《GB/T15670.21-2017農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法

第21部分

：體內(nèi)哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞程序外DNA合成(UDS)試驗(yàn)》(2026年)深度解析目錄毒理學(xué)試驗(yàn)的“DNA哨兵”:UDS試驗(yàn)為何成為農(nóng)藥登記的核心把關(guān)環(huán)節(jié)?——專家視角下標(biāo)準(zhǔn)的定位與價(jià)值試驗(yàn)設(shè)計(jì)的“黃金法則”:標(biāo)準(zhǔn)如何規(guī)范試驗(yàn)動(dòng)物與分組?——保障結(jié)果可靠性的前提條件深度剖析操作流程的“步步為營”:從染毒到制片的全流程規(guī)范是什么?——標(biāo)準(zhǔn)核心操作步驟的專家拆解數(shù)據(jù)處理的“嚴(yán)謹(jǐn)之道”:統(tǒng)計(jì)學(xué)方法如何為試驗(yàn)結(jié)論保駕護(hù)航?——標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)處理要求的深度應(yīng)用行業(yè)變革下的適配性:UDS試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)如何應(yīng)對(duì)新型農(nóng)藥的挑戰(zhàn)?——未來5年試驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展趨勢預(yù)測追本溯源:UDS試驗(yàn)的生物學(xué)本質(zhì)是什么?——從DNA損傷修復(fù)機(jī)制看懂標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)根基試劑與儀器的“精準(zhǔn)搭檔”:哪些關(guān)鍵物資決定試驗(yàn)成敗?——標(biāo)準(zhǔn)中試劑配置與儀器要求的細(xì)節(jié)解讀顯微鏡下的“

密碼破譯”:如何準(zhǔn)確判斷UDS陽性結(jié)果?——標(biāo)準(zhǔn)中結(jié)果觀察與判定標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)操指南質(zhì)量控制的“

