ICS65.020.30CCSB43NXSLX寧夏飼料工業(yè)協(xié)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/NXSLX0212—2025寧夏地方黃牛體外胚胎冷凍保存技術(shù)規(guī)范TechnicalSpecificationsfortheFreezingofInVitroEmbryosfromNingxiaLocalYellowCattle2025-11-7發(fā)布 2025-12-7實(shí)施寧夏飼料工業(yè)協(xié)會(huì)??發(fā)布T/NXSLX0212T/NXSLX0212—2025II前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由寧夏大學(xué)提出。本文件由寧夏飼料工業(yè)協(xié)會(huì)歸口。本文件起草單位：寧夏大學(xué)、銀川市畜牧技術(shù)推廣服務(wù)中心、固原富民農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司。本文件主要起草人：胡亞美、魏大為、張令鍇、蔡蓓、高亞偉、馬云、淡新剛、陶金忠、孫嘉欣、何學(xué)良、咸海龍、李文迪、田雨、陳慧慧、侯佳洋、魏康康、馬貴。T/NXSLX0212T/NXSLX0212—2025PAGEPAGE1寧夏地方黃牛體外胚胎冷凍保存技術(shù)規(guī)范范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了寧夏地方黃牛體外胚胎冷凍保存的基本要求、胚胎準(zhǔn)備與質(zhì)量鑒定、冷凍方法、胚胎的儲(chǔ)存、胚胎的解凍和檔案記錄的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于寧夏地方黃牛體外胚胎冷凍保存。規(guī)范性引用文件（且相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照GB/T35892標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行）。GB/T5458液氮生物容器GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T25881牛胚胎GB/T45202牛體外胚胎生產(chǎn)和移植技術(shù)規(guī)程術(shù)語和定義GB/T25881和GB/T45202界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件本文件。寧夏地方黃牛NingxiaLocalYellowCattle在寧夏回族自治區(qū)特定的大陸性氣候和粗放式飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下，經(jīng)過長(zhǎng)期自然和人工選擇形成的地方黃牛種質(zhì)資源。該品種具有良好的環(huán)境適應(yīng)性、抗病力和耐粗飼性能。其體型結(jié)構(gòu)緊湊，被毛多以黃色為主，屬于肉役兼用或地方特色肉用牛種?；疽笤O(shè)施設(shè)備體視顯微鏡、胚胎冷凍儀、液氮罐、0.25mL胚胎細(xì)管、細(xì)管塞、裝管器、酒精噴燈、恒溫水浴鍋、胚胎操作管/玻璃針、培養(yǎng)皿(35mm,90mm)、恒溫加熱臺(tái)、0.22μm針頭式濾器、記號(hào)筆、防護(hù)裝備（低溫手套、護(hù)目鏡）等。試劑化學(xué)試劑純度應(yīng)達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)或胚胎專用級(jí)。GB/T6682，2518.2MΩ·cm。A。胚胎準(zhǔn)備與質(zhì)量鑒定胚胎質(zhì)量鑒定GB/T25881AB胚胎預(yù)處理冷凍前，胚胎應(yīng)在適宜的培養(yǎng)液中于38.5℃、5%CO?的培養(yǎng)條件下穩(wěn)定至少1h。冷凍方法程序化慢速冷凍法胚胎洗滌基礎(chǔ)洗滌：將胚胎在保存液（A1），液滴中連續(xù)洗滌5-8次。每個(gè)液滴體200μL，100.25%A2，38.5℃2每次在液滴中停留30s-40s6.1.1a)的方法再洗滌3-5次，以徹底去除胰蛋白酶。冷凍保護(hù)劑平衡胚胎在以下溶液中應(yīng)按順序平衡：在含0.75mol/L乙二醇的平衡液中平衡 5min-10min。在含1mol/L乙二醇的冷凍液中平衡 5min-10min。在含1.5mol/L乙二醇的冷凍液中平衡 5min-10min。