖中融合PCR第一步的兩條鏈重疊部位可互相作為另一條鏈的引物

D．經(jīng)融合PCR獲得64個融合基因至少消耗63個引物P4

2．（2025·山東臨沂·三模）下列有關(guān)“DNA粗提取與鑒定”、“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定”

實(shí)驗(yàn)的敘述，錯誤的是（）

A．設(shè)置一組加二苯胺但是不加DNA的對照組用來排除二苯胺受熱變藍(lán)的可能

B．提取到的白色絲狀物直接與一定濃度的二苯胺溶液混合，沸水浴5min后變藍(lán)

C．電泳實(shí)驗(yàn)中待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時停止電泳

D．瓊脂糖凝膠中加入核酸染料，便于在300nm的紫外燈下檢測擴(kuò)增產(chǎn)物

3．（2025·山東濟(jì)南·二模）畢赤酵母是一種能直接利用甲醇的微生物，其含有的醇氧化酶基

因(AOX1)強(qiáng)效啟動子在甲醇存在時被激活，可以驅(qū)動外源基因的高效表達(dá)。人體蛋白

MT1-MMP定位在細(xì)胞膜上，并在多種腫瘤中被高表達(dá)出，MT1-MMP能促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。為

進(jìn)一步研究腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制，科研人員將MT1-MMP基因轉(zhuǎn)化至畢赤酵母，先將轉(zhuǎn)基因個體

進(jìn)行低密度發(fā)酵，然后再進(jìn)行高密度發(fā)酵，最終獲得目標(biāo)蛋白。下列相關(guān)說法正確的是（）

A．轉(zhuǎn)基因畢赤酵母和大腸桿菌作為發(fā)酵菌種都具有發(fā)酵周期短的優(yōu)點(diǎn)

B．目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量受發(fā)酵培養(yǎng)基成分、甲醇、溫度、pH的影響

C．可將MT1-MMP基因插入AOX1中以便通過甲醇調(diào)控基因表達(dá)

D．甲醇的作用是作為碳源和氮源以及誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白的表達(dá)

4．（2025·山東青島·二模）CRISPR/Cas9系統(tǒng)包含向?qū)NA（gRNA）和核酸酶Cas9，可以

對哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行基因組編輯。編輯時，Cas9蛋白在gRNA的引導(dǎo)下，結(jié)合基因組的特

定位點(diǎn)并進(jìn)行切割。科研人員利用圖中g(shù)RNA和Cas9共表達(dá)質(zhì)粒，對體外培養(yǎng)的小鼠細(xì)胞

中A基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。下列說法錯誤的是（）

A．可以依據(jù)A基因的部分序列設(shè)計(jì)共表達(dá)質(zhì)粒中的編碼gRNA序列

B．編碼gRNA的序列需要整合到受體細(xì)胞基因組DNA上才能發(fā)揮作用

C．導(dǎo)入該質(zhì)粒后使用含潮霉素的液體培養(yǎng)基篩選受體細(xì)胞

D．用抗原—抗體雜交技術(shù)檢測結(jié)果為部分細(xì)胞A蛋白表達(dá)量降低

5．（2025·山東濟(jì)南·二模）單親二體(UPD)是指體細(xì)胞中某對同源染色體來自同一親本，其

它染色體組成正常的個體，其染色體組成是2n。微衛(wèi)星DNA(STR)的核心序列為2-6個堿基，

重復(fù)次數(shù)和分布個數(shù)因染色體而異，可以隨染色體穩(wěn)定地遺傳給下一代?？墒褂肧TR檢測

技術(shù)對UPD進(jìn)行診斷：先在各條染色體上找到STR區(qū)域，在STR區(qū)域的兩側(cè)設(shè)計(jì)PCR引

物，每對引物當(dāng)中有一條是帶熒光標(biāo)記的，在同一體系中進(jìn)行PCR得到帶有不同熒光標(biāo)記

的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)電泳后被檢測到，然后進(jìn)行比對、確認(rèn)。下列說法錯誤的是（）

A．同一體系中進(jìn)行PCR使用的引物的復(fù)性溫度應(yīng)大致相同

B．用含有核酸染料的載樣緩沖液來鑒定擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物

C．UPD現(xiàn)象可能會導(dǎo)致隱性遺傳病以顯性方式傳遞

D．檢測過程需要分析多個STR位點(diǎn)以確定是否為UPD

6．（2025·山東青島·二模）為能快速找到特定抗原的高親和力抗體，研究者構(gòu)建抗體文庫。

從免疫后動物的特定細(xì)胞中提取總mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，構(gòu)建重組載

體，再把重組載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞，形成含不同抗體基因的細(xì)胞集合，即抗體文庫。下列說

法錯誤的是（）

A．“特定細(xì)胞”是B淋巴細(xì)胞

B．反轉(zhuǎn)錄出的cDNA全部是抗體基因

C．基因需要定向插入啟動子和終止子中間才能表達(dá)

