McAb在免疫導(dǎo)向療法中存在困難（障礙）：

A、McAb均是鼠源性抗體，應(yīng)用于人體內(nèi)可產(chǎn)生人抗鼠抗體（HAMA），加速了排斥反應(yīng)，在人體內(nèi)半衰期只有5~6h，難以維持有效藥品作用靶組織時(shí)間；

B、完整抗體分子相對(duì)分子質(zhì)量過大，難以穿透實(shí)體腫瘤組織，達(dá)不到有效治療濃度。處理問題方法或路徑—基因工程技術(shù)

A、降低McAb免疫源性；

B、降低McAb相對(duì)分子質(zhì)量。第1頁5、1984年報(bào)道了人—鼠嵌合抗體，之后制備出了改型抗體、單鏈抗體、單域抗體、最小識(shí)別單位等各種類型，基本上消除了抗體鼠源性（免疫源性），相對(duì)分子質(zhì)量只有完整抗體分子1/80~1/3。

6、1994年Winter創(chuàng)建了噬菌體抗體庫技術(shù),以基因工程方法制備抗體并發(fā)展成抗體工程。它是抗體研究領(lǐng)域一次技術(shù)革命，它不用人工免疫動(dòng)物和細(xì)胞融合技術(shù)，完全用基因工程技術(shù)制備人源性抗體。第2頁第二節(jié)單克隆抗體及其改造（MonoclonalAntibody）一、制備單克隆抗體普通流程

McAb是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與含有無限增殖能力骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生。因?yàn)檫@種抗體是針對(duì)一個(gè)抗原決定簇抗體，又是單一B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生，故稱為單克隆抗體。第3頁第4頁第5頁

1、抗原與動(dòng)物免疫免疫方法：體內(nèi)免疫和體外免疫抗原：顆粒性抗原和可溶性抗原免疫動(dòng)物：BALB/c小鼠和Lou大鼠

2、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞選擇培養(yǎng)

基本方法：取適量脾細(xì)胞（1×108）與骨髓瘤細(xì)胞（2×107~3×107）進(jìn)行混合，在PEG作用下誘導(dǎo)它們?nèi)诤?，時(shí)間控制在2min以內(nèi)，然后用培養(yǎng)液將PEG融合液遲緩稀釋。第6頁第7頁

用于細(xì)胞融合骨髓瘤細(xì)胞條件：1、融和率高2、本身不分泌抗體3、所產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞分泌抗體能力強(qiáng)且長久穩(wěn)定。第8頁P(yáng)EG相對(duì)分子質(zhì)量和濃度越大，其促融和率越高。但其黏度和對(duì)細(xì)胞毒性也隨之增大。慣用濃度為40%~50%，相對(duì)分子質(zhì)量4000為佳。相對(duì)分子質(zhì)量在400~6000，濃度在10%~60%范圍內(nèi)PEG都能使細(xì)胞發(fā)生融合。

為了提升融合率，在PEG溶液中加入DMSO（二甲基亞砜），以提升細(xì)胞接觸緊密性，增加融合率。但必須嚴(yán)格限制接觸時(shí)間。（1）細(xì)胞融合液中細(xì)胞類型：4或5種。（2）怎樣去除脾-瘤融和細(xì)胞以外細(xì)胞？慣用選擇性培養(yǎng)基第9頁第10頁

細(xì)胞融合后，可產(chǎn)生各種融合細(xì)胞，如脾—脾、脾—瘤、瘤—瘤融合細(xì)胞，而且還有許多未融合骨髓瘤細(xì)胞。這些細(xì)胞比脾—瘤融合雜交瘤細(xì)胞增殖更加快，并能將其淘汰。為此，可再將融合后細(xì)胞馬上移入選擇性培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。慣用選擇培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基，它是用次黃嘌吟(H)、氨基喋吟(A)和胸腺嘧啶配制。其中氨基喋吟(A)能阻斷DNA合成主要路徑，瘤—瘤融合細(xì)胞和瘤細(xì)胞因不能合成DNA而死亡。脾—脾融合細(xì)胞和瘤細(xì)胞在這么組織培養(yǎng)條件下，幾天內(nèi)亦快速死亡。因?yàn)楣撬枇黾?xì)胞都是次黃嘌吟鳥嘌吟磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)缺乏株，脾細(xì)胞內(nèi)卻有這種酶，所以脾—瘤融合雜交瘤細(xì)胞可利用HGPRT酶，用次黃嘌吟(H)和胸腺嘧啶合成DNA，使雜交瘤細(xì)胞得以生長。第11頁

