ICS65.020.01

CCSB05

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T2801—2022

F?Owen型甜菜細(xì)胞質(zhì)類型快速鑒定技術(shù)

規(guī)程

Technicalcodeofpracticeforrapididentificationofcytoplasmic

typesofF?Owentypesugarbeet

2022-08-30發(fā)布2022-09-30實施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T2801—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧廳提出。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（SAM/TC20）歸口。

本文件起草單位：內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院。

本文件主要起草人：王良、張自強(qiáng)、付增娟、張輝、韓平安、鄂圓圓、趙尚敏、張必周、白晨、李

曉東、張惠忠、鄭文哲、吳新榮、梁亞暉、常悅、唐寬剛、孫瑞芬、張立華、喬慧蕾。

I

DB15/T2801—2022

F·Owen型甜菜細(xì)胞質(zhì)類型快速鑒定技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了F·Owen型甜菜細(xì)胞質(zhì)類型快速鑒定技術(shù)的儀器、試劑及引物、樣品制備、樣品檢測、

細(xì)胞質(zhì)基因型鑒定、結(jié)果分析。

本文件適用于F·Owen型甜菜細(xì)胞質(zhì)類型快速鑒定。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

F·Owen型甜菜F·Owensugarbeet

是由F·Owen于1945年發(fā)現(xiàn)的核質(zhì)互作雄性不育型甜菜。

O型系maintainerline

即為保持系，是指作為父本與不育系雜交時，能使F1代保持雄性不育性的甜菜品系。

4材料、儀器及試劑

儀器

本規(guī)程用到的儀器：移液器、臺式高速離心機(jī)、陶瓷研缽、紫外分光光度計、電泳儀、凝膠成像系

統(tǒng)、PCR儀。

試劑

4.2.150mmol/LEDTApH8.0(1L:800mlH2O中加186.1gEDTANa2·2H2O,用NaOH調(diào)pH至8.0，

定容至1L，滅菌)。

4.2.250×TAE緩沖液(1L：500mlH2O中加242gTris，溶解后加100mll0.5mol/LEDTApH

8.0和57.1ml冰乙酸，定容)。

TR1引物的序列

1

DB15/T2801—2022

TR1:5'-AGAACTTCGATAGGCGAGAGG-3'

5'-GCAATTTTCAGGGCATGAACC-3'

5樣品制備

材料選取

選取擬鑒定甜菜生長期的新鮮幼嫩葉片，單株裝入塑封袋，放入有冰袋的低溫取樣盒中。

樣品處理

將樣品洗凈擦干，稱取0.5g，放入研缽，倒入液氮，迅速將樣品研成粉末，裝入1.5ml離心管中，

并快速加入裂解液。

DNA提取

按所選取植物全基因組DNA提取試劑盒的說明進(jìn)行DNA提取。

6樣品檢測

DNA含量和質(zhì)量檢測

取15μLDNA樣品稀釋20倍，利用紫外分光光度計測定OD260/OD280，檢測DNA的含量及質(zhì)量。純DNA：

OD260/OD280≈1.8（大于1.9，表明有RNA污染；小于1.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染）。對于純的樣品，只

要讀出260nm的A值即可算出含量。通常以A值為1相當(dāng)于50μg/ml雙螺旋DNA。

DNA電泳檢測

取5μLDNA樣品，使用1%瓊脂糖凝膠在1×TAE電泳緩沖液中電泳，電泳電壓120V，電泳時長25min～

35min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察DNA質(zhì)量。

7甜菜細(xì)胞質(zhì)基因型鑒定

PCR體系

用ddH2O將DNA樣品稀釋到40ng～50ng，反應(yīng)體系25μL，其中DNA模板1μL、上下游TR1引物各1

μL、MIX12.5μL、ddH2O9.5μL。

PCR程序

94℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72℃進(jìn)一

步延伸10min，4℃+∞；4℃保存。

陽性對照設(shè)置

進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)類型鑒定時，使用O型和CMS型純系甜菜DNA模板作為陽性對照。

電泳檢驗

2

DB15/T2801—2022

取PCR產(chǎn)物5μL，使用1%瓊脂糖凝膠在1×TAE電泳緩沖液中電泳，電泳電壓120V，電泳時長30min。

用凝膠成像系統(tǒng)紫外光下檢測電泳結(jié)果。

8結(jié)果分析

結(jié)果分析見圖1所示是對部分材料進(jìn)行PCR電泳檢測部分結(jié)果，泳道M為DL2000Marker,泳道1、3、

4、5、6條帶位置在750bp，細(xì)胞質(zhì)類型為N型，為具有保持能力O型材料；2、7、8、9、10、11、12條

帶位置在500bp，細(xì)胞質(zhì)類型為S型，為CMS型材料，泳道1、2是一對標(biāo)準(zhǔn)的不育系及其保持系材料，做

為對照組。

圖1部分材料