D．抗體分布在宿主細(xì)胞表面有利于進(jìn)行抗體篩選

7．（2025·山東青島·二模）DNA因構(gòu)象不同在電泳時的遷移速率有所差異。超螺旋DNA以

超螺旋形式存在，分子體積??；線性DNA分子伸展，在凝膠中移動時受到的摩擦力較大；

開環(huán)DNA是由環(huán)狀DNA雙鏈中的一條鏈發(fā)生斷裂形成，分子更松散。下列說法正確的是

（）

A．電泳時需要留一個加樣孔加入標(biāo)準(zhǔn)參照物

B．電泳時電泳指示劑加在凝膠中，核酸染料與PCR產(chǎn)物混合加入加樣孔

C．電泳后的凝膠置于紫外燈下，看到的DNA條帶呈藍(lán)色

D．三種構(gòu)象的DNA在不同濃度的凝膠中遷移速率一定不同

8．（2025·山東青島·二模）微生物底盤細(xì)胞是指經(jīng)過基因工程改造、用于高效表達(dá)目標(biāo)蛋白

的宿主細(xì)胞系統(tǒng)。利用合成生物學(xué)相關(guān)技術(shù)對底盤細(xì)胞進(jìn)行遺傳及代謝途徑改造，可以構(gòu)建

出較為理想的細(xì)胞工廠，具體流程見圖。研究者已用畢赤酵母作為底盤細(xì)胞來生產(chǎn)次生代謝

產(chǎn)物萜類物質(zhì)。下列說法錯誤的是（）

A．畢赤酵母生產(chǎn)的萜類物質(zhì)是酵母生長所必需的物質(zhì)

B．某基因失活后菌株無法存活可以確定該基因是必需基因

C．去除野生菌株的非必需基因降低底盤細(xì)胞的復(fù)雜性，保證目的基因的高效表達(dá)

D．選擇大腸桿菌做底盤細(xì)胞直接合成的胰島素通常不具備生物活性

9．（2025·山東濟(jì)南·二模）農(nóng)桿菌感知到植物分泌的酚類化合物后，會開啟其侵染過程，胞

內(nèi)蛋白V2識別并切割T-DNA的邊界序列，切割后的T-DNA的一條鏈與V2形成復(fù)合物經(jīng)通

道復(fù)合體進(jìn)入植物細(xì)胞。植物細(xì)胞被農(nóng)桿菌侵染后會合成磷酸化的蛋白(VIP1-P)激活抗病相

關(guān)基因的表達(dá)。同時，農(nóng)桿菌的VF蛋白通過通道復(fù)合體進(jìn)入植物細(xì)胞使VIP1-P去磷酸化

且去除T-DNA上的V2為T-DNA的整合做準(zhǔn)備。下列說法正確的是（）

A．V2識別切割T-DNA并與其形成復(fù)合物的過程主要由線粒體供能

B．VF降低了植物的抗菌能力并促進(jìn)了T-DNA與染色體DNA的整合

C．T-DNA與VF借助細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)通過胞吞進(jìn)入細(xì)胞

D．農(nóng)桿菌侵染進(jìn)入植物細(xì)胞的過程未涉及氫鍵、磷酸二酯鍵的斷裂與形成

10．（2025·山東泰安·三模）關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”、“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定”實(shí)

驗(yàn)，下列說法正確的是（）

A．將過濾的洋蔥研磨液低溫放置幾分鐘，取沉淀物備用

B．在白色絲狀物中加入二苯胺試劑即可出現(xiàn)藍(lán)色

C．根據(jù)待分離DNA片段的大小，用擴(kuò)增緩沖液配制成瓊脂糖溶液

D．加樣孔要留出一個孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物

11．（2025·山東菏澤·二模）下列關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”和“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒

定”實(shí)驗(yàn)的敘述，錯誤的是（）

A．DNA不溶于95%的冷酒精，但可溶于2mol/LNaCl溶液

B．將洋蔥切碎、研磨、過濾，濾液放置4℃冰箱中靜置幾分鐘后，DNA存在于上清液

中

C．在凝膠電泳中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)

D．凝膠載樣緩沖液中加入的核酸染料能與DNA分子的結(jié)合，便于在紫外燈下觀察

12．（2025·山東日照·二模）PCR和瓊脂糖凝膠電泳是基因工程中常用的兩種技術(shù)，下列對

其中所用試劑和操作的說法正確的是（）

A．PCR所用微量離心管、微量移液器、槍頭都要進(jìn)行高壓蒸汽滅菌

B．PCR擴(kuò)增前，應(yīng)根據(jù)待擴(kuò)增DNA片段的長度設(shè)置合適的延伸溫度

C．需將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與內(nèi)含核酸染料的緩沖液混合后進(jìn)行加樣

