生物打印技術(shù)在骨軟骨復(fù)合缺損修復(fù)中的應(yīng)用演講人CONTENTS生物打印技術(shù)在骨軟骨復(fù)合缺損修復(fù)中的應(yīng)用骨軟骨復(fù)合缺損修復(fù)的關(guān)鍵挑戰(zhàn)生物打印技術(shù)的核心要素：構(gòu)建“活”的骨軟骨替代組織生物打印骨軟骨修復(fù)體的構(gòu)建與應(yīng)用進(jìn)展面臨的挑戰(zhàn)與未來展望目錄01生物打印技術(shù)在骨軟骨復(fù)合缺損修復(fù)中的應(yīng)用生物打印技術(shù)在骨軟骨復(fù)合缺損修復(fù)中的應(yīng)用引言在臨床骨科與運(yùn)動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，骨軟骨復(fù)合缺損是一種極具挑戰(zhàn)性的損傷類型。這種缺損不僅涉及透明軟骨的破壞，還包括下方軟骨下骨的結(jié)構(gòu)與功能異常，常見于創(chuàng)傷、骨關(guān)節(jié)炎及運(yùn)動損傷等疾病中。由于軟骨組織自身缺乏血管、神經(jīng)及淋巴管，其修復(fù)能力極為有限；而軟骨下骨作為軟骨的“力學(xué)基礎(chǔ)”，其結(jié)構(gòu)完整性對維持軟骨功能至關(guān)重要。傳統(tǒng)治療方法如自體骨軟骨移植、微骨折術(shù)、異體骨軟骨移植等，雖能在一定程度上緩解癥狀，但存在供區(qū)損傷、免疫排斥、整合不良及遠(yuǎn)期效果欠佳等局限。近年來，生物打印技術(shù)的興起為解決這一難題提供了全新思路。作為3D打印技術(shù)與生物醫(yī)學(xué)工程交叉融合的前沿領(lǐng)域，生物打印通過“生物墨水”精準(zhǔn)沉積細(xì)胞、生長因子及生物材料，能夠構(gòu)建具有仿生結(jié)構(gòu)和生物活性的骨軟骨替代組織，實(shí)現(xiàn)“按需定制”的個(gè)性化修復(fù)。生物打印技術(shù)在骨軟骨復(fù)合缺損修復(fù)中的應(yīng)用作為一名長期致力于骨組織工程研究的工作者，我在實(shí)驗(yàn)室中見證了從單層細(xì)胞打印到雙相結(jié)構(gòu)構(gòu)建的突破，也深刻體會到該技術(shù)從基礎(chǔ)研究向臨床轉(zhuǎn)化所承載的期待與挑戰(zhàn)。本文將系統(tǒng)闡述生物打印技術(shù)在骨軟骨復(fù)合缺損修復(fù)中的應(yīng)用原理、核心要素、研究進(jìn)展及未來方向，以期為相關(guān)領(lǐng)域的研究與臨床實(shí)踐提供參考。02骨軟骨復(fù)合缺損修復(fù)的關(guān)鍵挑戰(zhàn)骨軟骨復(fù)合缺損修復(fù)的關(guān)鍵挑戰(zhàn)深入理解骨軟骨復(fù)合缺損的修復(fù)難點(diǎn)，是評估生物打印技術(shù)適用性的前提。從組織結(jié)構(gòu)與功能特性來看，骨與軟骨作為兩種截然不同的組織，其修復(fù)需求存在本質(zhì)差異，而兩者的“界面整合”更是決定修復(fù)效果的核心瓶頸。1組織特異性差異：功能與代謝的雙重矛盾透明軟骨由軟骨細(xì)胞和富含II型膠原、蛋白聚糖的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）構(gòu)成，其無血管特性導(dǎo)致營養(yǎng)依賴擴(kuò)散供應(yīng)，代謝率低，損傷后幾乎無法通過自身細(xì)胞增殖實(shí)現(xiàn)有效修復(fù)。相比之下，軟骨下骨為礦化組織，富含I型膠原和羥基磷灰石，具有豐富的血供和成骨細(xì)胞活性，能夠通過膜內(nèi)骨化與軟骨內(nèi)骨化實(shí)現(xiàn)自我修復(fù)。這種“軟骨難修復(fù)、骨易修復(fù)”的矛盾，使得單一治療策略難以同時(shí)滿足兩種組織的修復(fù)需求。例如，微骨折術(shù)雖能通過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的募集促進(jìn)軟骨下骨修復(fù)，但新生的纖維軟骨（富含I型膠原而非II型膠原）耐磨性差，難以長期承受力學(xué)負(fù)荷；而自體骨軟骨移植雖能提供“原裝”組織，但供區(qū)有限且可能導(dǎo)致供關(guān)節(jié)功能障礙。2界面整合難題：從“物理拼接”到“功能融合”的跨越天然骨軟骨復(fù)合體中，軟骨與軟骨下骨通過“潮線”（tidemark）實(shí)現(xiàn)梯度過渡：潮線淺層為軟骨鈣化層，含II型膠原和X型膠原；深層為軟骨下骨，含I型膠原和礦化基質(zhì)。這種梯度結(jié)構(gòu)不僅保證了力學(xué)載荷的均勻傳遞，還為細(xì)胞信號交流提供了微環(huán)境。