在最適培養(yǎng)條件下．大約有105個(gè)脾細(xì)胞才能形成一個(gè)雜交瘤細(xì)胞，大量瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)液中相繼死亡，單個(gè)或少數(shù)雜交瘤細(xì)胞多半不易存活。

在體外細(xì)胞培養(yǎng)中，單個(gè)或數(shù)量極少細(xì)胞不易生存與繁殖，必須加入其它活細(xì)胞才能使其生長繁殖，加入細(xì)胞稱之為喂養(yǎng)細(xì)胞。所以通常要加入喂養(yǎng)細(xì)胞才能使其繁殖。慣用喂養(yǎng)細(xì)胞有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞等。普通認(rèn)為喂養(yǎng)細(xì)胞能釋放一些生長刺激因子，并能滿足雜交瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度依賴性。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞還能去除死亡細(xì)胞，故應(yīng)用較多。第12頁3、篩選陽性克隆與克隆化慣用檢測方法：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)慣用克隆化方法：有限稀釋法和軟瓊脂法。有限稀釋法：把雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋后，加入到96孔板，使每孔中在理論上只含有一個(gè)細(xì)胞。第一次克隆化時(shí)也要應(yīng)用HT培養(yǎng)液，以后克隆化可用不含HTRPMI1640培養(yǎng)液。軟瓊脂法：在培養(yǎng)液中加入0.5%瓊脂糖凝膠，細(xì)胞分裂后形成小球樣團(tuán)塊，因?yàn)榕囵B(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用吸管吸出，移入96孔板培養(yǎng)。

第13頁

篩選陽性克隆與克隆化

因?yàn)榭贵w產(chǎn)生細(xì)胞只占全部脾細(xì)胞5％左右，所以要進(jìn)行每孔培養(yǎng)上清抗體活性篩選工作，以選擇出陽性克隆，然后進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。并檢測大批標(biāo)本。免疫酶技術(shù)因不需進(jìn)行放射性核素操作，方法簡便，又適于檢測大批標(biāo)本等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛采取。經(jīng)過引入生物素—親和素等放大系統(tǒng)可深入提升靈敏性。普通說來免疫酶技術(shù)和放射免疫技術(shù)均適合用于可溶性抗原及顆粒性抗原抗體檢測。免疫熒光技術(shù)適合用于細(xì)胞抗原抗體檢測，尤其是制備以檢測患者活檢組織標(biāo)本為目標(biāo)抗體時(shí)，免疫熒光法則更有意義，在篩選抗體同時(shí)，還能對(duì)所識(shí)別抗原進(jìn)行定位判定。下面以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)篩選抗破傷風(fēng)毒素抗體為例進(jìn)行說明。

第14頁第15頁4、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀判定—染色體分析

正常鼠脾細(xì)胞染色體數(shù)：40，全部為端著絲粒。小鼠骨髓瘤細(xì)胞染色體：SP2/0細(xì)胞為62~68，NS-1為54~64，有中部和亞中部著絲點(diǎn)。

雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目：靠近兩親本細(xì)胞染色體數(shù)目標(biāo)總和，在結(jié)構(gòu)上多數(shù)為端著絲粒染色體外，還應(yīng)出現(xiàn)少數(shù)標(biāo)志染色體。

