病理特殊染色技術(shù)應(yīng)用匯編引言病理診斷作為疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色雖能呈現(xiàn)組織細胞的基本形態(tài)，但對特殊結(jié)構(gòu)、病原體或化學(xué)成分的顯示存在局限。特殊染色技術(shù)通過針對性的化學(xué)或免疫化學(xué)反應(yīng)，可清晰呈現(xiàn)糖原、膠原纖維、病原體等HE染色難以辨別的成分，在腫瘤分型、感染性疾病診斷、遺傳性疾病篩查等領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。本文系統(tǒng)梳理臨床與科研中常用的病理特殊染色技術(shù)，剖析其應(yīng)用場景、操作要點及質(zhì)量控制策略，為病理技術(shù)人員及診斷醫(yī)師提供實用參考。一、多糖類物質(zhì)染色：過碘酸-雪夫反應(yīng)（PAS）（一）原理與應(yīng)用場景PAS反應(yīng)基于過碘酸氧化糖類分子中的鄰位羥基生成醛基，醛基與雪夫試劑（Schiff試劑）中的無色品紅結(jié)合，形成紫紅色化合物。該技術(shù)主要用于顯示糖原、黏多糖、真菌細胞壁（如念珠菌、曲霉菌）及基底膜（如腎小球基底膜）等含多糖的結(jié)構(gòu)。臨床場景：糖尿病腎病中腎小球基底膜增厚伴糖原沉積，PAS染色可清晰顯示基底膜的“鐵絲圈”樣改變；肺孢子菌肺炎時，肺泡腔內(nèi)的病原體經(jīng)PAS染色呈紫紅色，與HE染色的模糊顯示形成鮮明對比；腸上皮化生的胃黏膜中，杯狀細胞的黏多糖可被PAS特異性染色，輔助鑒別腸化類型。科研延伸：腫瘤組織的糖原代謝研究中，PAS可定量分析腫瘤細胞內(nèi)糖原含量，結(jié)合糖代謝相關(guān)分子檢測，探索腫瘤能量代謝重編程機制。（二）操作要點1.固定與切片：建議采用中性福爾馬林固定，避免乙醇固定導(dǎo)致糖原溶解；石蠟切片厚度以3-5μm為宜，冰凍切片需新鮮制備（糖原易降解）。2.染色流程：過碘酸氧化（室溫，5-10min）→流水沖洗（去除未結(jié)合的過碘酸）→Schiff試劑孵育（37℃，15-30min）→亞硫酸水沖洗（去除背景色）→蘇木精對比染色（核復(fù)染，1-2min）。3.注意事項：過碘酸濃度（通常0.5%-1%）需嚴格把控，濃度過高易過度氧化組織，過低則染色強度不足；Schiff試劑需避光保存，若出現(xiàn)變紅或沉淀需及時更換。二、結(jié)締組織染色：Masson三色染色（一）原理與應(yīng)用場景Masson染色通過酸性復(fù)紅-苯胺藍（或亮綠）的選擇性結(jié)合，使膠原纖維呈藍色（或綠色），肌纖維、胞質(zhì)呈紅色，細胞核呈黑色（鐵蘇木精復(fù)染）。該技術(shù)核心價值在于顯示組織纖維化程度、區(qū)分腫瘤間質(zhì)與實質(zhì)。臨床場景：肝纖維化時，匯管區(qū)及肝小葉內(nèi)的膠原纖維增生可通過Masson染色量化，輔助評估肝硬化分期；乳腺浸潤性癌中，癌巢周圍的膠原纖維（藍色）與癌細胞（紅色）對比清晰，利于判斷腫瘤浸潤范圍；心肌梗死后的瘢痕組織（膠原纖維）與存活心?。t色）可通過Masson染色直觀區(qū)分?？蒲醒由欤悍卫w維化模型中，Masson染色結(jié)合圖像分析軟件，可半定量評估肺組織膠原沉積面積，為抗纖維化藥物研發(fā)提供客觀指標(biāo)。（二）操作要點1.固定與脫蠟：需充分脫蠟至水，殘留石蠟會導(dǎo)致染色不均；若組織含鐵血黃素較多，需先經(jīng)鐵氰化鉀處理去除（避免干擾復(fù)染）。2.染色關(guān)鍵步驟：麗春紅-酸性品紅染色（室溫，5-10min）→磷鉬酸-磷鎢酸分化（控制分化時間，使肌纖維保留紅色，膠原纖維被分化）→苯胺藍復(fù)染（室溫，5min）→冰醋酸處理（增強色彩對比度）。3.質(zhì)量控制：分化時間是核心難點，過短則膠原纖維殘留紅色，過長則肌纖維褪色；可通過陽性對照（如肝硬變組織）驗證染色效果，膠原纖維應(yīng)呈現(xiàn)清晰的藍色，肌纖維紅色鮮艷。三、網(wǎng)狀纖維與病原體染色：銀染技術(shù)（一）Gomori網(wǎng)狀纖維染色原理：網(wǎng)狀纖維（Ⅲ型膠原）含嗜銀性蛋白，經(jīng)硝酸銀氧化后還原為金屬銀，呈黑色或棕黑色。