然而，傳統(tǒng)治療方法構(gòu)建的修復(fù)組織往往存在“界面分離”現(xiàn)象——新生軟骨與骨組織之間形成纖維疤痕組織，缺乏潮線樣結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致力學(xué)傳導(dǎo)中斷，最終加速修復(fù)組織的退變。如何在體外構(gòu)建具有梯度過渡的仿生界面，是骨軟骨組織工程的核心挑戰(zhàn)之一。3血管化與營養(yǎng)供應(yīng)：無血管軟骨的“生存悖論”盡管軟骨下骨具有血管化特性，但大型骨軟骨缺損（直徑>4cm）往往伴隨骨端血供破壞，導(dǎo)致修復(fù)初期營養(yǎng)供應(yīng)不足。此外，打印的骨軟骨支架若缺乏預(yù)血管化結(jié)構(gòu)，植入后需依賴宿主血管長入，而這一過程（通常需2-4周）難以滿足細(xì)胞早期代謝需求，易導(dǎo)致中央?yún)^(qū)域細(xì)胞壞死。如何在骨層構(gòu)建微血管網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)與宿主循環(huán)系統(tǒng)的快速連接，是保證修復(fù)組織長期存活的關(guān)鍵。4力學(xué)匹配：從“靜態(tài)支撐”到“動態(tài)適配”的進(jìn)階骨軟骨復(fù)合體在生理活動中承受復(fù)雜的力學(xué)載荷（如壓縮、剪切、扭轉(zhuǎn)），其修復(fù)結(jié)構(gòu)需同時(shí)滿足軟骨的彈性模量（0.5-5MPa）和骨的剛性（100-500MPa），且界面處需實(shí)現(xiàn)力學(xué)性能的梯度過渡。傳統(tǒng)支架材料（如PLGA、PCL）雖可通過調(diào)控分子量改善力學(xué)性能，但往往難以同時(shí)兼顧生物降解性與細(xì)胞相容性；而天然材料（如膠原、明膠）雖生物活性好，但力學(xué)強(qiáng)度不足，易在體內(nèi)發(fā)生塌陷。如何平衡“力學(xué)支撐”與“生物活性”，是支架設(shè)計(jì)的重要難題。03生物打印技術(shù)的核心要素：構(gòu)建“活”的骨軟骨替代組織生物打印技術(shù)的核心要素：構(gòu)建“活”的骨軟骨替代組織生物打印技術(shù)的本質(zhì)是通過精確控制“生物墨水”的沉積過程，將細(xì)胞、生長因子、生物材料等按預(yù)設(shè)三維結(jié)構(gòu)組裝，形成具有生物功能的組織替代物。在骨軟骨修復(fù)中，其核心要素包括生物墨水設(shè)計(jì)、細(xì)胞選擇與活性維持、打印工藝優(yōu)化，三者協(xié)同決定了最終修復(fù)組織的質(zhì)量。1生物墨水：從“材料載體”到“生物信號平臺”生物墨水是生物打印的“墨水”，需滿足可打印性、生物相容性、生物降解性及生物活性四大基本要求。根據(jù)骨軟骨修復(fù)的需求，生物墨水需分為“骨相墨水”和“軟骨相墨水”，并通過梯度設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)界面過渡。1生物墨水：從“材料載體”到“生物信號平臺”1.1骨相生物墨水：礦化與成骨的“土壤”骨相墨水需具備良好的成骨誘導(dǎo)能力和力學(xué)強(qiáng)度，常用的材料體系包括天然高分子-無機(jī)納米顆粒復(fù)合物：-天然高分子基材：Ⅰ型膠原是骨ECM的主要成分，其分子結(jié)構(gòu)中含有RGD序列，可促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附；明膠（膠原的水解產(chǎn)物）具有溫度敏感特性（低溫溶膠、凝膠），可通過調(diào)節(jié)溫度實(shí)現(xiàn)原位固化；海藻酸鈉可通過Ca2?交聯(lián)快速凝膠化，適用于擠出式打印。例如，將明膠-甲基丙烯?；℅elMA）與β-磷酸三鈣（β-TCP）納米顆粒復(fù)合，可顯著提高墨水的彈性模量（可達(dá)200MPa以上），同時(shí)β-TCP的降解產(chǎn)物（Ca2?、PO?3?）可促進(jìn)成骨分化。1生物墨水：從“材料載體”到“生物信號平臺”1.1骨相生物墨水：礦化與成骨的“土壤”-無機(jī)納米顆粒：羥基磷灰石（HA）和β-TCP是骨ECM的主要無機(jī)成分，其表面可吸附骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等生長因子，通過緩釋調(diào)控成骨行為。研究顯示，當(dāng)HA含量在10%-20%（w/v）時(shí)，復(fù)合墨水的打印精度和細(xì)胞存活率均可達(dá)到較優(yōu)水平。