檢驗(yàn)科急性白血病血液學(xué)檢驗(yàn)規(guī)范演講人：日期:目錄CONTENTS1臨床需求對(duì)接2標(biāo)本采集與處理3形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)流程4免疫表型分析5遺傳學(xué)檢驗(yàn)規(guī)范6檢驗(yàn)報(bào)告整合臨床需求對(duì)接01PART標(biāo)本接收標(biāo)準(zhǔn)確認(rèn)接收時(shí)需檢查標(biāo)本容器密封性、標(biāo)簽信息完整性（包括患者姓名、ID號(hào)、檢測(cè)項(xiàng)目），確保無(wú)滲漏或污染。溶血、凝血或量不足的標(biāo)本需拒收并記錄原因。標(biāo)本完整性核查根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目要求確認(rèn)標(biāo)本抗凝劑類(lèi)型（如EDTA、肝素或枸櫞酸鈉），避免因抗凝劑錯(cuò)誤導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)或凝血功能檢測(cè)偏差。抗凝劑類(lèi)型驗(yàn)證評(píng)估標(biāo)本從采集到送達(dá)實(shí)驗(yàn)室的時(shí)間，確保骨髓或外周血標(biāo)本在有效期內(nèi)（如骨髓涂片需在2小時(shí)內(nèi)處理），超時(shí)標(biāo)本需與臨床溝通后決定是否檢測(cè)。運(yùn)輸時(shí)效性評(píng)估緊急檢測(cè)項(xiàng)目骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、染色體核型分析等可適當(dāng)延后，但需在24小時(shí)內(nèi)完成標(biāo)本預(yù)處理并啟動(dòng)檢測(cè)流程。常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目科研或特殊項(xiàng)目如基因測(cè)序、微小殘留?。∕RD）監(jiān)測(cè)需與臨床協(xié)商后安排，避免擠占急診檢測(cè)資源。優(yōu)先處理可能影響臨床決策的項(xiàng)目，如血常規(guī)、外周血涂片、流式細(xì)胞術(shù)免疫分型，確保1小時(shí)內(nèi)出具初步報(bào)告。檢測(cè)項(xiàng)目?jī)?yōu)先級(jí)劃分危急值報(bào)告流程危急值判定標(biāo)準(zhǔn)明確急性白血病相關(guān)危急值范圍（如白細(xì)胞計(jì)數(shù)＞100×10?/L或血小板＜20×10?/L），實(shí)驗(yàn)室需定期與血液科共同修訂標(biāo)準(zhǔn)。檢測(cè)到危急值時(shí)，除系統(tǒng)自動(dòng)報(bào)警外，需通過(guò)電話、短信同步通知主治醫(yī)師及護(hù)理站，并記錄接聽(tīng)人姓名及反饋內(nèi)容。危急值報(bào)告后需留存標(biāo)本復(fù)檢，并在報(bào)告中備注復(fù)核結(jié)果。每月匯總分析危急值案例，優(yōu)化檢測(cè)流程以減少假陽(yáng)性率。多通道報(bào)告機(jī)制復(fù)核與追溯標(biāo)本采集與處理02PARTEDTA-K2是外周血和骨髓標(biāo)本的首選抗凝劑，其濃度為1.5-2.2mg/mL血液，可有效防止血小板聚集和凝血酶生成，確保細(xì)胞形態(tài)完整性。EDTA抗凝劑優(yōu)先使用肝素鈉適用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，用量為15-20IU/mL血液，但需注意其可能引起白細(xì)胞聚集干擾顯微鏡檢查。肝素抗凝的適用場(chǎng)景凝血功能檢測(cè)需使用3.2%枸櫞酸鈉，血液與抗凝劑比例為9:1，該抗凝劑可螯合鈣離子阻斷凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。枸櫞酸鈉的特殊應(yīng)用抗凝劑選擇與用量室溫運(yùn)輸?shù)臅r(shí)限要求骨髓標(biāo)本嚴(yán)禁冷藏運(yùn)輸，低溫會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂和染色質(zhì)異常聚集，影響FISH檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。低溫運(yùn)輸?shù)慕商厥鈾z測(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)范分子生物學(xué)檢測(cè)樣本需置于RNA保護(hù)劑中，運(yùn)輸過(guò)程保持4℃恒溫，避免核酸降解影響基因突變分析。