染色體數(shù)目多且較集中雜交瘤細(xì)胞分泌高效價(jià)抗體；反之，則反。第16頁5、單克隆抗體大量制備（1）體外培養(yǎng)法：用于抗原免疫性極弱取得抗體較少。多采取RPMI1640培養(yǎng)液，添加10%--20%胎?；蛐∨Ｑ?。但因?yàn)榕囵B(yǎng)液中含有血清成份，總蛋白量可達(dá)100μg/ml以上，給純化帶來困難。加入小牛血清又是發(fā)生支原體污染原因，而且批間質(zhì)量差異太大，直接影響雜交瘤細(xì)胞生長。改良方法有：無血清培養(yǎng)法、懸浮培養(yǎng)法、微載體懸浮培養(yǎng)法。無血清培養(yǎng)法：利用白蛋白、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法雖可降低污染，但產(chǎn)量不高。懸浮培養(yǎng)法：連續(xù)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞密度可達(dá)2×107/ml,搜集單克隆抗體可達(dá)400μg/ml。如在培養(yǎng)液中加入微載體，細(xì)胞密度可達(dá)108/ml。第17頁（2）動(dòng)物體內(nèi)誘生法：用于抗原免疫性較強(qiáng)。慣用基本程序：接種前1~2周，小鼠腹腔注射0.5mlPristane（降植烷）或用液體石蠟，然后注射1*106雜交瘤細(xì)胞，7~12d便有腹水生成，待生成腹水后再提取，離心去細(xì)胞沉淀，取上清液凍存。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，比較經(jīng)濟(jì)，所得單克隆抗體量多且效價(jià)高，還可有效地保留雜交瘤細(xì)胞株和分離已污染雜菌雜交瘤細(xì)胞株。缺點(diǎn)：小鼠腹水中混有來自小鼠各種雜蛋白，給純化帶來難度。第18頁6、單克隆抗體純化依據(jù)Ig類和亞類以及用途選擇不一樣純化方法。

體外診療試劑IgG類沉淀處理+親和層析

IgM類沉淀處理+凝膠過濾體內(nèi)診療試劑或治療用藥親和層析+陰離子交換層析，并注意除去毒素、病毒、核酸等微量污染物。

第19頁動(dòng)物體內(nèi)誘生法制備McAb純化普通程序：

（1）澄清和沉淀處理：a.1000g離心5min，去除沉淀物（紅細(xì)胞、細(xì)胞碎塊、纖維蛋白凝塊和脂質(zhì)）b.20000g高速離心30min,去除殘留小顆粒物質(zhì)c.用0.2μm微孔濾膜過濾，去除細(xì)菌、支原體d.飽和硫酸銨沉淀抗體（50%飽和硫酸銨能回收90%以上抗體）。

第20頁（2）分離

A、凝膠過濾：用于IgG和IgM類。慣用SephadexG200作為分離介質(zhì)，可搜集到3個(gè)峰，最高峰為IgM，另外兩個(gè)峰為IgG?？贵w回收率達(dá)50~80%，能去除污染微量雜蛋白，抗體純度可達(dá)95%以上。

B、陰離子交換層析：用于IgG類分離純化。在pH7.4條件下，IgG1和IgG2能結(jié)合在DEAE填料上，其中IgG2a可在較低離子強(qiáng)度下洗脫下來，其純度很高。IgG2b和IgG3在低離子強(qiáng)度下易發(fā)生沉淀，可增加離子強(qiáng)度以提升產(chǎn)量，但其純度相對(duì)較低。

C、親和層析：多用蛋白A親和層析。適合用于IgG類。IgG類與蛋白A結(jié)合與pH有親密關(guān)系。鼠源性單抗在pH8.0時(shí)，IgG2b、IgG3幾乎全部結(jié)合在蛋白A柱上，IgG1稍差，用pH3.5緩沖液可洗脫下IgG2b，pH4.0緩沖液可洗脫下IgG3，pH4.5緩沖液可洗脫下IgG2a，pH6.0可洗脫下IgG1。用蛋白A親和層析收獲抗體純度和很高，但也有極微量雜蛋白。第21頁二、鼠源性單克隆抗體改造

目標(biāo)：一是降低免疫源性；

二是降低相對(duì)分子量，增加組織通透性。

原理：抗體同抗原結(jié)合功效決定于抗體分子可變區(qū)（V），生物功效則決定于抗體分子穩(wěn)定區(qū)（C）。

第22頁第23頁第24頁第25頁第26頁鼠源性單克隆抗體改造

1、人—鼠嵌合抗體（chimericantibody）：把鼠源性單克隆抗體V區(qū)基因分離出來，分別與人IgC區(qū)基因連接，即成為人—鼠嵌合抗體基因，再共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞，就能表示出完整ChimericAntibody.2、改型抗體(Reshapingantibody)：用鼠源性單克隆抗體CDR序列替換人Ig分子中CDR序列，則可使人Ig分子含有鼠源性單克隆抗體抗原結(jié)合特異性?？贵w分子中鼠源部分只占很小百分比，可基本消除免疫源性。這種改型抗體也稱CDR移植抗體(CDRgraftingantibody)。