防火墻”:陰性與陽性對(duì)照該如何設(shè)置才有效?——規(guī)避試驗(yàn)誤差的關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)從標(biāo)準(zhǔn)到實(shí)踐:UDS試驗(yàn)結(jié)果如何支撐農(nóng)藥安全評(píng)價(jià)與登記決策?——企業(yè)與監(jiān)管部門的應(yīng)用場景解理學(xué)試驗(yàn)的“DNA哨兵”：UDS試驗(yàn)為何成為農(nóng)藥登記的核心把關(guān)環(huán)節(jié)？——專家視角下標(biāo)準(zhǔn)的定位與價(jià)值農(nóng)藥登記毒理學(xué)評(píng)價(jià)體系：UDS試驗(yàn)的不可替代地位1農(nóng)藥登記需全面評(píng)估遺傳毒性，DNA損傷是核心指標(biāo)。UDS試驗(yàn)聚焦肝細(xì)胞DNA修復(fù)活性，彌補(bǔ)傳統(tǒng)突變試驗(yàn)短板，可早期發(fā)現(xiàn)非致突變性DNA損傷。在GB/T15670系列標(biāo)準(zhǔn)中，本部分與基因突變?nèi)旧w畸變試驗(yàn)形成互補(bǔ)，構(gòu)成遺傳毒性評(píng)價(jià)的“鐵三角”，是農(nóng)藥進(jìn)入市場的必過關(guān)卡，其數(shù)據(jù)直接影響登記審批結(jié)果。2（二）標(biāo)準(zhǔn)制定的背景與行業(yè)訴求：為何需單獨(dú)規(guī)范UDS試驗(yàn)方法？1早期農(nóng)藥毒理學(xué)試驗(yàn)中，UDS試驗(yàn)方法不統(tǒng)一，結(jié)果可比性差。隨著新型農(nóng)藥研發(fā)加速，遺傳毒性評(píng)價(jià)精度要求提升，行業(yè)亟需統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)2017年發(fā)布，整合國際先進(jìn)方法與國內(nèi)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，解決了試驗(yàn)操作混亂結(jié)果判定模糊等問題，為企業(yè)提供明確指引，也為監(jiān)管部門提供權(quán)威依據(jù)。2（三）專家視角：UDS試驗(yàn)在農(nóng)藥安全防控中的核心價(jià)值從毒理學(xué)專家視角，UDS試驗(yàn)?zāi)莒`敏檢測農(nóng)藥代謝產(chǎn)物的DNA損傷效應(yīng)。肝細(xì)胞是農(nóng)藥代謝主要場所，其UDS反應(yīng)直接反映體內(nèi)真實(shí)損傷水平。該試驗(yàn)可區(qū)分DNA損傷與修復(fù)，為判斷農(nóng)藥遺傳毒性等級(jí)提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)，避免潛在致癌致畸農(nóng)藥流入市場，是保障農(nóng)產(chǎn)品安全與人體健康的重要屏障。追本溯源：UDS試驗(yàn)的生物學(xué)本質(zhì)是什么？——從DNA損傷修復(fù)機(jī)制看懂標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)根基程序外DNA合成（UDS）：DNA損傷后的“緊急修復(fù)信號(hào)”正常細(xì)胞DNA合成多在S期，UDS是細(xì)胞DNA受損傷后，在非S期啟動(dòng)的修復(fù)性合成。當(dāng)農(nóng)藥及其代謝物造成DNA單鏈斷裂堿基損傷等，細(xì)胞會(huì)激活修復(fù)系統(tǒng)，通過UDS填補(bǔ)損傷區(qū)域。UDS試驗(yàn)正是通過檢測這一特殊合成過程，間接判斷受試物的DNA損傷潛力，這是標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)的核心生物學(xué)依據(jù)。（二）肝細(xì)胞為何成為UDS試驗(yàn)的“首選靶細(xì)胞”？A肝細(xì)胞具備兩大優(yōu)勢：一是富含藥物代謝酶系，能模擬農(nóng)藥在體內(nèi)的真實(shí)代謝過程，產(chǎn)生可能具有毒性的代謝產(chǎn)物；二是肝細(xì)胞增殖活性低，非S期DNA合成主要源于修復(fù)，可減少背景干擾。標(biāo)準(zhǔn)明確選用肝細(xì)胞，正是基于其代謝與修復(fù)特性，確保試驗(yàn)結(jié)果更貼近體內(nèi)實(shí)際情況。B（三）UDS試驗(yàn)與其他遺傳毒性試驗(yàn)的核心差異的科學(xué)依據(jù)01與Ames試驗(yàn)（體外基因突變）染色體畸變試驗(yàn)相比，UDS試驗(yàn)核心差異在于檢測“修復(fù)活性”而非直接檢測突變或畸變。它能發(fā)現(xiàn)未導(dǎo)致突變但已造成損傷的物質(zhì)，填補(bǔ)了“損傷-突變”鏈條中的檢測空白。標(biāo)準(zhǔn)通過這一獨(dú)特視角，為農(nóng)藥遺傳毒性評(píng)價(jià)提供更全面的科學(xué)支撐，避免漏判潛在風(fēng)險(xiǎn)。02試驗(yàn)設(shè)計(jì)的“黃金法則”：標(biāo)準(zhǔn)如何規(guī)范試驗(yàn)動(dòng)物與分組？——保障結(jié)果可靠性的前提條件深度剖析試驗(yàn)動(dòng)物的選擇：為何嚙齒類動(dòng)物成為“最優(yōu)解”？1標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定優(yōu)先選用大鼠小鼠等嚙齒類動(dòng)物，因其遺傳背景清晰繁殖周期短代謝途徑與人類有較高相似度，且相關(guān)毒理學(xué)數(shù)據(jù)積累豐富。嚙齒類肝細(xì)胞易獲取且體外培養(yǎng)存活良好，便于后續(xù)試驗(yàn)操作。同時(shí)，動(dòng)物需為健康成年個(gè)體，體重年齡符合要求，排除生理狀態(tài)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾，這是保障試驗(yàn)重復(fù)性的基礎(chǔ)。2（二）試驗(yàn)分組的“3+1”模式：陰性陽性劑量組與溶劑對(duì)照組的設(shè)計(jì)邏輯標(biāo)準(zhǔn)要求設(shè)置陰性對(duì)照（無損傷處理）陽性對(duì)照（已知DNA損傷劑）受試物劑量組及溶劑對(duì)照組。陰性對(duì)照確定正常UDS水平，陽性對(duì)照驗(yàn)證試驗(yàn)體系有效性，溶劑對(duì)照排除溶劑本身的影響，劑量組則需涵蓋從無作用劑量到明顯毒性劑量的范圍，確保能清晰判斷劑量-反應(yīng)關(guān)系，這一設(shè)計(jì)是科學(xué)評(píng)價(jià)受試物毒性的關(guān)鍵。（三）劑量設(shè)置的科學(xué)依據(jù)：如何避免“假陰性”與“假陽性”陷阱？01劑量設(shè)置需遵循“上限有毒性下限無作用”原則，通常設(shè)3-5個(gè)劑量組。上限以出現(xiàn)輕微毒性（如肝細(xì)胞輕度損傷）為標(biāo)準(zhǔn)，下限參考預(yù)試驗(yàn)結(jié)果或同類化合物數(shù)據(jù)。標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)調(diào)劑量梯度合理，避免因劑量過高導(dǎo)致細(xì)胞死亡，或劑量過低無法檢出損傷，通過科學(xué)劑量設(shè)計(jì)，最大限度降低試驗(yàn)誤差。02試劑與儀器的“精準(zhǔn)搭檔”：哪些關(guān)鍵物資決定試驗(yàn)成??？——標(biāo)準(zhǔn)中試劑配置與儀器要求的細(xì)節(jié)解讀（一）