D．DNA分子較大時，可適當(dāng)降低凝膠濃度來提高DNA分子的遷移速率

13．（2025·山東泰安·二模）染色體上的端粒DNA由短的串聯(lián)重復(fù)序列組成，同種生物的該

序列相同。少數(shù)缺乏端粒酶活性的腫瘤細(xì)胞可通過端粒延長替代機(jī)制（ALT）維持端粒長度。

ALT機(jī)制如下：第一條染色體端粒的末端①鏈結(jié)合到第二條染色體端粒的末端②鏈上并延

伸；隨后①鏈脫離，在RNA引物和DNA聚合酶的作用下，新延長的①鏈被轉(zhuǎn)化成雙鏈形

式。這個過程可被重復(fù)數(shù)十次，使得序列信息從一個端粒傳遞到另一端粒上。下列說法錯誤

的是（）

A．①鏈的延伸過程以②鏈作為模板，該過程不需要合成引物

B．DNA聚合酶只能從核酸片段3′端延伸，這導(dǎo)致端粒DNA5′端比3′端短

C．進(jìn)行ALT的腫瘤細(xì)胞中端粒酶基因甲基化程度可能較高

D．非同源染色體間通過ALT機(jī)制實(shí)現(xiàn)了基因重組，增加了遺傳的多樣性

14．（2025·山東泰安·二模）雙向啟動子可同時結(jié)合兩個RNA聚合酶來驅(qū)動下游基因的表達(dá)，

研究人員構(gòu)建了如圖所示的表達(dá)載體，以檢測雙向啟動子作用效果。下列分析正確的是（）

A．表達(dá)載體中GUS基因和LUC基因轉(zhuǎn)錄時使用同一條DNA單鏈為模板

B．為連入GUS基因，需用SalI和SphI酶切已整合了雙向啟動子及LUC基因的質(zhì)粒

C．在培養(yǎng)基中添加壯觀霉素可篩選出成功導(dǎo)入表達(dá)載體的受體細(xì)胞

D．通過觀察是否出現(xiàn)熒光和藍(lán)色物質(zhì)可檢測雙向啟動子的作用效果

15．（2025·山東濰坊·一模）提取細(xì)菌中質(zhì)粒時常通過調(diào)節(jié)pH使DNA先變性再復(fù)性，擬核

DNA分子因?yàn)闊o法復(fù)性與其他較大的分子沉淀下來，質(zhì)粒可以復(fù)性與其他小的核酸分子留

在上清液中。下列說法錯誤的是（）

A．DNA變性過程中會發(fā)生氫鍵的斷裂

B．提取液中應(yīng)加入一定量的核糖核酸水解酶

C．將提取液中的質(zhì)粒加乙醇析出后，可以再溶于2mol/L的NaCl溶液中

D．通過電泳分離質(zhì)粒時，待分離的質(zhì)粒越大，配置的瓊脂糖溶液濃度越高

16．（2025·山東棗莊·二模）采用焦磷酸光化測序法進(jìn)行DNA測序的原理是：將待測DNA

鏈固定到一個磁珠上，將磁珠包被在單個油水混合小滴（乳滴）中，在該乳滴里進(jìn)行獨(dú)立的

DNA復(fù)制，四種脫氧核苷三磷酸依照T、A、C、G的順序一個一個進(jìn)入該乳滴，如果發(fā)生

堿基配對，就會釋放一個焦磷酸（PPi），PPi經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)后發(fā)出熒光。下列說法錯

誤的是（）

A．脫氧核苷三磷酸通過磷酸二酯鍵把脫氧核苷酸接到多核苷酸鏈的3'-OH末端

B．PPi經(jīng)過一系列的酶促反應(yīng)后，釋放出的能量一部分可轉(zhuǎn)化為光能

C．當(dāng)胞嘧啶脫氧核苷三磷酸進(jìn)入后能發(fā)出熒光，說明此位置模板鏈上為G

D．若將四種脫氧核苷三磷酸同時加入反應(yīng)體系中，可大大提高DNA測序的效率

17．（2025·山東棗莊·二模）下列與DNA有關(guān)的實(shí)驗(yàn)，說法正確的是（）

A．DNA粗提取時加入冷酒精出現(xiàn)白色絲狀物后不能用離心法收集

B．PCR緩沖液中Mg2+作用是激活DNA聚合酶，濃度越高，酶活性越大

C．DNA電泳指示劑需要加入到熔化之后凝固之前的瓊脂糖中

D．DNA電泳指示劑的作用主要用來指示何時停止電泳

18．（2025·山東濟(jì)南·一模）依賴解旋酶DNA等溫（65℃）擴(kuò)增技術(shù)可實(shí)現(xiàn)體外擴(kuò)增DNA

分子。利用解旋酶將DNA雙鏈在恒溫下解開，在DNA聚合酶的作用下形成子鏈的過程如

圖所示。下列說法錯誤的是（）

A．推測圖中1為DNA聚合酶，2為解旋酶

B．DNA單鏈結(jié)合蛋白的直接作用是使復(fù)制雙向進(jìn)行

C．解旋酶的作用是破壞氫鍵

D．該技術(shù)中每次循環(huán)包括解旋、復(fù)性、延伸三個過程

19．（2025·山東青島·一模）野生大豆的SAMS基因具有提高抗逆性的作用。水稻是一種鹽

敏感型作物，為提高水稻的抗鹽堿脅迫能力，研究者將野生大豆的SAMS基因轉(zhuǎn)入水稻細(xì)

胞內(nèi)，從而培養(yǎng)出轉(zhuǎn)基因水稻株系，具體過程如圖。下列說法錯誤的是（）

A．圖示過程中發(fā)生了兩次轉(zhuǎn)化

B．Ⅰ和Ⅲ都需使用固體培養(yǎng)基

C．Ⅰ中的篩選可使用PCR技術(shù)

D．獲得的轉(zhuǎn)基因水稻苗都具備抗鹽堿能力

20．（2025·山東青島·一模）我國科學(xué)家敲除豬的糖抗原合成基因（β4GalNT2），轉(zhuǎn)入相應(yīng)的

調(diào)節(jié)基因后，將基因編輯豬的單個腎移植給獼猴，同時切除獼猴的自體雙腎，最終移植腎存

活184天。在移植成功5個月內(nèi)，獼猴的移植腎功能完全正常，之后出現(xiàn)逐漸加重的蛋白尿。

下列說法正確的是（）

A．基因編輯豬的成功體現(xiàn)了動物細(xì)胞的全能性

B．出現(xiàn)蛋白尿的原因主要是腎小管細(xì)胞凋亡導(dǎo)致

C．豬和獼猴腎臟的差異體現(xiàn)了基因的選擇性表達(dá)

D．敲除β4GalNT2能改變膜蛋白種類，降低免疫排斥反應(yīng)

