X22SZDB/ZSZDB/Z258—2017肉食品中鴨源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法Real-timePCRfordetectionofduck-derivedingredients深圳市市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布ISZDB/Z258—2017前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14縮略語(yǔ) 1 16試劑和材料 27主要器械和設(shè)備 28檢驗(yàn)步驟 29質(zhì)量控制 310結(jié)果判定與表述 3 4SZDB/Z258—2017本文件按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本文件的附錄A為資料性附錄。本文件由深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院提出。本文件由中華人民共和國(guó)深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局歸口。本文件起草單位：深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心、深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心。本文件主要起草人：林彥星、曹琛福、黃超華、花群義、張彩虹、阮周曦、曾少靈、謝麗琪、陶虹、廖立珊。SZDB/Z258—20171肉食品中鴨源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法本文件規(guī)定了肉食品中鴨源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。本文件適用于肉食品中鴨源性成分的定性檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法場(chǎng)地通用規(guī)范GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1實(shí)時(shí)熒光PCRrealtimePCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)PCR擴(kuò)增過(guò)程。3.2Ct值cyclethreshold每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。4縮略語(yǔ)COX3：細(xì)胞色素C氧化酶III（cytochromecoxidasesubunitIII）DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）ROX：6-羧基-X-羅丹明（6-Carboxyl-X-Rhodamine）CTAB：十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrithylammoniumbromide）Tris：三（羥甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）5原理SZDB/Z258—20172樣品經(jīng)研磨混勻后，提取DNA，以DNA為模板，采用鴨線(xiàn)粒體COX3基因特異性檢測(cè)引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，根據(jù)Ct值，判斷樣品中是否存在鴨源性成分。6試劑和材料6.1試劑裂解液（參見(jiàn)附錄A），三氯甲烷，異丙醇，75%乙醇，雙蒸水。除另有規(guī)定外，試劑為分析純或生化試劑，實(shí)驗(yàn)用水為GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水。所有試劑均用無(wú)DNA酶污染的容器盛裝。6.2檢測(cè)用引物和探針上游引物F：5’-CTTACTCACAACCTCAGGGCTAG-3’下游引物R：5’-TGTAGGTGTGTGGTGGCCTT-3’探針P：5’-FAM-CTCATCTATCCTGCTAGCCGCCG-BHQ1-3’7主要器械和設(shè)備高速離心機(jī)（最大離心力達(dá)12000g以上），微量移液器（10μL,100μL,1000μL），實(shí)時(shí)熒光PCR儀，恒溫水浴鍋，天平（感量0.001g和0.1g渦旋振蕩器，pH計(jì)。8檢驗(yàn)步驟8.1樣品制備稱(chēng)取待檢樣品200mg，研磨混勻待用。8.2樣品DNA提取稱(chēng)取上述混勻樣品50mg于1.5mL離心管中，加入600μL～800μL裂解液，65℃作用30min，期間不時(shí)振蕩混勻；12000r/min離心5min；轉(zhuǎn)移上清液于潔凈離心管中，加400μL三氯甲烷/異戊醇（24:1），混勻；12000r/min離心5min，取上清液；加0.8倍體積預(yù)冷的異丙醇，沉淀；12000r/min離心5min，棄上清液；75%乙醇洗滌一次，晾干；加入50μL雙蒸水溶解沉淀，制成DNA溶液，保存-20℃待用。也可用等效DNA提取試劑盒提取樣品DNA。8.3實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：體積為20μL，包括2×ProbeqPCRMIX10μL（內(nèi)含DNA聚合酶、dNTP等）、50×ROXReferencedye0.04μL、正向引物(10μmol/L)1μL、反向引物(10μmol/L)1μL、探針(10μmol/L)0.5μL、模板DNA0.8μL、補(bǔ)足雙蒸水至總體積20μL。也可選用其它商品化實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)預(yù)混液。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性20s；95℃變性3s，60℃退火30s，60℃收集熒光，40個(gè)循環(huán)。也可選用其它商品化實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)預(yù)混液，并參照其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。8.4實(shí)驗(yàn)對(duì)照檢測(cè)過(guò)程中分別設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照，樣品及對(duì)照均設(shè)兩個(gè)重復(fù)，Ct值取兩個(gè)重復(fù)的平均值作為最終結(jié)果。采用已知含有鴨源性成分的鴨肉提取的DNA作為陽(yáng)性對(duì)照。采用已知不含鴨源性SZDB/Z258—20173成分的其它動(dòng)物組織（如羊肉、雞肉雞肉）提取的DNA作為陰性對(duì)照。采用與模板等體積的雙蒸水作為9質(zhì)量控制9.1質(zhì)控要求同時(shí)滿(mǎn)足以下條件時(shí)，實(shí)驗(yàn)有效：a)空白對(duì)照：無(wú)熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，無(wú)Ct值。b)陰性對(duì)照：無(wú)熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，無(wú)Ct值。c)陽(yáng)性對(duì)照：有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，且熒光通道出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線(xiàn)，相應(yīng)的Ct值＜30.0。9.2防污染措施檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的規(guī)定執(zhí)行。10結(jié)果判定與表述10.1結(jié)果判定在符合9.1條的情況下，被檢樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)：a)如Ct值≤35.0，且熒光通道出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線(xiàn)，則判定為被檢樣品陽(yáng)性。b)如無(wú)Ct值，則判定為被檢樣品陰性。c)如35.0＜Ct值＜40.0，則重復(fù)一次。如再次擴(kuò)增后Ct值＜40.0，則判定為被檢樣品陽(yáng)性；如再次擴(kuò)增后無(wú)Ct值，則判定被檢樣品陰性