2025年P(guān)CR上崗證考試題及答案一、單項(xiàng)選擇題（每題2分，共30分）1.PCR反應(yīng)中，變性步驟的典型溫度是？A.94℃B.55℃C.72℃D.37℃2.以下哪種物質(zhì)可有效抑制PCR反應(yīng)中的核酸酶活性？A.EDTAB.NaClC.Tris-HClD.SDS3.熒光定量PCR中，Ct值的定義是？A.擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到平臺(tái)期的循環(huán)數(shù)B.熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)C.引物二聚體開始形成的循環(huán)數(shù)D.模板完全消耗的循環(huán)數(shù)4.引物設(shè)計(jì)時(shí)，為避免引物二聚體，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注引物的？A.3’端互補(bǔ)性B.5’端GC含量C.長(zhǎng)度D.Tm值5.PCR實(shí)驗(yàn)室中，樣本處理區(qū)（第二區(qū)）的主要操作是？A.試劑配制B.核酸提取與純化C.PCR擴(kuò)增D.產(chǎn)物電泳分析6.以下哪種情況會(huì)導(dǎo)致PCR假陰性結(jié)果？A.擴(kuò)增產(chǎn)物污染B.樣本中存在Taq酶抑制劑C.引物濃度過高D.Mg2+濃度過高7.實(shí)時(shí)熒光PCR中，使用UNG酶（尿嘧啶DNA糖基化酶）的主要目的是？A.提高擴(kuò)增效率B.降解含dUTP的既往擴(kuò)增產(chǎn)物C.增強(qiáng)引物特異性D.降低退火溫度8.內(nèi)參基因（如β-actin）在PCR檢測(cè)中的核心作用是？A.驗(yàn)證樣本核酸提取質(zhì)量B.提高目標(biāo)基因擴(kuò)增效率C.減少引物二聚體D.降低Ct值變異系數(shù)9.PCR反應(yīng)體系中，dNTP的最佳濃度范圍通常為？A.0.01-0.1mmol/LB.0.1-0.5mmol/LC.1-5mmol/LD.5-10mmol/L10.以下哪種污染類型是PCR實(shí)驗(yàn)室最常見的交叉污染來(lái)源？A.樣本間交叉污染B.氣溶膠污染C.試劑污染D.設(shè)備殘留污染11.熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率反映的是？A.擴(kuò)增效率B.檢測(cè)靈敏度C.特異性D.重復(fù)性12.核酸提取過程中，使用乙醇洗滌的主要目的是？A.裂解細(xì)胞B.沉淀核酸C.去除鹽離子和雜質(zhì)D.滅活核酸酶13.PCR擴(kuò)增儀的溫度均勻性應(yīng)控制在？A.±0.1℃B.±0.5℃C.±1.0℃D.±2.0℃14.檢測(cè)結(jié)果為“陰性”時(shí)，需同時(shí)滿足的條件是？A.目標(biāo)基因無(wú)擴(kuò)增，內(nèi)參基因正常擴(kuò)增B.目標(biāo)基因無(wú)擴(kuò)增，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增C.內(nèi)參基因正常擴(kuò)增，陽(yáng)性對(duì)照正常擴(kuò)增D.目標(biāo)基因無(wú)擴(kuò)增，內(nèi)參基因正常擴(kuò)增，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增15.以下哪種情況無(wú)需重新檢測(cè)？A.陽(yáng)性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增B.內(nèi)參基因擴(kuò)增失敗C.樣本Ct值在有效檢測(cè)范圍內(nèi)且重復(fù)性良好D.陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增曲線二、多項(xiàng)選擇題（每題3分，共15分，多選、少選、錯(cuò)選均不得分）1.影響PCR擴(kuò)增效率的主要因素包括？A.模板核酸的質(zhì)量與濃度B.引物的特異性與濃度C.Mg2+離子濃度D.