3、小分子抗體：小分子抗體僅表示鼠源性單克隆抗體V區(qū)片段，其相對(duì)分子質(zhì)量僅為原抗體1/80~1/3。

(1)Fab片段抗體：VH+CH1(3)單鏈抗體：VH-Linker-VL(2)FV抗體：VH+VL(4)單域抗體：VH或VL（5）最小識(shí)別單位（MRU）：單個(gè)CDR區(qū)組成

第27頁

4、雙功效抗體：雙特異性抗體(bispecificantibody,BsAb)。是一個(gè)非天然性抗體，其結(jié)合抗原兩個(gè)臂含有不一樣特異性。

5、抗體融合蛋白：從廣義講應(yīng)屬于雙功效抗體范圍。是20世紀(jì)90年代發(fā)展研究領(lǐng)域。類型以下：（1）配基—配基型融合蛋白，如CD4-Fcγ.

（2）配基—Ig型嵌合抗體，如IL-2-Ig

（3）配基—FV型嵌合蛋白，如CD4-FVCD3(4)受體—FV型融合蛋白（5）酶—抗體型融合蛋白（abeneyme,抗體酶）第28頁第三節(jié)抗體工程抗體研究三個(gè)階段：①以1890年Behring發(fā)覺白喉抗毒素為代表，其特點(diǎn)是用抗原免疫動(dòng)物來取得多克隆抗體；②以1975年K?hler創(chuàng)建雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體為代表；③以1994年Winter完全用基因工程技術(shù)制備人源性抗體，而且還能經(jīng)過細(xì)菌發(fā)酵或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物大規(guī)模生產(chǎn)抗體。在此基礎(chǔ)上發(fā)展成抗體工程。他創(chuàng)建了噬菌體抗體庫技術(shù),克服了人體不能隨意免疫缺點(diǎn)，用人外周血制備抗體文庫，從而取得人源性基因工程抗體。第29頁

一、噬菌體抗體庫技術(shù)基本方法

1、獲取目標(biāo)基因

2、抗體庫技術(shù)載體：

3、淘篩（panning）：

4、表示與判定：。第30頁

1．獲取目標(biāo)基因提取RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR(RT—PCR)獲取抗體某一特定基因區(qū)段，如重鏈和輕鏈可變區(qū)(VH、VL)基因。抗體基因組合形式多為單鏈抗體SCFV，也用連接鏈(G4S)3組合成功效分子。第31頁

2．抗體庫技術(shù)載體現(xiàn)在普遍使用噬菌粒載體，它含有噬菌體和質(zhì)粒共同特點(diǎn)。因?yàn)樗D(zhuǎn)化效率高有利于提升文庫容量?？贵w蛋白和噬菌體外殼蛋白以融合蛋白形式表示在載體表面，再感染后，能使目標(biāo)克隆得以擴(kuò)增。琥珀終止碼在適當(dāng)位置上引人載體是抗體庫關(guān)鍵性技術(shù)。而克隆位點(diǎn)后基因序列則有利于對(duì)可溶性表示產(chǎn)物判定和純化。第32頁

3．淘篩基本過程是，抗原固相化后，對(duì)噬菌粒群吸附、洗滌和洗脫后再感染擴(kuò)增，與輔助噬菌體超感染取得大容量次級(jí)文庫，再重復(fù)與抗原吸附……，經(jīng)幾輪淘篩后，淘汰了非目標(biāo)克隆，且使目標(biāo)克隆大量地?cái)U(kuò)增。

4．表示與判定目標(biāo)克隆經(jīng)過判定后，再導(dǎo)入感受態(tài)菌株，進(jìn)行可溶性表示。產(chǎn)物用Western-blot分析確定后，就完成了全過程。第33頁WesternBlotting免疫印跡WesternBlot采取是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)識(shí)二抗。經(jīng)過PAGE分離蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)識(shí)第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離特異性目標(biāo)基因表示蛋白成份。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平表示。第34頁第35頁經(jīng)典印跡試驗(yàn)包含三個(gè)步驟：

①蛋白質(zhì)電泳分離

②電泳后凝膠上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固體膜上。

③免疫學(xué)檢測。第36頁二、噬菌體抗體庫技術(shù)特點(diǎn)