21．（2025·山東青島·一模）采用PCR技術(shù)可獲取并擴(kuò)增目的基因。下列說法正確的是（）

A．若PCR的模板是mRNA，完成擴(kuò)增只需要逆轉(zhuǎn)錄酶

B．預(yù)變性有利于模板DNA充分解聚為單鏈

C．復(fù)性溫度太高會導(dǎo)致引物和模板的非特異性結(jié)合增加

D．一個DNA模板完成第20輪循環(huán)需要（220-2）個引物

22．（2025·山東青島·一模）已知紫外線（UV）可誘導(dǎo)DNA單鏈上相鄰的T之間相互結(jié)合

形成嘧啶二聚體，阻礙堿基正常配對而導(dǎo)致復(fù)制錯誤引起突變，DNA修復(fù)機(jī)制對維持遺傳

穩(wěn)定性至關(guān)重要。研究人員發(fā)現(xiàn)某細(xì)菌中存在兩種如圖所示修復(fù)機(jī)制：①光復(fù)活修復(fù)：光復(fù)

活酶（PRE）在可見光下直接切割二聚體，恢復(fù)原結(jié)構(gòu)；②暗修復(fù)：無需光照，通過切除損

傷單鏈并重新合成。下列說法正確的是（）

A．PRE可將嘧啶二聚體的磷酸二酯鍵斷開

B．暗修復(fù)過程中還需消耗原料、能量和引物

C．PRE基因發(fā)生堿基替換后，在光照下PRE的修復(fù)功能可能正常

D．UV誘導(dǎo)DNA形成嘧啶二聚體引起的變異不可遺傳

二、多選題

23．（2025·山東臨沂·三模）某研究小組構(gòu)建了能表達(dá)ACTA1-GFP融合蛋白的重組質(zhì)粒，該

重組質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如下圖所示。下列敘述錯誤的是（）

注：F1和F2表示上游引物，R1和R2表示下游引物

A．RNA聚合酶與啟動子結(jié)合，調(diào)控ACTA1基因和GFP基因的表達(dá)

B．僅用F2和R1一對引物無法確定ACTA1基因插入方向是否正確

C．ACTA1基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈?zhǔn)莂鏈，引物F1與a鏈的部分序列相同

D．若用引物F2和R2進(jìn)行PCR，能更好地區(qū)分ACTA1-GFP基因純合子和雜合子

24．（2025·山東濟(jì)南·二模）進(jìn)行性脊柱性肌萎縮癥(SMA)與假肥大型進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良癥

(DMD)兩種遺傳病癥狀相似，均會導(dǎo)致肌肉力量不足，臨床上較難區(qū)分。SMA由等位基因

A、a控制，DMD由等位基因B、b控制，A、a和B、b不位于Y染色體上。圖1為兩種遺

傳病的系譜圖，圖2為家系中部分個體兩種病相關(guān)基因PCR擴(kuò)增后獲得的電泳（可分離不

同基因，M為標(biāo)準(zhǔn)樣品）圖，不考慮突變和互換。下列說法錯誤的是（）

A．Ⅲ?的DMD致病基因來自I?

B．Ⅱ?和Ⅱ?再生一個患病男孩的概率為5/16

C．可調(diào)查Ⅰ?父親是否患病來判斷I?的患病類型

D．a(chǎn)基因可能由A基因發(fā)生堿基對的增添突變而來

25．（2025·山東泰安·二模）某遺傳病家系的系譜圖如圖甲所示，已知該遺傳病由正?；駻

突變成A1或A2引起，且A1對A和A2為顯性、A對A2為顯性。為確定家系中某些個體的

基因型，分別根據(jù)A1和A2兩種基因的序列，設(shè)計(jì)鑒定該遺傳病基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，

電泳結(jié)果如圖乙所示。下列說法正確的是（）

A．表型相同的個體電泳結(jié)果不一定相同，電泳結(jié)果相同的個體表型一定相同

B．若Ⅱ3的電泳結(jié)果有2條條帶，則Ⅱ2和Ⅲ3基因型相同的概率為1/3

C．若Ⅲ5的電泳結(jié)果僅有1條條帶，則Ⅱ6的基因型只有1種可能

D．若Ⅲ1與正常女子結(jié)婚，生育后代患病的概率為1/2

26．（2025·山東棗莊·一模）關(guān)于“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定”（實(shí)驗(yàn)1）和“DNA的粗提

取與鑒定”（實(shí)驗(yàn)2）的實(shí)驗(yàn)操作，下列相關(guān)敘述錯誤的是（）

A．實(shí)驗(yàn)1中，DNA電泳時需要在瓊脂糖熔化之后凝固之前加入核酸染料

B．實(shí)驗(yàn)1中，將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，加樣前應(yīng)先接通電源

C．實(shí)驗(yàn)2中，取洋蔥研磨液的上清液，加入等體積的體積分?jǐn)?shù)為70%的冷酒精后析出

DNA

D．實(shí)驗(yàn)2中，需先將白色絲狀物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加二苯胺試劑并進(jìn)行

沸水浴，用于鑒定DNA

三、解答題

27．（2025·山東臨沂·三模）熒光素酶（Luc蛋白）由550個氨基酸組成，分為N端和C端

2個功能片段，即NLuc蛋白（2-416氨基酸）和CLuc蛋白（398—550氨基酸），兩部

分不能自動重組并發(fā)揮作用；將目標(biāo)蛋白OsBIK1蛋白和OsXLG2蛋白分別與NLuc蛋白和

CLuc蛋白融合，若2個目標(biāo)蛋白相互作用，則NLuc蛋白和CLuc蛋白能成功組裝為熒光素

酶并分解熒光素發(fā)出熒光。科研人員構(gòu)建了可表達(dá)OsBIK1-HA-NLuc融合蛋白的表達(dá)載體1

和可表達(dá)CLuc-OsXLG2融合蛋白的表達(dá)載體2并進(jìn)行了檢測，如圖1所示，圖中HA為標(biāo)