應(yīng)用場景：腫瘤病理：肝癌組織中，癌巢周圍的網(wǎng)狀纖維被破壞，而肝硬化結(jié)節(jié)的網(wǎng)狀纖維呈完整的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可輔助鑒別肝細胞癌與肝硬化結(jié)節(jié)；淋巴瘤組織的網(wǎng)狀纖維分布（如濾泡性淋巴瘤的“洋蔥皮”樣網(wǎng)狀纖維）有助于分型。腎臟病理：腎小球基底膜的網(wǎng)狀纖維支架破壞提示腎小球硬化，可結(jié)合PAS染色評估腎病進展。操作要點：固定液選擇10%中性福爾馬林，避免汞固定液（干擾銀離子結(jié)合）；切片厚度2-3μm，過厚易導(dǎo)致銀顆粒堆積。染色流程：酸化（1%醋酸處理，增強嗜銀性）→硝酸銀孵育（60℃，15-30min，避光）→氨水溶液還原（形成金屬銀）→氯化金調(diào)色（使背景呈淡黃色，突出黑色網(wǎng)狀纖維）。注意事項：硝酸銀溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存；氨水溶液濃度需精準(zhǔn)（通常5%-10%），濃度過高易導(dǎo)致銀沉淀，過低則還原不充分。（二）抗酸染色（Ziehl-Neelsen法）原理：分枝桿菌（如結(jié)核桿菌、麻風(fēng)桿菌）的細胞壁含大量脂質(zhì)（如分枝菌酸），能抵抗酸性乙醇脫色，經(jīng)石炭酸復(fù)紅染色后呈紅色，背景為藍色（亞甲藍復(fù)染）。應(yīng)用場景：感染性疾病：肺結(jié)核標(biāo)本（痰、組織）中，抗酸染色可快速篩查結(jié)核桿菌；皮膚麻風(fēng)病變組織中，抗酸染色陽性的麻風(fēng)桿菌呈紅色桿狀，輔助診斷與分型。鑒別診斷：需與諾卡菌（部分抗酸弱陽性）、非典型分枝桿菌（如龜分枝桿菌）鑒別，結(jié)合培養(yǎng)及分子檢測提高準(zhǔn)確性。操作要點：標(biāo)本處理：痰標(biāo)本需離心濃縮，組織切片需脫蠟至水，避免脂質(zhì)殘留影響染色。染色關(guān)鍵：石炭酸復(fù)紅需加熱（微沸，5-10min）以促進染料滲透；酸性乙醇脫色需適度（通常3-5次浸洗），過度脫色會導(dǎo)致假陰性，不足則背景泛紅。質(zhì)量控制：設(shè)立陽性對照（已知結(jié)核桿菌涂片）和陰性對照（正常組織），確保染色體系穩(wěn)定。四、脂質(zhì)染色：油紅O染色（一）原理與應(yīng)用油紅O是脂溶性染料，可溶解于組織內(nèi)的中性脂肪（甘油三酯）和脂質(zhì)，在冰凍切片中與脂質(zhì)結(jié)合呈紅色，背景為藍色（蘇木精復(fù)染）。因石蠟包埋過程中脂質(zhì)被有機溶劑溶解，故僅適用于冰凍切片或新鮮組織。應(yīng)用場景：臨床病理：脂肪肝的診斷中，肝組織冰凍切片經(jīng)油紅O染色后，肝細胞內(nèi)的脂滴呈紅色，可半定量評估脂肪變性程度；動脈粥樣硬化斑塊中的脂質(zhì)核心（油紅O陽性）與纖維帽（Masson染色陽性）可聯(lián)合分析，評估斑塊穩(wěn)定性。科研領(lǐng)域：肥胖模型小鼠的脂肪組織、骨骼肌脂質(zhì)沉積研究，油紅O染色結(jié)合圖像分析可量化脂質(zhì)含量，輔助代謝性疾病機制研究。（二）操作要點1.標(biāo)本制備：新鮮組織需快速冷凍（-20℃至-80℃），避免冰晶形成（影響脂質(zhì)分布）；冰凍切片厚度5-8μm，貼附于防脫載玻片上。2.染色流程：切片晾干（避免水洗，防止脂質(zhì)溶解）→油紅O工作液孵育（60℃，5-10min，避光）→60%異丙醇分化（去除背景非特異性染色）→蘇木精復(fù)染核（1-2min）→甘油明膠封片（避免二甲苯透明，防止脂質(zhì)溶解）。3.注意事項：油紅O需用異丙醇溶解，工作液需過濾后使用；封片時避免使用含二甲苯的封固劑，否則脂質(zhì)會被溶解，染色效果消失。