裝管與標(biāo)識(shí)0.25mL1（2cm）-冷凍液（2cm）-氣泡（0.5cm）-冷凍液（2cm）-氣泡（0.5cm）-含胚胎的冷凍液2.5cm）-氣泡（0.5cm）-冷凍液2cm）-氣泡0.5cm）-凍液（2cm）-細(xì)管塞。階段、胚胎質(zhì)量等級(jí)、冷凍日期。冷凍程序?qū)⑴咛ダ鋬鰞x預(yù)冷至 -6.0℃。將裝有胚胎的細(xì)管插入冷凍儀，平衡 5min。使用預(yù)冷的鑷子在細(xì)管液柱的遠(yuǎn)端（靠近細(xì)管塞一端） 進(jìn)行植冰d)植冰后，在-6.0℃下繼續(xù)平衡 5min-10min。以 0.3℃/min 的速率緩慢降溫至 -32℃。在-32℃下平衡 5min 后，迅速將細(xì)管投入液氮中儲(chǔ)存。玻璃化冷凍法將胚胎移入預(yù)平衡的玻璃化冷凍液1（見附錄A4.2）中，平衡 2min-3min。2（A4.2）30s/c)立即將裝載胚胎的冷凍載桿或細(xì)管投入液氮中。胚胎的儲(chǔ)存冷凍胚胎應(yīng)始終浸沒在液氮?dú)庀嗷蛞合嘀斜４?。GB/T5458冷凍胚胎細(xì)管/相對(duì)應(yīng)的信息，如供體號(hào)、細(xì)管編號(hào)范圍、冷凍日期等。注意事項(xiàng)液氮罐儲(chǔ)存區(qū)域應(yīng)保持通風(fēng)，防止缺氧。操作液氮時(shí)務(wù)必佩戴防護(hù)手套和護(hù)目鏡。胚胎的解凍程序化冷凍胚胎的解凍18℃-25℃5s-10s30s。用無菌吸水紙擦干細(xì)管外壁，移除細(xì)管塞。（5min-10min3-5移植槍中，盡快完成移植。玻璃化冷凍胚胎的解凍38.51（A.5）中，1min2（A.5）5min，2-33min-5min，以徹底去除冷凍保護(hù)劑。檔案記錄應(yīng)建立完整的胚胎冷凍與保存記錄檔案，記錄表格參見附錄B.1。所有記錄應(yīng)準(zhǔn)確、清晰、完整，并至少保存3年。附錄A試劑配制方法A.1胚胎保存液稱取磷酸鹽緩沖液（PBS）粉末一袋（或按說明書配制），溶于適量水中，定容至1L。添加10mL胎牛血清或0.4g0.22μm保存，有效期不超過2周。A.2濃度0.25%的胰蛋白酶液稱取0.25g胰蛋白酶粉末（活性1:250），溶解于100mLD-Hank's平衡鹽溶液中。使用碳酸氫鈉（NaHCO3）溶液將pH值調(diào)節(jié)至7.4-7.6。溶液用0.22μm濾膜過濾除菌，分裝成小份并于-20℃冷凍保存。解凍后應(yīng)在24小時(shí)內(nèi)使用，避免反復(fù)凍融。A.3D-Hank’s溶液D-Hank’s溶液的配方如下：成分含量(g/L)氯化鉀（KCL）0.400磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.060氯化鈉（NaCL）8.000碳酸氫鈉（NaHCO3）0.350十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）0.132D-葡萄糖1.000酚紅（0.1%溶液）1.000mL配制方法：將上述各組分（除酚紅外）溶解于約800mL三級(jí)水（見GB/T6682）中，加入酚紅溶液，混勻后定容到1L。在121℃、0.105MPa條件下高壓蒸汽滅菌15min，于4℃保存。A.4胚胎玻璃化冷凍液玻璃化冷凍液1（平衡液）配方：以含HEPES的TCM-199為基礎(chǔ)液，包含：7.5%乙二醇、7.5%二甲基亞砜（DMSO）、。配制方法：取70mLTCM-199基礎(chǔ)液，依次加入7.5mL乙二醇和7.5mLDMSO，振蕩溶解，添加基礎(chǔ)液定量至100ml。使用0.22μm濾膜過濾。溶液應(yīng)4℃避光保存，有效期不超過6個(gè)月。玻璃化冷凍液2（玻璃化液）配方：以含HEPES的TCM-199為基礎(chǔ)液，包含：16.5%乙二醇、16.5%DMSO、0.5mol/L蔗糖。配制方法：取50mLTCM-199基礎(chǔ)液，依次加入16.5mL乙二醇、16.5mLDMSO和17.115g蔗糖，振蕩溶解，添加基礎(chǔ)液定量至100ml。使用0.22μm濾膜過濾。溶液應(yīng)4℃避光保存，有效期不超過6個(gè)月。5玻璃化解凍液配方：為含1.0mol/L蔗糖的TCM-199溶液。配制方法：稱取34.2g蔗糖，溶解于100mL含HEPES的TCM-199中，混勻。使用0.22μm濾膜過濾除菌，于4℃避光保存，有效期不超過4周。玻璃化解凍液2配方：為含0.5mol/L蔗糖的TCM-199溶液。配制方法：稱取17.1g蔗糖，溶解于100mL含HEPES