簽蛋白（用于目的蛋白的檢測、示蹤等）的編碼序列。

(1)構(gòu)建重組質(zhì)粒1時，需要把OsBIK1基因的對應(yīng)終止密碼子的3個堿基去除，原因

是；圖中HA編碼序列插入OsBIK1基因編碼鏈的（填“5'端”或“3'

端”），編碼鏈為轉(zhuǎn)錄時所用模板鏈的互補(bǔ)鏈。

(2)如果用抗Luc蛋白抗體分別檢測表達(dá)載體1和2融合蛋白表達(dá)情況，結(jié)果如圖2，可優(yōu)先

選用抗蛋白抗體進(jìn)一步區(qū)分條帶1為融合蛋白。

(3)為了滿足應(yīng)用常需要在載體中構(gòu)建誘導(dǎo)型啟動子，當(dāng)誘導(dǎo)物存在時可以激活或抑制目的

基因的表達(dá)。雙向啟動子可同時結(jié)合兩個RNA聚合酶來驅(qū)動下游基因的表達(dá)，研究人員已

經(jīng)構(gòu)建了下圖所示的基因表達(dá)載體，以檢測雙向啟動子作用效果。試分析：為連入GUS基

因，需用酶切已整合了雙向啟動子及LUC基因的質(zhì)粒，若觀察到則

可確認(rèn)雙向啟動子起作用。

28．（2025·山東濟(jì)南·二模）研究發(fā)現(xiàn)水稻MEL2基因等位突變體mel2會導(dǎo)致個體不能產(chǎn)生

雌配子，個體的花粉育性保持完全正常，其他農(nóng)藝性狀均不受影響?？蒲腥藛T將野生型MEL2

基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后接入圖甲中含有殺花粉基因ZM-AA1和糊粉層特異性表達(dá)的紅色熒光基

因DsRed2的雙T-DNA載體中，以獲得新的品系，構(gòu)建過程如圖所示。

(1)通過PCR擴(kuò)增水稻MEL2基因并正確連入圖甲載體中，使用的F引物5'端需要添加的序

列為5'CACTGC3'（寫出15bp序列）。

(2)使用Bb.Bts1對圖甲載體插入位點(diǎn)可得到個缺口，推測圖中94℃處理的目的

是；使用LacZ作為菌落篩選基因時，重組轉(zhuǎn)化后的陽性菌落呈

色（填“藍(lán)”或“白”）。

(3)將重組載體導(dǎo)入mel2純合突變體，可在陽性轉(zhuǎn)化苗（兩T-DNA均可檢測到）的后代中

挑選出只含第二個T-DNA插入的株系A(chǔ)，原因是；假設(shè)株系A(chǔ)只有一個

T-DNA插入且不影響其他基因功能，該株系自交后產(chǎn)生的種子中紅色熒光種子的比例

為。

29．（2025·山東濰坊·三模）科研人員通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除小鼠的PPP2R3A基因，研

究該基因?qū)π∈笮呐K功能的影響。其過程為：構(gòu)建含sgRNA基因和Cas9酶基因的表達(dá)載體，

通過顯微注射將該表達(dá)載體導(dǎo)入小鼠的卵細(xì)胞中，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除PPP2R3A基

因構(gòu)建模型小鼠。圖1為Cas9酶基因的DNA片段且轉(zhuǎn)錄方向從左到右；圖2為所用質(zhì)粒

及質(zhì)粒上有關(guān)限制酶的識別序列和酶切位點(diǎn)示意圖，Ampr為氨芐青霉素抗性基因、Tetr為四

環(huán)素抗性基因。

(1)研究表明，Cas9酶基因兩側(cè)沒有限制酶切位點(diǎn)，在構(gòu)建表達(dá)載體的過程中，可借助PCR

技術(shù)在引物的（填“5′”或“3′”）端添加限制酶切序列；引物1序列區(qū)由5′→3′的堿基序

列為，引物2序列區(qū)應(yīng)含有限制酶的識別序列。

(2)研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)際操作時，只需敲除PPP2R3A基因的部分堿基序列，即可使其失去功能。

科研小組用PPP2R3A基因敲除的模型小鼠（KO組）與未做處理的小鼠（WT組）進(jìn)行雜交，

獲得子代小鼠（F1組）。三組小鼠PPP2R3A基因的電泳圖譜如下圖所示。

據(jù)圖分析，PPP2R3A基因的長度為；敲除掉的堿基序列長度為；4、5、6、12、

14是組小鼠的電泳圖。

(3)該科研小組檢測了小鼠心臟組織中相關(guān)基因的表達(dá)情況，結(jié)果如下表所示（RGS19為參

與心臟發(fā)育的蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控因子）。

PPP2R3A

組別PPP2R3A蛋白RGS19

mRNA

WT組1.310.240.87

KO組0.760.141.21

據(jù)表分析可知，與WT組相比，KO組。由此可以得出結(jié)論是。

30．（2025·山東泰安·三模）科研人員嘗試?yán)秒u新城疫病毒（HB1）基因和傳染性支氣管炎

病毒（H120）基因，采用基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因工程菌，以制備二聯(lián)體疫苗，所需要的