未染色血涂片應(yīng)在采集后1小時(shí)內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，EDTA抗凝血在25℃環(huán)境下穩(wěn)定4-6小時(shí)，超過(guò)時(shí)限會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)效控制離心條件標(biāo)準(zhǔn)化常規(guī)離心的參數(shù)設(shè)置血常規(guī)檢測(cè)需300g離心10分鐘，離心力不足會(huì)導(dǎo)致血漿層混濁，過(guò)高則可能破壞粒細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。凝血檢測(cè)樣本需1500g離心15分鐘，確保血小板殘留量<10×10^9/L，避免影響凝血酶原時(shí)間測(cè)定。淋巴細(xì)胞分離需使用Ficoll密度梯度離心，400g離心30分鐘，界面層白細(xì)胞回收率應(yīng)達(dá)85%以上。血漿分離的優(yōu)化條件梯度離心的特殊要求形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)流程03PART血涂片制備規(guī)范樣本采集與處理采用EDTA抗凝靜脈血，采集后需在2小時(shí)內(nèi)完成涂片制備，避免血液凝固或細(xì)胞形態(tài)變化影響檢驗(yàn)結(jié)果。干燥與固定涂片需自然干燥，避免加熱或吹風(fēng)導(dǎo)致細(xì)胞變形，干燥后立即用甲醇固定，防止后續(xù)染色過(guò)程中細(xì)胞脫落或溶解。涂片厚度控制質(zhì)量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)推片角度應(yīng)保持在30-45度，勻速推動(dòng)以形成頭體尾分明的血膜，確保細(xì)胞分布均勻且無(wú)鋸齒邊緣。合格涂片應(yīng)滿足血膜長(zhǎng)度占玻片2/3以上，尾部呈羽毛狀，且顯微鏡下紅細(xì)胞均勻分散無(wú)重疊。染液配制與保存沖洗與干燥瑞氏染液與吉姆薩染液按比例混合，pH值調(diào)至6.8-7.2，避光保存于棕色瓶中，使用前需過(guò)濾去除沉淀物。流水輕柔沖洗玻片背面，避免直接沖刷血膜，垂直晾干后鏡檢，確保染色背景清澈、細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰可辨。染色步驟標(biāo)準(zhǔn)化染色異常處理先滴加染液覆蓋血膜，靜置后緩沖液沖洗，染色時(shí)間嚴(yán)格控制在15-20分鐘，避免過(guò)染或欠染影響細(xì)胞核質(zhì)對(duì)比度。若出現(xiàn)染色偏藍(lán)或偏紅，需檢查染液pH值、緩沖液比例及染色時(shí)間，必要時(shí)重新配制染液。瑞氏-吉姆薩染色操作形態(tài)學(xué)特征原始細(xì)胞體積較大，核質(zhì)比例高，核染色質(zhì)細(xì)膩呈網(wǎng)狀，核仁明顯且多為2-5個(gè)，胞漿嗜堿性且無(wú)顆粒。分類(lèi)鑒別要點(diǎn)需與成熟淋巴細(xì)胞、早幼粒細(xì)胞等區(qū)分，重點(diǎn)關(guān)注核仁數(shù)量、胞漿量及是否存在Auer小體等特異性標(biāo)志。異常形態(tài)提示若原始細(xì)胞出現(xiàn)多形性核、胞漿空泡或偽足，可能提示特殊亞型白血病，需結(jié)合免疫分型進(jìn)一步確認(rèn)。計(jì)數(shù)與報(bào)告規(guī)范原始細(xì)胞比例需通過(guò)200個(gè)有核細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)，報(bào)告中需注明形態(tài)特點(diǎn)及占比，為臨床分型提供依據(jù)。原始細(xì)胞識(shí)別要點(diǎn)免疫表型分析04PART抗體組合方案設(shè)計(jì)根據(jù)白血病亞型特征選擇CD45、CD34、CD19等核心抗體，結(jié)合CD13、CD33等髓系標(biāo)志物，確保覆蓋B/T/髓系白血病鑒別需求。多參數(shù)組合策略?xún)?yōu)先選用高特異性單克隆抗體，避免光譜重疊，優(yōu)化PE、FITC、APC等熒光染料組合以提高信號(hào)分辨率。新組合需通過(guò)已知陽(yáng)性/陰性樣本驗(yàn)證，確保敏感性和特異性均達(dá)到診斷標(biāo)準(zhǔn)。克隆選擇與熒光搭配在抗體面板中納入CD45/CD14作為粒細(xì)胞和單核細(xì)胞內(nèi)參，確保細(xì)胞群設(shè)門(mén)準(zhǔn)確性。內(nèi)對(duì)照設(shè)置01020403臨床驗(yàn)證流程流式細(xì)胞術(shù)操作要點(diǎn)采用EDTA抗凝外周血或骨髓標(biāo)本，2小時(shí)內(nèi)完成裂紅處理，避免細(xì)胞碎片干擾。樣本前處理規(guī)范設(shè)定閾值排除死細(xì)胞和碎片，采集至少10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞事件，重點(diǎn)關(guān)注CD45低表達(dá)細(xì)胞群。數(shù)據(jù)采集參數(shù)每日?qǐng)?zhí)行CS&T質(zhì)控，調(diào)節(jié)PMT電壓使微球信號(hào)處于預(yù)設(shè)通道，確保熒光強(qiáng)度線性范圍。