放射性標(biāo)記試劑

：3H-胸腺嘧啶核苷的使用規(guī)范與安全要點(diǎn)3H-胸腺嘧啶核苷是UDS

試驗(yàn)核心試劑，

用于標(biāo)記修復(fù)合成的DNA

。標(biāo)準(zhǔn)明確其比活度

純度等指標(biāo)，

要求使用前校準(zhǔn)

。操作中需嚴(yán)格遵守放射性安全規(guī)定，做好防護(hù)與廢棄物處理

。

試劑儲(chǔ)存需避光

低溫，

防止降解，

確保標(biāo)記效率，

這直接影響后續(xù)放射自顯影結(jié)果的準(zhǔn)確性。固定液與染色液

：如何保障細(xì)胞形態(tài)與結(jié)果判讀的清晰度？標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定固定液選用甲醇-冰醋酸混合液，

能快速固定細(xì)胞，

保持細(xì)胞核形態(tài)完整；

染色液常用Giemsa

染液，

可清晰區(qū)分細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)

。

試劑配置需嚴(yán)格控制濃度與pH

值，

如Giemsa

染液需過濾去除雜質(zhì)，

避免染色不均

。

這些細(xì)節(jié)規(guī)范，

為顯微鏡下準(zhǔn)確識(shí)別UDS

陽性細(xì)胞提供了形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。核心儀器：

液閃計(jì)數(shù)器與顯微鏡的性能要求與校準(zhǔn)規(guī)范液閃計(jì)數(shù)器需具備高靈敏度，

能準(zhǔn)確檢測低水平放射性；

顯微鏡需配備油鏡，

放大倍數(shù)不低于1000倍，

且成像清晰

。

標(biāo)準(zhǔn)要求儀器定期校準(zhǔn)，

如液閃計(jì)數(shù)器需用標(biāo)準(zhǔn)源校準(zhǔn)計(jì)數(shù)效率，

顯微鏡需檢查光學(xué)系統(tǒng)穩(wěn)定性

。儀器性能的穩(wěn)定可靠，

是確保試驗(yàn)數(shù)據(jù)精準(zhǔn)的硬件保障。操作流程的“步步為營”：從染毒到制片的全流程規(guī)范是什么？——標(biāo)準(zhǔn)核心操作步驟的專家拆解體內(nèi)染毒：灌胃腹腔注射等染毒途徑的選擇與操作要點(diǎn)A標(biāo)準(zhǔn)推薦灌胃染毒，因其能準(zhǔn)確控制劑量，模擬農(nóng)藥經(jīng)口攝入場景。操作時(shí)需注意灌胃針插入深度，避免損傷食道；腹腔注射則需避開內(nèi)臟器官。染毒后需根據(jù)農(nóng)藥代謝動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，設(shè)置適宜的取樣時(shí)間，確保在肝細(xì)胞DNA修復(fù)活性高峰時(shí)取樣，這是捕獲UDS信號(hào)的關(guān)鍵時(shí)間窗口。B（二）肝細(xì)胞分離與培養(yǎng)：膠原酶消化法的實(shí)操規(guī)范與質(zhì)量控制采用膠原酶灌注法分離肝細(xì)胞，需嚴(yán)格控制灌流速度與膠原酶濃度，避免過度消化導(dǎo)致細(xì)胞破裂。分離后的肝細(xì)胞需用臺(tái)盼藍(lán)染色，活細(xì)胞率需≥80%。培養(yǎng)過程中需維持適宜溫度pH值與氣體環(huán)境，確保肝細(xì)胞貼壁生長并保持正常生理功能，細(xì)胞質(zhì)量直接決定試驗(yàn)?zāi)芊耥樌M(jìn)行。（三）放射自顯影制片：從涂片到顯影的“精細(xì)化操作”流程肝細(xì)胞涂片需均勻，避免細(xì)胞重疊；滴加3H-胸腺嘧啶核苷后，需在培養(yǎng)箱中孵育適宜時(shí)間，確保標(biāo)記充分。顯影過程需在暗室操作，嚴(yán)格控制顯影液溫度與時(shí)間，避免顯影過度或不足。定影后需沖洗干凈，防止殘留試劑影響染色效果，每一步操作的精細(xì)化是保障片質(zhì)量的核心。顯微鏡下的“密碼破譯”：如何準(zhǔn)確判斷UDS陽性結(jié)果？——標(biāo)準(zhǔn)中結(jié)果觀察與判定標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)操指南陽性細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征：細(xì)胞核銀顆粒分布的“識(shí)別密碼”UDS陽性細(xì)胞的核心特征是細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)密集的銀顆粒，而細(xì)胞質(zhì)銀顆粒極少。標(biāo)準(zhǔn)明確，陽性細(xì)胞細(xì)胞核銀顆粒數(shù)量顯著多于陰性對(duì)照細(xì)胞，且顆粒分布均勻。觀察時(shí)需排除S期細(xì)胞（整個(gè)細(xì)胞核彌漫性標(biāo)記），避免誤判。通過形態(tài)學(xué)特征識(shí)別，是初步篩選陽性結(jié)果的直觀方法。（二）結(jié)果判定的量化指標(biāo)：銀顆粒計(jì)數(shù)與grains/cell比值的計(jì)算方法標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定每樣本至少計(jì)數(shù)100個(gè)非S期肝細(xì)胞，記錄每個(gè)細(xì)胞的銀顆粒數(shù)，計(jì)算grains/cell比值（受試組與陰性對(duì)照組銀顆粒數(shù)比值）。當(dāng)某劑量組比值≥2.0，且與陰性對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異時(shí)，判定為UDS陽性。量化指標(biāo)的應(yīng)用，使結(jié)果判定更客觀，減少人為主觀誤差。（三）結(jié)果判讀的質(zhì)量控制：雙盲法與重復(fù)觀察如何提升可靠性？