退火溫度與時(shí)間2.PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)應(yīng)包括？A.試劑準(zhǔn)備區(qū)（第一區(qū)）B.樣本處理區(qū)（第二區(qū)）C.擴(kuò)增區(qū)（第三區(qū)）D.產(chǎn)物分析區(qū)（第四區(qū)）3.陽(yáng)性對(duì)照在PCR檢測(cè)中的作用包括？A.驗(yàn)證擴(kuò)增體系的有效性B.監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)過程中的污染C.評(píng)估檢測(cè)方法的靈敏度D.替代內(nèi)參基因4.核酸提取過程中可能導(dǎo)致產(chǎn)量降低的原因有？A.樣本裂解不充分B.離心速度或時(shí)間不足C.洗滌液殘留過多D.洗脫緩沖液pH不適5.實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果判讀時(shí)，需重點(diǎn)關(guān)注的參數(shù)包括？A.Ct值B.擴(kuò)增曲線形態(tài)C.熔解曲線峰型D.陰性對(duì)照的Ct值三、判斷題（每題2分，共20分，正確填“√”，錯(cuò)誤填“×”）1.PCR實(shí)驗(yàn)室可以不設(shè)置緩沖間，僅通過分區(qū)標(biāo)識(shí)區(qū)分區(qū)域。（）2.擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)（第四區(qū)）可使用開放式離心機(jī)，無(wú)需專用。（）3.同一批檢測(cè)中，若陽(yáng)性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增，所有樣本結(jié)果均無(wú)效。（）4.核酸提取時(shí)，加入蛋白酶K的目的是裂解細(xì)胞膜。（）5.熒光定量PCR中，熔解曲線出現(xiàn)雙峰可能提示引物二聚體或非特異性擴(kuò)增。（）6.為提高檢測(cè)靈敏度，可隨意降低熒光閾值設(shè)置。（）7.樣本處理區(qū)（第二區(qū)）應(yīng)配備生物安全柜，避免氣溶膠擴(kuò)散。（）8.擴(kuò)增儀的溫度校準(zhǔn)應(yīng)至少每年進(jìn)行1次。（）9.內(nèi)參基因擴(kuò)增失敗時(shí)，樣本檢測(cè)結(jié)果仍可報(bào)告為“陰性”。（）10.使用一次性吸頭（帶濾芯）可有效降低氣溶膠污染風(fēng)險(xiǎn)。（）四、簡(jiǎn)答題（每題8分，共24分）1.簡(jiǎn)述PCR實(shí)驗(yàn)室四區(qū)的功能及氣流方向要求。2.引物設(shè)計(jì)的基本原則包括哪些？請(qǐng)至少列出5項(xiàng)。3.列舉3種PCR假陽(yáng)性結(jié)果的可能原因，并提出對(duì)應(yīng)的解決措施。五、案例分析題（11分）某臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室開展新冠病毒核酸檢測(cè)，某次檢測(cè)中出現(xiàn)以下情況：-陽(yáng)性對(duì)照（濃度1×103copies/mL）Ct值為30（預(yù)期Ct值28-32）；-陰性對(duì)照（無(wú)模板水）Ct值為38（基線附近有微弱擴(kuò)增曲線）；-2份臨床樣本Ct值分別為35（曲線平滑）和“無(wú)擴(kuò)增”（內(nèi)參基因Ct值22）。請(qǐng)分析：（1）陰性對(duì)照結(jié)果是否符合要求？可能的原因是什么？（2）Ct值為35的樣本應(yīng)如何報(bào)告？（3）“無(wú)擴(kuò)增”樣本的檢測(cè)結(jié)果是否有效？為什么？參考答案一、單項(xiàng)選擇題1.A2.A3.B4.A5.B6.B7.B8.A9.B10.B11.A12.C13.B14.D15.C二、多項(xiàng)選擇題1.ABCD2.ABCD3.ABC4.ABCD5.ABC三、判斷題1.×2.×3.√4.×5.√6.×7.√8.√9.×10.