限制酶的識別序列和切割位點(diǎn)如表所示，培育流程如圖所示。

限制酶BclIPvitⅡXbaISau3AI

識別序列和切割位點(diǎn)（5′-3'）T↓GATCACAG↓CTGT↓CTAGA↓GATC

(1)根據(jù)圖示信息，應(yīng)選用限制酶切割質(zhì)粒，不選用其他限制酶的原因

是。

(2)為保證融合基因與質(zhì)粒的正向連接，在設(shè)計(jì)PCR引物時，應(yīng)在b鏈對應(yīng)引物的（填“3'”

或“5′”）端添加限制酶（填種類）的識別序列。根據(jù)圖表信息，寫出該引物的12

個堿基序列5′--3′。

(3)為篩選出導(dǎo)入了基因表達(dá)載體的大腸桿菌，培養(yǎng)基甲中應(yīng)添加（填“四環(huán)素”

或“青霉素”）,培養(yǎng)基乙中應(yīng)添加（填“四環(huán)素”或“青霉素”）,菌落（填圖

中數(shù)字）中的大腸桿菌可用來制備疫苗。

31．（2025·山東青島·二模）轉(zhuǎn)錄因子是一類在基因表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)，主要

功能是通過結(jié)合DNA特定序列，控制基因轉(zhuǎn)錄的起始和強(qiáng)度。WRKY基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子

在植物的抗逆方面發(fā)揮著重要的作用。為提高菠蘿的抗干旱能力，研究人員利用Gateway

克隆技術(shù)構(gòu)建WRKY基因的過表達(dá)載體，培育出抗干旱的轉(zhuǎn)基因菠蘿。Gateway克隆技術(shù)

包含BP反應(yīng)和LR反應(yīng)兩個階段。

(1)為得到兩端含attB的WRKY基因，可采用技術(shù)，完成該技術(shù)需要提供的物質(zhì)

有。

(2)BP反應(yīng)中，帶有attB序列的WRKY基因與pENTR載體混合，加入BP克隆酶，attB和

attP位點(diǎn)之間會發(fā)生互換，形成。這種技術(shù)與傳統(tǒng)的構(gòu)建方法相比，區(qū)別

是。

(3)LR反應(yīng)中，pENTR載體上的attL位點(diǎn)和pGWB605載體上的attR位點(diǎn)在LR克隆酶的催

化下發(fā)生互換，從而將WRKY基因轉(zhuǎn)移到pGWB605載體上。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，在培養(yǎng)基

上存活的一定是含WRKY基因的pGWB605載體，而不是pGWB605載體，理由是。

(4)pGWB605載體含植物強(qiáng)啟動子，能。將重組載體導(dǎo)入菠蘿愈傷組織后，通過

技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因菠蘿植株。除了比較轉(zhuǎn)基因菠蘿和非轉(zhuǎn)基因菠蘿細(xì)胞中的WRKY轉(zhuǎn)錄因子

的含量外，還需要從水平來檢測轉(zhuǎn)基因菠蘿是否培育成功。

32．（2025·山東日照·二模）研究人員利用纖維素生產(chǎn)菌(酪氨酸合成缺陷型)合成了黑色纖維

素薄膜。蛋白T7RNAP是一種噬菌體RNA聚合酶(T7RNAP的N端或C端單獨(dú)存在時不能

發(fā)揮作用，二者結(jié)合可形成完整的T7RNAP)，nMag和pMag是在藍(lán)光環(huán)境下能夠相互結(jié)合

的兩種光敏蛋白。研究人員通過PCR技術(shù)獲融合基因，并將不同類型的啟動子與相關(guān)基因

連接，構(gòu)建成基因表達(dá)載體，然后將其導(dǎo)入受體菌，獲得了所需的工程菌。

(1)研究人員利用PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)編碼T7RNAPN端的基因下游序列與編碼nMag的基因上游

序列的無縫連接，獲得編碼T7RNAPN端-nMag的融合基因，由圖1可知，引物2的5＇端

9個堿基序列為5＇3＇，如此設(shè)計(jì)引物2的目的是。用同樣的方法

獲得編碼pMag-T7RNAPC端的融合基因。

(2)通用型啟動子能夠被纖維素生產(chǎn)菌的RNA聚合酶識別，結(jié)構(gòu)完整的T7RNAP對T7啟動

子表現(xiàn)出高度的特異性。為獲得藍(lán)光誘導(dǎo)著色的纖維素生產(chǎn)工程菌，構(gòu)建了下圖所示的基因

表達(dá)載體，圖中3個啟動子中，表示通用型啟動子的是(填序號)，表示T7啟動

子的是(填序號)。

(3)將構(gòu)建好的載體導(dǎo)入纖維素生產(chǎn)菌前，通常用處理受體細(xì)胞。為篩選出能夠

生產(chǎn)黑色纖維素薄膜的工程菌，培養(yǎng)基中應(yīng)添加。

33．（2025·山東青島·一模）水體中的雌激素能使斑馬魚細(xì)胞產(chǎn)生E蛋白，激活卵黃蛋白原

（vtg）基因的表達(dá)，因此斑馬魚可用于監(jiān)測環(huán)境雌激素污染程度。為了實(shí)現(xiàn)可視化監(jiān)測，

科學(xué)家將圖1中的vtg基因與圖2中Luc基因載體連接，形成vtg-Luc基因重組載體，成功

培育了轉(zhuǎn)基因斑馬魚，當(dāng)極微量雌激素污染水體，斑馬魚的肝臟就發(fā)出熒光。Luc表示熒光

素酶基因（無啟動子），Kanr為卡那霉素抗性基因，ori為復(fù)制起點(diǎn)，BamHI、BclI、HindIII、

BsrGI為限制酶，→表示轉(zhuǎn)錄方向。

注：圖1DNA片段不含有圖2所示限制酶的識別序列

(1)為使vtg基因與Luc基因載體形成重組載體，選用限制酶切割Luc基因載體可

降低“空載”概率。通過PCR技術(shù)獲取vtg基因時，需設(shè)計(jì)合適的引物。依據(jù)圖示信息，推測

引物1包含的堿基序列為5′3′。（寫出已知的所有堿基序列）

(2)將“vtg-Luc基因重組載體”導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增，為便于篩選，應(yīng)將大腸桿菌接種在