1、模擬天然全套抗體庫：抗體文庫能夠到達(dá)或超出1011庫容，所以能包含B細(xì)胞全部克隆。建庫外源基因來自人體外周血、骨髓或脾臟淋巴細(xì)胞提取mRNA反轉(zhuǎn)錄形成cDNA擴(kuò)增，這是人體多克隆細(xì)胞總mRNA。使用通用引物采自多個(gè)人體，含有些人種屬普遍性?？贵wVH和VL基因隨機(jī)重組也增加了抗體多樣性。

2、避開了人工免疫和雜交瘤技術(shù)：因?yàn)榭贵w庫大容量和極高篩選效率，使得能夠調(diào)出任意抗體基因，用基因工程方法制備抗體，因而能防止使用人工免疫動(dòng)物和細(xì)胞融合技術(shù)。

3、可取得高親和力人源化抗體：在噬菌體抗體庫技術(shù)中，VH和VL基因隨機(jī)重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟過程，所用抗體基因又來自人體，所以，所產(chǎn)生抗體必定都是高親和力人源化抗體。第37頁三、基因工程抗體表示在篩選出陽性克隆后，按其目標(biāo)不一樣，可選取原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物等不一樣表示方式進(jìn)行表示。

1．原核細(xì)胞表示抗體表示，又分融合表示和分泌型表示兩種。融合表示有利于反抗體文庫進(jìn)行淘篩，且有利于對(duì)克隆和抗體活性進(jìn)行判定。分泌型表示則利用琥珀終止密碼終止作用，在無琥珀抑制基因菌株中進(jìn)行表示，形成可溶性抗體就是應(yīng)用抗體。第38頁無義突變?nèi)N昵稱，三個(gè)終止密碼子UAA叫赭石密碼子；UAG叫琥珀密碼子；UGA叫蛋白石密碼子。琥珀突變（AAG→UAG）就是當(dāng)ORF中一個(gè)密碼子突變?yōu)殓晷徒K止子后，生物體采取了一個(gè)辦法，原來此密碼子對(duì)應(yīng)反密碼子也突變?yōu)榕c琥珀密碼子配對(duì)，從而是ORF閱讀后產(chǎn)物和突變后產(chǎn)物一樣．這么就對(duì)突變進(jìn)行了抑制．第39頁

2．真核細(xì)胞表示用于表示基因工程抗體真核細(xì)胞有酵母、昆蟲細(xì)胞、中國倉鼠卵細(xì)胞和真菌等，而且這些細(xì)胞表示都是分泌型表示。

3．轉(zhuǎn)基因植物表示抗體基因能轉(zhuǎn)入植物中表示，這方面研究較多且潛力較大是煙草葉中表示．表示抗體稱為植物抗體。當(dāng)前完整抗體分子、單鏈抗體和Fab片段均已在煙草葉和擬南芥菜植物中得到表示，其產(chǎn)量可達(dá)植物葉片總蛋白量1．3％，其高表示產(chǎn)量使抗體成本大幅度下降，而且轉(zhuǎn)基因植物表示可使抗體大規(guī)模農(nóng)業(yè)化生產(chǎn)。

4．轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表示即將人Ig基因組轉(zhuǎn)移到動(dòng)物體內(nèi)，讓動(dòng)物產(chǎn)生人源化抗體。當(dāng)前只在單基因水平上做轉(zhuǎn)基因鼠試驗(yàn)，大基因片段轉(zhuǎn)移難度很大。第40頁

第四節(jié)抗體藥品一、抗體診療試劑二、抗體治療藥品第41頁

一、抗體診療試劑

抗原抗體特異性結(jié)合，在體內(nèi)和體外均可呈顯某種反應(yīng)。在體內(nèi)，可表現(xiàn)為溶菌、殺菌、促進(jìn)吞噬或中和毒素等作用，故抗體類藥品可用于治療。在體外，因?yàn)榭乖誀詈头磻?yīng)條件不一樣，可發(fā)生凝集或沉淀等可見反應(yīng)，故可用已知抗體來判定抗原，做病原學(xué)診療和血型測定，稱為血清學(xué)判定?？贵w診療藥品基本分為三類：1、血清學(xué)判定抗體制劑。2、免疫標(biāo)識(shí)技術(shù)用抗體制劑。3、體內(nèi)導(dǎo)向診療抗體制劑。習(xí)慣上體外試驗(yàn)用稱試劑，體內(nèi)導(dǎo)向診療用稱藥品。