1為避免主觀偏差，標(biāo)準(zhǔn)推薦采用雙盲法判讀，即兩名觀察者在不知分組情況下獨(dú)立計(jì)數(shù)。若兩人結(jié)果差異較大，需共同復(fù)核確認(rèn)。同時(shí)，對(duì)陽性樣本需進(jìn)行重復(fù)觀察，確保結(jié)果穩(wěn)定可靠。這些質(zhì)量控制措施，進(jìn)一步提升了試驗(yàn)結(jié)論的可信度，為農(nóng)藥安全性評(píng)價(jià)提供堅(jiān)實(shí)數(shù)據(jù)支撐。2數(shù)據(jù)處理的“嚴(yán)謹(jǐn)之道”：統(tǒng)計(jì)學(xué)方法如何為試驗(yàn)結(jié)論保駕護(hù)航？——標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)處理要求的深度應(yīng)用數(shù)據(jù)整理的基礎(chǔ)：原始數(shù)據(jù)的記錄規(guī)范與異常值處理原則01標(biāo)準(zhǔn)要求原始數(shù)據(jù)需詳細(xì)記錄動(dòng)物信息劑量銀顆粒計(jì)數(shù)等，且記錄需可追溯。對(duì)于異常值（如明顯偏離均值的數(shù)據(jù)），需先排查是否為操作失誤導(dǎo)致，若為隨機(jī)誤差，需采用Grubbs法等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法判斷是否剔除。原始數(shù)據(jù)的規(guī)范整理，是后續(xù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的前提。02（二）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法的選擇：為何優(yōu)先選用方差分析與t檢驗(yàn)？01當(dāng)比較多組間銀顆粒數(shù)差異時(shí)，優(yōu)先選用方差分析（ANOVA），若方差分析顯示組間存在顯著差異，再進(jìn)行兩兩比較（如t檢驗(yàn)）。標(biāo)準(zhǔn)推薦使用SPSS等專業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件，確保計(jì)算精準(zhǔn)。選擇這些方法的原因在于其能有效分析計(jì)量資料的組間差異，且在毒理學(xué)試驗(yàn)中應(yīng)用成熟，結(jié)果認(rèn)可度高。02（三）統(tǒng)計(jì)學(xué)意義與生物學(xué)意義的結(jié)合：避免“唯數(shù)值論”的誤區(qū)01標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)調(diào)試驗(yàn)結(jié)論需結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)意義與生物學(xué)意義。若某劑量組雖有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但銀顆粒數(shù)比值未達(dá)2.0，且無劑量-反應(yīng)關(guān)系，需謹(jǐn)慎判定；反之，若有明確劑量-反應(yīng)關(guān)系，即使個(gè)別數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著，也需綜合考量。這種結(jié)合判斷的方式，能更科學(xué)地反映受試物的真實(shí)毒性。02質(zhì)量控制的“防火墻”：陰性與陽性對(duì)照該如何設(shè)置才有效？——規(guī)避試驗(yàn)誤差的關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)陰性對(duì)照的設(shè)置：如何確定“正常背景”的基準(zhǔn)值？1陰性對(duì)照選用未接觸任何損傷劑的動(dòng)物肝細(xì)胞，其UDS水平代表正常背景。標(biāo)準(zhǔn)要求陰性對(duì)照銀顆粒數(shù)需穩(wěn)定在一定范圍（如5-10grains/cell），若超出范圍，需排查試驗(yàn)體系是否存在問題（如試劑污染細(xì)胞活力低）。陰性對(duì)照的穩(wěn)定，是判斷受試物是否產(chǎn)生損傷的重要基準(zhǔn)。2（二）陽性對(duì)照的選擇標(biāo)準(zhǔn)：哪些試劑是“金標(biāo)準(zhǔn)”陽性參照物？標(biāo)準(zhǔn)推薦環(huán)磷酰胺甲磺酸甲酯等作為陽性對(duì)照劑，這些試劑是國際公認(rèn)的DNA損傷劑，能穩(wěn)定誘導(dǎo)UDS反應(yīng)。陽性對(duì)照需出現(xiàn)明確的UDS陽性結(jié)果，若陽性對(duì)照無效，說明試驗(yàn)體系存在缺陷（如細(xì)胞修復(fù)功能異常標(biāo)記試劑失效），試驗(yàn)需重新進(jìn)行，這是驗(yàn)證試驗(yàn)有效性的核心環(huán)節(jié)。（三）對(duì)照與受試組的同步操作：避免系統(tǒng)誤差的“關(guān)鍵一致性”原則所有對(duì)照組與受試組需在同一條件下同步操作，包括染毒時(shí)間細(xì)胞分離與培養(yǎng)條件制片與顯影流程等。標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)調(diào)“同步性”，是為了消除因操作時(shí)間環(huán)境因素等帶來的系統(tǒng)誤差。只有確保各組試驗(yàn)條件一致，才能準(zhǔn)確比較UDS水平差異，得出可靠的試驗(yàn)結(jié)論。行業(yè)變革下的適配性：UDS試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)如何應(yīng)對(duì)新型農(nóng)藥的挑戰(zhàn)？——未來5年試驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展趨勢預(yù)測（一）