含的培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)基因成功的斑馬魚只在肝臟中發(fā)出熒光指示污染，其原因

是。

(3)Luc基因載體上有一段P2A序列，其功能如圖所示，據(jù)此推測P2A的作用。

(4)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，E蛋白能與vtg基因啟動子的特定序列結(jié)合，啟動該基因的表達(dá)。已知

vtg基因啟動子含區(qū)域1和區(qū)域2，為研究E蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn)：用限制酶將

啟動子切割成含區(qū)域1和區(qū)域2的兩個片段，將兩個酶切片段分別與Luc基因載體連接，連

接位點(diǎn)位于Luc基因的上游，形成兩種重組載體。將重組載體分別導(dǎo)入斑馬魚的，

待發(fā)育成熟后，往水體中添加進(jìn)行檢測。

34．（2025·山東濰坊·一模）利用基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas12a開發(fā)出的核酸檢測技術(shù)，可

更加精確快速的進(jìn)行核酸檢測。該系統(tǒng)由crRNA與Cas12a蛋白組成，利用crRNA介導(dǎo)Cas12a

蛋白能準(zhǔn)確切割靶標(biāo)DNA，Cas12a蛋白切割靶標(biāo)DNA的同時切割熒光底物使其發(fā)出熒光，

通過檢測熒光強(qiáng)度確定靶標(biāo)DNA含量?，F(xiàn)利用工程菌制備CRISPR/Cas12a復(fù)合體來檢測自

來水中的大腸桿菌，如圖所示。

(1)PCR獲取目的基因時，緩沖液中Mg2+的作用是，crRNA序列應(yīng)符合的條件

是。

(2)為實(shí)現(xiàn)Cas12a蛋白基因、crRNA編碼序列與質(zhì)粒的準(zhǔn)確連接，質(zhì)粒中兩處BsaⅠ酶切后的

黏性末端應(yīng)（填“相同”或“不同”）。為使重組質(zhì)粒中不出現(xiàn)BsaⅠ識別序列，需在

F和R引物5'端添加的序列是（填標(biāo)號）。

①F5'-NNNNNGAGACC-3'R5'-NNNNNGAGACC-3'

②F5'-GGTCTCNNNNN-3'R5'-GGTCTCNNNNN-3'

③F5'-GGTCTCNNNNN-3'R5'-NNNNNGAGACC-3'

④F5'-NNNNNGAGACC-3'R5'-GGTCTCNNNNN-3'

(3)若要篩選到含有基因表達(dá)載體的工程菌，培養(yǎng)基中除細(xì)菌生長的必需條件外還應(yīng)加

入，從菌落分別挑取少許菌體，接種到含的平板上，若，

則對應(yīng)菌落中細(xì)菌含有基因表達(dá)載體。

(4)下圖為利用CRISPR/Cas12a復(fù)合體檢測自來水中大腸桿菌DNA含量時繪制的曲線，實(shí)驗(yàn)

中設(shè)置不含大腸桿菌對照組的作用是。一段時間后，熒光信號強(qiáng)度不再升高，

原因是。

35．（2025·山東棗莊·二模）無縫克隆技術(shù)首先對質(zhì)粒PCR1獲得線性化載體，然后通過PCR2

在目的基因片段的兩端插入與線性化載體兩端相同的堿基序列。再將上述兩類PCR產(chǎn)物混

合，在In-Fusion酶的作用下，憑借其3′→5′外切核酸酶活性，從線性化DNA的3′端起始切

除15個核苷酸，進(jìn)而暴露出部分單鏈區(qū)域，最終在某些酶的作用下促使插入片段與載體實(shí)

現(xiàn)連接。Gata基因是哺乳動物體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，

研究者利用無縫克隆技術(shù)將Gata基因和綠色熒光蛋白（GFP）基因連接，構(gòu)建融合蛋白以

研究Gata基因的作用機(jī)理，相關(guān)流程如下圖所示。

(1)PCR過程中引物與模板結(jié)合發(fā)生在階段。對質(zhì)粒進(jìn)行PCR1擴(kuò)增時，引物應(yīng)

選。

A．5'TAGATCTCAGTCGATC3'B．5'GATCGACTGAGATCTA3'

C．5'AGGATCAGTCCGCTA3'D．5'TAGCGGACTGATCCCT3'