第42頁1、血清學(xué)判定用抗體類試劑（1）判定病原菌用抗體試劑

A、慣用診療血清品種和用途

B、診療血清制備步驟

a、制備細(xì)菌抗原：細(xì)菌接種培養(yǎng)搜集菌苔-沸水2.5h--制成菌液。

b、免疫動(dòng)物和制備抗體血清：抗原稀釋后免疫動(dòng)物：家兔、馬、羊、豚鼠。免疫路徑：靜脈、腹腔、皮下。接種次數(shù)3-7次，每次間隔3-4d，末次注射后6-8d取血樣測效價(jià)，到達(dá)要求，即可采血，離心分離血清。

C、診療血清診療方法：直接凝集反應(yīng)，鏡檢第43頁第44頁（2）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）反向被動(dòng)血凝診療試劑

A、試劑制備原理：紅細(xì)胞經(jīng)甲醛處理后，在酸性條件下能吸附蛋白質(zhì)，當(dāng)純化抗HBs血清吸附其上時(shí)便含有抗體活性，若待測樣品中存在有HBsAg時(shí)，則發(fā)生特異性結(jié)合而使血細(xì)胞發(fā)生凝集。

B、制備步驟：先用HBsAg免疫豚鼠取得抗HBs血清硫酸銨鹽析/柱層析取其IgG在pH4.0醋酸緩沖液中致敏醛化血細(xì)胞洗去多出蛋白成份，用含1%兔血清稀釋液稀釋至一定濃度，分裝即成。

C、診療方法：RPHA（reversepassivehemagglutination)反向被動(dòng)血凝試驗(yàn)，即用純化抗體致敏醛化血細(xì)胞測定對(duì)應(yīng)抗原在V型血凝板上進(jìn)行，陰性樣品不凝集，血細(xì)胞沉積于V型孔底部，呈尖點(diǎn)狀；陽性樣品血細(xì)胞凝集成塊狀。

第45頁（3）妊娠診療試劑

婦女妊娠后，血液和尿液中HCG含量增高，在3個(gè)月內(nèi)可到達(dá)高峰。此時(shí)檢測尿液中HCG，就可確定是否懷孕（4）抗ABO血型系統(tǒng)血清第46頁為確保輸血安全，供血者和受血者均需檢驗(yàn)血型并做血交叉反應(yīng)。血型有多個(gè)系統(tǒng)，其中主要是ABO血型系統(tǒng)。按人紅細(xì)胞表面帶有A或B種凝集原．可將血型分為A、B、AB和O型4種。單克隆抗體是應(yīng)用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)抗A或抗B血清，以判別ABO血型。但單克隆抗體持異性極高，而血型物質(zhì)又太復(fù)雜，易得犯錯(cuò)誤結(jié)果，其陰性結(jié)果往往不能說明沒有該血型物質(zhì)，需用多株單克隆抗體混合才能克服這一缺點(diǎn)。但用單克隆抗體進(jìn)行血型物質(zhì)組成研究，則是有用工具。血型判定方法，最慣用是玻片直接凝集方法第47頁第48頁2、免疫標(biāo)識(shí)技術(shù)用抗體類試劑給抗體標(biāo)識(shí)核素、熒光素或酶活性，能將抗原抗體反應(yīng)放大，使常規(guī)不能觀察反應(yīng)得以顯現(xiàn)，可對(duì)微量抗原進(jìn)行定性定量測定，靈敏度提升。結(jié)合顯微鏡技術(shù)，還可反抗原物質(zhì)作出組織內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)定位測定。除臨床診療外，還能為探討發(fā)病機(jī)制提供伎倆。