儀器校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)010302使用單陽(yáng)對(duì)照樣本調(diào)整熒光補(bǔ)償，消除多色檢測(cè)中的信號(hào)串?dāng)_現(xiàn)象。補(bǔ)償矩陣優(yōu)化04異常表達(dá)解讀標(biāo)準(zhǔn)跨系表達(dá)判定髓系白血病中CD7/CD19表達(dá)超過(guò)20%定義為異常，需結(jié)合其他標(biāo)志物排除混合表型白血病。抗原強(qiáng)度分級(jí)根據(jù)MFI值將CD34表達(dá)分為陰性/弱/強(qiáng)三級(jí)，強(qiáng)陽(yáng)性提示原始細(xì)胞增殖活躍?？寺⌒栽u(píng)估標(biāo)準(zhǔn)B-ALL中κ/λ輕鏈限制性表達(dá)（比值>10:1）或T細(xì)胞受體Vβ家族單克隆性為惡性證據(jù)。殘留病灶閾值治療后CD34+CD19+CD10+細(xì)胞占比≥0.01%時(shí)需警惕微小殘留病風(fēng)險(xiǎn)。遺傳學(xué)檢驗(yàn)規(guī)范05PART染色體核型分析流程核型分析與報(bào)告通過(guò)顯微鏡或全自動(dòng)掃描系統(tǒng)分析20個(gè)以上中期分裂相，按ISCN標(biāo)準(zhǔn)描述異常核型（如t(9;22)、+8等），并注明克隆性比例。細(xì)胞培養(yǎng)與制片樣本在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)，秋水仙素阻滯中期分裂相，低滲處理固定后滴片，吉姆薩染色顯帶（G顯帶技術(shù)）。樣本采集與處理需采集骨髓或外周血樣本，使用肝素抗凝，24小時(shí)內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，同步加入植物血凝素（PHA）刺激淋巴細(xì)胞增殖。預(yù)后分層指導(dǎo)檢測(cè)TP53缺失、IKZF1缺失等分子異常，為危險(xiǎn)度分層（如ALL的Ph-like亞型）提供依據(jù)。微小殘留?。∕RD）監(jiān)測(cè)針對(duì)BCR-ABL1、PML-RARA等融合基因，用于治療后殘留白血病細(xì)胞的定量檢測(cè)，靈敏度達(dá)10??~10??。復(fù)雜核型輔助診斷當(dāng)常規(guī)核型分析難以識(shí)別隱匿易位（如MLL重排）或標(biāo)記染色體時(shí)，需結(jié)合探針（如雙色分離探針）明確異常。FISH檢測(cè)適應(yīng)證覆蓋常見(jiàn)白血病相關(guān)融合轉(zhuǎn)錄本（如RUNX1-RUNX1T1、CBFB-MYH11），采用RT-PCR或二代測(cè)序（NGS）技術(shù)，檢測(cè)下限需≤1%。分子標(biāo)志物檢測(cè)范圍融合基因篩查包括FLT3-ITD/TKD、NPM1、CEBPA等預(yù)后相關(guān)突變，以及IDH1/2、DNMT3A等表觀遺傳修飾基因，指導(dǎo)靶向治療選擇。基因突變譜分析通過(guò)動(dòng)態(tài)檢測(cè)ASXL1、SF3B1等繼發(fā)突變，評(píng)估疾病進(jìn)展或轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)（如MDS向AML轉(zhuǎn)化）?？寺⊙莼O(jiān)測(cè)檢驗(yàn)報(bào)告整合06PART流式細(xì)胞術(shù)與形態(tài)學(xué)結(jié)果交叉驗(yàn)證通過(guò)免疫表型分析與細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征比對(duì)，確保幼稚細(xì)胞群體的一致性，若差異超過(guò)閾值需啟動(dòng)復(fù)檢流程。分子生物學(xué)與細(xì)胞遺傳學(xué)數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)性分析檢測(cè)融合基因、突變譜與染色體核型結(jié)果的邏輯關(guān)聯(lián)，排除技術(shù)假陽(yáng)性或假陰性干擾。自動(dòng)化血常規(guī)與人工鏡檢的復(fù)核標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)儀器提示異常細(xì)胞或參數(shù)超標(biāo)時(shí)，必須通過(guò)人工涂片復(fù)檢確認(rèn)，并記錄復(fù)核偏差值。多平臺(tái)結(jié)果比對(duì)規(guī)則以免疫表型為主確定細(xì)胞系列（如B/T/髓系），形態(tài)學(xué)輔助確認(rèn)分化階段（如原始/早幼粒細(xì)胞）。形態(tài)學(xué)（M）與免疫分型（I）的權(quán)重分配將特定染色體易位（如t(9;22)）與分子突變（如FLT3-ITD）納入危險(xiǎn)度分層模型，指導(dǎo)臨床治療策略。細(xì)胞遺傳學(xué)（C）對(duì)預(yù)后的分層作用通過(guò)NGS檢測(cè)基因突變負(fù)荷，完善低危組中隱匿性高危因素的識(shí)別，避免分型遺漏。分子生物學(xué)（M）的精細(xì)化補(bǔ)充