(2)進(jìn)行PCR2過程中，為了在GFP基因兩端分別增加Ⅰ、Ⅱ片段，應(yīng)該從引物①②③④中選

擇引物，并且還要在引物的（填“5'”或“3'”）端添加Ⅰ、Ⅱ片段對應(yīng)序列。PCR2

進(jìn)行第四輪擴(kuò)增結(jié)束時，PCR反應(yīng)體系中含個需要的雙鏈GFP基因片段。將線性化

載體與目的GFP基因相連構(gòu)建重組質(zhì)粒階段除了需要InFusion酶之外，還需要酶。

(3)將實(shí)驗(yàn)得到的常染色體上轉(zhuǎn)入一個Gata-GFP融合基因的1只雄性小鼠，與野生型雌鼠雜

交，得到F1小鼠若干，F(xiàn)1雌雄小鼠相互交配得到F2，其中Gata-GFP基因純合子小鼠的比例

為。

36．（2025·山東棗莊·一模）中國“干擾素之父”侯云德院士于1982年成功研發(fā)我國第一個基

因工程創(chuàng)新藥物——干擾素。干擾素是一種白細(xì)胞產(chǎn)生的具有抗病毒能力的分泌蛋白。研究

人員從感染病毒的雞白細(xì)胞提取全基因組mRNA，利用PCR技術(shù)獲取雞干擾素基因，圖1

表示雞干擾素蛋白有關(guān)的基因片段，序號~表示引物。然后將獲取的目的基因連接在大

腸桿菌的pET32a質(zhì)粒（5900bp，注：bp①表示④堿基對）上，圖2表示pET32a質(zhì)粒及其上部

分限制酶切割位點(diǎn)。最后將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌后獲得成熟干擾素。

(1)利用雞白細(xì)胞總mRNA獲得干擾素蛋白基因，需要在酶的作用下先合

cDNA。圖1表示成熟干擾素蛋白序列及其前端的信號肽序列，信號肽是分泌蛋白合成過程

中開始合成的一段肽鏈，其在干擾素合成中的作用是。

(2)為了獲取不含信號肽序列的干擾素基因，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時需要用到的一對引物

是，為了將目的基因準(zhǔn)確連接到pET32a質(zhì)粒上需要在目的基因的兩端添

加限制酶的序列。PCR擴(kuò)增過程除了引物，還需要的條件有

（答出2點(diǎn)）。

(3)為了檢測目的基因是否插入pET32a質(zhì)粒，利用目的基因兩端添加的限制酶切割質(zhì)粒，然

后對產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖3，樣品最可能是插入了目的基因的重組質(zhì)粒，

判斷的理由是。

四、實(shí)驗(yàn)題

37．（2025·山東泰安·二模）研究人員從麻瘋樹油中篩選出能產(chǎn)生脂肪酶（LA）的兩種菌株。

菌株1產(chǎn)生的LA1酶可耐高溫，菌株2產(chǎn)生的LA2酶具有高催化效率，且LA1基因和LA2

基因具有93%的同源性。研究人員采用交錯延伸PCR技術(shù)獲得了重組LA基因，生產(chǎn)出了

更高效的酶。

(1)交錯延伸PCR技術(shù)具體流程如上圖（圖中僅顯示其中一條鏈延伸情況）。該技術(shù)采用LA1、

LA2均做模板，起始所需引物相同，引物作用是。已知過程①

起始引物片段均為25個核苷酸，TaqDNA聚合酶延伸速度為1200個堿基/min，本實(shí)驗(yàn)的循

環(huán)擴(kuò)增條件為：變性30s，復(fù)性15s，延伸15s，經(jīng)過80輪交錯循環(huán)后，可獲得PCR混合產(chǎn)

物。第二輪循環(huán)后所得重組型子鏈長度為個核苷酸。

(2)獲得的重組LA基因中，同時具有LA1和LA2基因序列的原因

是。

(3)過程②用到的PM質(zhì)粒中A為啟動子、B為氯霉素抗性基因cat、C為終止子、D為asd-

突變基因、E為復(fù)制原點(diǎn)，箭頭處指不同限制酶的識別位點(diǎn)。asd基因是編碼細(xì)菌細(xì)胞壁的

主要成分DAP合成途徑的關(guān)鍵酶，asd基因缺失時，將導(dǎo)致菌株生長對DAP依賴。為使目

的基因定向插入PM質(zhì)粒，交錯延伸PCR過程中引物的5′端需引入酶的識別序列。

為便于目的基因的檢測和鑒定，過程③中應(yīng)采用asd基因的受體菌。從含有PM質(zhì)粒、

重組PM質(zhì)粒的受體菌中將含有重組PM質(zhì)粒的受體菌篩選出來的思路

為。

38．（2025·山東菏澤·二模）抗菌肽以其快速殺菌活性、免疫調(diào)節(jié)特性和促進(jìn)傷口愈合的潛

力成為最有前景的抗菌藥物。研究發(fā)現(xiàn)將抗菌肽第52位的脯氨酸（密碼子為CCC）替換成

蘇氨酸（密碼子為ACG）可增強(qiáng)抗菌肽的殺菌活性。科研人員利用大引物PCR定點(diǎn)誘變技

術(shù)對抗菌肽基因進(jìn)行改造的過程如圖所示。請回答下列問題：

(1)若將抗菌肽第52位的脯氨酸換成蘇氨酸，則基因轉(zhuǎn)錄模板鏈對應(yīng)堿基的變化是，

據(jù)圖分析，寫出第51位氨基酸對應(yīng)的密碼子是。

(2)據(jù)圖分析，“大引物PCR定點(diǎn)誘變”技術(shù)中設(shè)計(jì)的“誘變引物”應(yīng)選擇________。

A．5'…ATAGCAGGC…3'B．5'…ATAACGGGC…3'

C．5'…GCCTGCTAT…3'D．5'GCCCGTTAT3'

(3)進(jìn)行大引物PCR定點(diǎn)誘變獲得改良的抗菌肽基因，需要進(jìn)行兩次PCR（PCR1和PCR2），

產(chǎn)物1最早出現(xiàn)在PCR1的第輪循環(huán)；PCR2的產(chǎn)物除改良的抗菌肽基因外，還

有；若考慮1個改良的抗菌肽基因通過PCR3快速擴(kuò)增，則第n次循環(huán)共