（1）熒光抗體診療試劑：熒光抗體是用熒光色素,如異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明（RB200）、藻紅素（PE）等標(biāo)識(shí)抗體蛋白，即成熒光抗體。用熒光抗體浸染含有抗原物質(zhì)組織切片或細(xì)胞，熒光抗體就與抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下成為發(fā)光可視物，從而到達(dá)診療和定位目標(biāo)。（2）免疫酶抗體診療試劑：用酶標(biāo)識(shí)抗體檢驗(yàn)抗原方法

a、HBsAg(乙型肝炎表面抗原)酶標(biāo)診療試劑

b、HBeAg(乙型肝炎e抗原)酶標(biāo)診療試劑

c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原)酶標(biāo)診療試劑

d、測定HIV（人免疫缺點(diǎn)病毒）抗原酶標(biāo)診療試劑

e、AFP（甲胎蛋白）酶標(biāo)診療試劑用于原發(fā)性肝癌輔助診療

f、CEA（癌胚抗原）酶標(biāo)診療試劑用于消化道惡性腫瘤判別診療第49頁

免疫酶抗體診療技術(shù)免疫酶技術(shù)是用酶標(biāo)識(shí)抗體來檢測抗原方法。

(1)免疫酶染色法（酶標(biāo)抗體）酶標(biāo)抗體與抗原發(fā)生特異性結(jié)合，當(dāng)加人酶底物時(shí)，底物在酶催化作用下發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。該物質(zhì)不需特殊儀器，在光學(xué)顯微鏡下即能觀察。當(dāng)前慣用酶是辣根過氧化物酶，底物為二氨基聯(lián)苯胺．二者作用可生成棕褐色沉淀物，使玻片上抗原所在部分呈色。第50頁

(2)酶免疫測定法酶免疫測定是在液相內(nèi)微量待檢抗原物質(zhì)定量測定方法。用酶標(biāo)識(shí)已知抗體或抗免疫球蛋白(抗抗體)，與待查抗原混合形成抗原抗體結(jié)合物后，加入酶底物進(jìn)行顯色，依據(jù)呈色程度使用分光光度計(jì)測知待測物質(zhì)含量。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELSA)是酶免疫測定在方法上一個(gè)重大改進(jìn)，其特點(diǎn)是利用抗原或抗體等蛋內(nèi)質(zhì)輕易吸附于聚苯乙烯塑料等表面性質(zhì)，使抗原抗體反應(yīng)在塑料管(孔)壁表面上進(jìn)行，簡化了抗原抗體結(jié)合物分離手續(xù)。本法用途廣泛，敏感性高，既可定性檢測微量抗原，也可定量測定微生物成份、激素等微量抗原物質(zhì)。第51頁第52頁（3）放射免疫用抗體診療試劑

把核素分析高靈敏性與抗原抗體反應(yīng)特異性兩大特點(diǎn)結(jié)合起來建立檢測技術(shù)。能測出ng/ml，甚至pg/ml水平微量抗原物質(zhì)。

慣用標(biāo)識(shí)抗體試劑：

a、HBsAg放射性核素標(biāo)識(shí)抗體診療試劑：125I標(biāo)識(shí)，靈敏度0.1ng/mlb、HBeAg放射性核素標(biāo)識(shí)抗體診療試劑：125I標(biāo)識(shí)，靈敏度0.1ng/ml

。e抗原為陽性表明病毒正在大量繁殖，而且病毒數(shù)量比較多，傳染性強(qiáng)，需要馬上治療。c、HAV抗原放射性核素標(biāo)識(shí)抗體診療試劑：125I標(biāo)識(shí)

d、AFP放射性核素標(biāo)識(shí)抗體診療試劑：125I標(biāo)識(shí)，靈敏度1~5ng/mle、CEA放射性核素標(biāo)識(shí)抗體診療試劑：125I標(biāo)識(shí)，靈敏度1ng/第53頁3、導(dǎo)向診療藥品因?yàn)槟[瘤特異性小分子抗體尚在研究之中，所以導(dǎo)向藥品還未在臨床廣泛應(yīng)用。第54頁（1）．放射免疫顯像優(yōu)點(diǎn)：①在體內(nèi)有確切定位腫瘤作用．準(zhǔn)確性可達(dá)90％以上，靈敏度幾乎達(dá)100％。②在體內(nèi)可檢出0．5cm大小病灶，并可檢出肺、腦等部位轉(zhuǎn)移灶。③小分子抗體輕易抵達(dá)腫瘤部位，可顯著提升T(腫瘤組織)／NT(非腫瘤組織)值。④抗體在腫瘤部位，可保留6—9日。⑥能觀察抗體在血中半衰期和出現(xiàn)不良反應(yīng)。第55頁（2）．放射免疫顯像定位技術(shù)