新型農(nóng)藥的特性：

生物農(nóng)藥與納米農(nóng)藥對(duì)UDS

試驗(yàn)的新要求生物農(nóng)藥（如微生物農(nóng)藥）

代謝途徑復(fù)雜，

納米農(nóng)藥易在肝細(xì)胞蓄積，

傳統(tǒng)試驗(yàn)方法可能無法準(zhǔn)確檢測其DNA

損傷效應(yīng)

。

標(biāo)準(zhǔn)需進(jìn)一步明確這類農(nóng)藥的染毒劑

量

代謝產(chǎn)物檢測等要求

。

未來試驗(yàn)需結(jié)合農(nóng)藥特性，

優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)體系，

確保能捕捉到新型農(nóng)藥的獨(dú)特毒性信號(hào)。無放射性標(biāo)記技術(shù)：

UDS

試驗(yàn)的“綠色升級(jí)”方向與標(biāo)準(zhǔn)適配傳統(tǒng)放射性標(biāo)記存在安全與環(huán)保風(fēng)險(xiǎn)，

熒光標(biāo)記

免疫組化等無放射性技術(shù)成為發(fā)展方向

。

未來標(biāo)準(zhǔn)可能納入這些新技術(shù)，明確熒光探針選擇

檢測閾值等要求

。這類技術(shù)操作更安全，

且能實(shí)現(xiàn)定量分析，

適配高通量篩選需求，

將推動(dòng)UDS

試驗(yàn)在農(nóng)藥研發(fā)中的高效應(yīng)用。跨物種試驗(yàn)數(shù)據(jù)整合：

UDS

試驗(yàn)如何與人類健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)銜接？未來農(nóng)藥安全評(píng)價(jià)更注重“從動(dòng)物到人類”

的外推

。

UDS

試驗(yàn)需積累不同物種（如大鼠

犬

人類肝細(xì)胞）

的對(duì)比數(shù)據(jù)，

建立代謝途徑與修復(fù)活性的