五、淀粉樣物質(zhì)染色：剛果紅染色（一）原理與應(yīng)用淀粉樣物質(zhì)（主要為淀粉樣蛋白）是一種β-折疊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)聚合物，剛果紅在堿性條件下可與淀粉樣蛋白的β-折疊結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，在普通光鏡下呈橙紅色，偏振光下呈蘋果綠雙折光。應(yīng)用場景：系統(tǒng)性淀粉樣變：心臟、腎臟、肝臟等組織的淀粉樣物質(zhì)沉積，剛果紅染色可明確診斷；阿爾茨海默病的腦組織中，老年斑內(nèi)的淀粉樣蛋白經(jīng)剛果紅染色呈典型雙折光。腫瘤相關(guān)淀粉樣變：甲狀腺髓樣癌的間質(zhì)淀粉樣物質(zhì)沉積，剛果紅染色陽性可輔助腫瘤分型。（二）操作要點1.固定與切片：需用中性福爾馬林固定，避免酸性固定液（影響剛果紅結(jié)合）；石蠟切片或冰凍切片均可，冰凍切片需新鮮制備（淀粉樣蛋白穩(wěn)定，石蠟切片更常用）。2.染色流程：剛果紅工作液孵育（室溫，15-30min，堿性環(huán)境，pH≈8.5）→流水沖洗（去除未結(jié)合染料）→蘇木精復(fù)染核（1min）→甘油明膠封片（偏振光觀察前需確保切片干燥）。3.質(zhì)量控制：偏振光顯微鏡觀察是關(guān)鍵，需確認蘋果綠雙折光（避免與膠原纖維的橙紅色混淆）；可設(shè)置陽性對照（如已知淀粉樣變組織），陰性對照（正常肝組織）。六、特殊染色技術(shù)操作共性要點與質(zhì)量控制（一）標(biāo)本處理與固定固定液選擇：含重金屬的固定液（如Bouin液、Zenker液）可能干擾銀染、剛果紅染色，需根據(jù)染色目標(biāo)選擇中性福爾馬林（通用）或乙醇（糖原染色）。脫蠟與水化：石蠟切片需徹底脫蠟（二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min），殘留石蠟會導(dǎo)致染色不均；冰凍切片需避免反復(fù)凍融，防止抗原/成分丟失。（二）試劑管理與配制現(xiàn)配現(xiàn)用：Schiff試劑、硝酸銀溶液、油紅O工作液等易氧化或降解，需臨用前配制，避光保存。濃度校準(zhǔn)：過碘酸、氨水溶液等濃度需用標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)，避免因試劑濃度誤差導(dǎo)致染色失敗。（三）質(zhì)量控制策略陽性與陰性對照：每批染色需設(shè)置已知陽性（如肝硬變組織用于Masson染色）和陰性對照（正常組織），確保染色體系穩(wěn)定。重復(fù)驗證：關(guān)鍵病例（如疑難腫瘤、罕見感染）建議重復(fù)染色或聯(lián)合多種技術(shù)（如PAS+免疫組化），降低假陽性/假陰性風(fēng)險。圖像分析：結(jié)合數(shù)字病理系統(tǒng)，對染色結(jié)果（如膠原纖維面積、脂質(zhì)含量）進行半定量分析，提高結(jié)果客觀性。七、臨床與科研價值拓展（一）腫瘤精準(zhǔn)診斷特殊染色與免疫組化聯(lián)合應(yīng)用，可更精準(zhǔn)分型腫瘤：如腎透明細胞癌（PAS染色顯示糖原/脂質(zhì)豐富）+CD10（+）+RCC（+），明確診斷；惡性黑色素瘤（Fontana銀染顯示黑色素）+S-100（+）+HMB45（+），輔助鑒別診斷。（二）感染性疾病快速篩查抗酸染色、六胺銀染色（用于肺孢子菌、真菌）可在24小時內(nèi)完成，為感染性疾病（如結(jié)核、真菌性肺炎）的早期診斷提供依據(jù)，指導(dǎo)抗生素/抗真菌藥物選擇。（三）科研領(lǐng)域的多組學(xué)整合特殊染色結(jié)果可與轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)：如肝纖維化組織的Masson染色膠原面積與TGF-β通路基因表達量正相關(guān)，為抗纖維化靶點篩選提供表型-分子關(guān)聯(lián)證據(jù)。八、技術(shù)展望隨著病理技術(shù)的發(fā)展，特殊染色正朝著自動化、標(biāo)準(zhǔn)化、多模態(tài)整合方向邁進：自動化染色系統(tǒng)（如Ventana、Leica的特殊染色模塊）可精準(zhǔn)控制試劑濃度、孵育時間，降低人為誤差；人工智能輔助診斷系統(tǒng)可對特殊染色圖像（如