是將抗腫瘤單克隆抗體(Ab)與二乙基三胺五乙酸(DTPA)在體外偶聯(lián)，再注人體內(nèi)，就能與腫瘤組織結(jié)合。因?yàn)榭贵w分子量較大，這一過程需3天才能完成。3天后注入半衰期短放射性核素In—113(半衰期100min)。因?yàn)樵茸⑷隓TPA是重金屬離子絡(luò)合劑，所以In—113就能夠結(jié)合到DTPA分子上，從而使腫瘤組織顯像。這一過程在2h之內(nèi)即可完成。該技術(shù)含有簡單、方便優(yōu)點(diǎn)，可在導(dǎo)向診療中發(fā)揮更大作用。第56頁

二、抗體治療藥品（體內(nèi)用藥品）抗體治療藥品研究已經(jīng)有20多年歷史，已制備出百余種單克隆抗體，判定出數(shù)十種與腫瘤相關(guān)抗原。但治療用制劑尚沒有一個(gè)到達(dá)商品化程度。在治療藥品中，單克隆抗體與毒素偶聯(lián)物治療淋巴瘤效果最正確，但有效率僅30%。當(dāng)前客觀現(xiàn)實(shí)是：研究進(jìn)展快速，但未到達(dá)常規(guī)治療應(yīng)用階段。障礙（原因）：抗體相對(duì)分子質(zhì)量大，穿透力低，不能到達(dá)靶部位或攝取量低。鼠源性抗體排斥反應(yīng)。

第57頁(一)、放射性核素標(biāo)識(shí)抗體治療藥品

抗體作為放射性核素導(dǎo)向載體，在人體內(nèi)應(yīng)用是比較成功。放射性核素標(biāo)識(shí)抗體操作簡便，放射性核素和抗體用量小，且能觀察到藥品在體內(nèi)分布和藥品動(dòng)力學(xué)，故應(yīng)用前景好。研究結(jié)果證實(shí)，1、放射性核素標(biāo)識(shí)抗體有較大殺傷范圍，這有利于克服腫瘤表面抗原異質(zhì)性，對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷也不依賴抗原抗體結(jié)合后吸收作用。2、放射性核素標(biāo)識(shí)抗體分子量小，更輕易穿透抵達(dá)腫瘤部位。所以，放射免疫治療是導(dǎo)向治療中活躍領(lǐng)域。其缺點(diǎn)是有些放射性核素起源困難，且需放射性保護(hù)和污物處理。第58頁(二)、抗癌藥品偶聯(lián)抗體藥品

1．慣用抗癌藥品

主要有氨甲喋吟、阿霉素、絲裂霉素、環(huán)磷酰胺、新抑癌蛋白和正定霉素等。以人血清白蛋白作為中間載體，可顯著提升每分子抗體所攜帶藥品量，使體外細(xì)胞毒性提升2倍，抗體藥品偶聯(lián)物對(duì)化學(xué)療法耐藥細(xì)胞株依然有效。第59頁2．抗體類藥品逆轉(zhuǎn)耐藥性

腫瘤細(xì)胞對(duì)藥品可產(chǎn)生多藥耐藥性(MDR)。MDR是由基因調(diào)控，其編碼蛋白稱為P糖蛋白，其中P170是與腫瘤耐藥相關(guān)主要蛋白，有l(wèi)280個(gè)氨基酸殘基．相對(duì)分子質(zhì)量為170一180kd跨膜蛋白。在細(xì)胞膜內(nèi)折疊成6對(duì)，形成通道結(jié)構(gòu)，胞漿側(cè)有2個(gè)ATP結(jié)合區(qū)。當(dāng)前認(rèn)為P糖蛋白是ATP酶依賴性藥泵，藥品進(jìn)入細(xì)胞后與P糖蛋白結(jié)合，利用ATP水解釋放能量將藥品泵出胞外，使胞內(nèi)藥品蓄積降低，因而產(chǎn)生耐藥性。

腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性(multidrugresistance)產(chǎn)生是造成腫瘤化療失敗主要原因之一。第60頁針對(duì)腫瘤MDR產(chǎn)生過程，應(yīng)用多藥耐藥逆轉(zhuǎn)是處理腫瘤MDR主要伎倆。研究發(fā)覺大量含有MDR逆轉(zhuǎn)活性化合物,主要包含：鈣通道阻滯劑(維拉帕米及其衍生物