√四、簡(jiǎn)答題1.PCR實(shí)驗(yàn)室四區(qū)功能及氣流方向要求：-試劑準(zhǔn)備區(qū)（第一區(qū)）：用于PCR反應(yīng)體系（如引物、dNTP、酶等）的配制與分裝，需嚴(yán)格避免外源核酸污染。-樣本處理區(qū)（第二區(qū)）：進(jìn)行樣本的前處理（如細(xì)胞裂解、核酸提取與純化），需防止樣本間交叉污染。-擴(kuò)增區(qū)（第三區(qū)）：完成PCR擴(kuò)增反應(yīng)，需避免擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)前兩區(qū)的污染。-產(chǎn)物分析區(qū)（第四區(qū)）：對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)（如電泳、熒光分析），是污染風(fēng)險(xiǎn)最高的區(qū)域。氣流方向要求：從清潔區(qū)（第一區(qū)）到污染區(qū)（第四區(qū)），保持遞減的負(fù)壓梯度（如第一區(qū)＞第二區(qū)＞第三區(qū)＞第四區(qū)），避免空氣逆流導(dǎo)致污染。2.引物設(shè)計(jì)基本原則（至少5項(xiàng)）：-長(zhǎng)度：18-25bp（常用），過長(zhǎng)易導(dǎo)致非特異性結(jié)合，過短影響特異性。-Tm值：引物Tm值應(yīng)接近（±2℃），通常55-65℃，避免Tm值差異過大導(dǎo)致擴(kuò)增效率不均。-GC含量：40%-60%，過高易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，過低影響引物與模板結(jié)合穩(wěn)定性。-3’端特異性：避免3’端互補(bǔ)（尤其連續(xù)2-3個(gè)堿基），防止引物二聚體；3’端最好為G/C，增強(qiáng)結(jié)合力。-避免重復(fù)序列：如polyA或polyT，防止非特異性擴(kuò)增。-特異性：通過BLAST比對(duì)確保引物僅與目標(biāo)基因互補(bǔ)，避免與其他基因同源序列結(jié)合。3.PCR假陽(yáng)性結(jié)果的可能原因及解決措施（列舉3種）：-原因1：氣溶膠污染（如既往擴(kuò)增產(chǎn)物形成的微小顆粒殘留于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境）。解決措施：分區(qū)操作，各區(qū)物品專用；擴(kuò)增后區(qū)（第三、四區(qū)）避免開啟反應(yīng)管；定期使用紫外線（254nm）照射或DNA酶處理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面。-原因2：加樣槍交叉污染（吸頭未更換或槍頭無(wú)濾芯）。解決措施：使用帶濾芯的一次性吸頭；每步操作更換吸頭；加樣槍定期校準(zhǔn)并進(jìn)行污染檢測(cè)（如用無(wú)模板水作為樣本檢測(cè)）。-原因3：試劑污染（如引物、dNTP等試劑被目標(biāo)核酸污染）。解決措施：分裝試劑至小體積（避免反復(fù)凍融）；使用前檢測(cè)試劑空白（無(wú)模板對(duì)照）；必要時(shí)更換新批次試劑。五、案例分析題（1）陰性對(duì)照結(jié)果不符合要求。原因：陰性對(duì)照（無(wú)模板水）出現(xiàn)Ct值38（基線附近微弱擴(kuò)增），提示存在輕微污染（可能為氣溶膠污染或加樣過程中交叉污染）。正常情況下，陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)擴(kuò)增曲線或Ct值＞40（超出檢測(cè)范圍）。（2）Ct值為35的樣本應(yīng)報(bào)告為“陽(yáng)性”。新冠病毒核酸檢測(cè)通常以Ct值≤37為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)（具體根據(jù)試劑盒說明書）。該樣本Ct值35且擴(kuò)增曲線平滑，符合陽(yáng)性判定條件。（3）“無(wú)擴(kuò)增”樣本的檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。內(nèi)參基因（如人源管家基因）Ct值22（正常范圍），說明