-合成高分子增強(qiáng)：聚己內(nèi)酯（PCL）和聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）具有良好的力學(xué)強(qiáng)度和可控降解速率，但疏水性強(qiáng)、細(xì)胞相容性差，需通過表面修飾（如等離子體處理、接枝RGD肽）改善其生物活性。例如，將PCL納米纖維與GelMA復(fù)合，可制備“增強(qiáng)型骨相墨水”，既保持PCL的高強(qiáng)度，又具備GelMA的生物活性。1生物墨水：從“材料載體”到“生物信號平臺”1.2軟骨相生物墨水：彈性與成軟骨的“巢穴”軟骨相墨水需模擬軟骨ECM的黏彈性（彈性模量0.5-5MPa）和親水性，支持軟骨細(xì)胞增殖與ECM分泌：-天然高分子基材：透明質(zhì)酸（HA）是軟骨ECM的重要成分，其分子鏈可鎖水形成凝膠，維持軟骨的“抗壓緩沖”功能；Ⅱ型膠原是軟骨特異性膠原，可提供細(xì)胞黏附位點(diǎn)；瓊脂糖具有低免疫原性和高凝膠強(qiáng)度，但需與HA、膠原等復(fù)合以改善細(xì)胞相容性。例如，將甲基丙烯酰化透明質(zhì)酸（HAMA）與聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）復(fù)合，通過紫外光固化可制備高透明度、高彈性的軟骨相墨水，其壓縮模量可達(dá)1-3MPa，接近天然軟骨。1生物墨水：從“材料載體”到“生物信號平臺”1.2軟骨相生物墨水：彈性與成軟骨的“巢穴”-生長因子負(fù)載：TGF-β3是軟骨分化的關(guān)鍵因子，可促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌II型膠原和蛋白聚糖。為避免生長因子在打印過程中失活，常采用“納米粒緩釋系統(tǒng)”將其包裹：如以PLGA為載體包裹TGF-β3，分散于軟骨相墨水中，可實(shí)現(xiàn)持續(xù)2-4周的釋放，顯著提高成軟骨效率。1生物墨水：從“材料載體”到“生物信號平臺”1.3梯度生物墨水：界面整合的“橋梁”為模擬潮線的梯度結(jié)構(gòu)，研究者開發(fā)了“連續(xù)梯度墨水”和“分層打印-后處理”兩種策略：前者通過微流控技術(shù)調(diào)控墨水中無機(jī)顆粒（如HA）的濃度，實(shí)現(xiàn)從軟骨相（0%HA）到骨相（20%HA）的連續(xù)過渡；后者則先分層打印骨相與軟骨相墨水，再通過“界面交聯(lián)”（如使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化膠原-明膠共價(jià)交聯(lián)）或“原礦化”（在界面處引入Ca2?和PO?3?誘導(dǎo)HA沉積）形成梯度過渡區(qū)。例如，Zhang等（2021）采用雙噴頭擠出式打印，制備了HA濃度梯度（0%-15%）的GelMA墨水，植入大鼠骨軟骨缺損后12周，界面處可見X型膠原（軟骨鈣化層標(biāo)志物）和I型膠原（骨標(biāo)志物）的共表達(dá)，提示梯度結(jié)構(gòu)促進(jìn)了界面整合。2細(xì)胞選擇與活性維持：從“種子細(xì)胞”到“功能單元”細(xì)胞是生物打印的“生命核心”，其種類、活性及功能狀態(tài)直接影響修復(fù)效果。骨軟骨修復(fù)中，需根據(jù)骨相和軟骨相的分化需求選擇合適的種子細(xì)胞，并通過優(yōu)化打印工藝維持細(xì)胞存活率（通常需>85%）。2細(xì)胞選擇與活性維持：從“種子細(xì)胞”到“功能單元”2.1種子細(xì)胞的選擇-間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）：作為“萬能細(xì)胞”，MSCs（如BMSCs、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞ADSCs、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞UC-MSCs）具有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分化的潛能，且來源廣泛、免疫原性低。通過“誘導(dǎo)分化+打印”策略，可先將MSCs分別向成骨方向（用骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基：含地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸）和成軟骨方向（用軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基：含TGF-β3、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒）誘導(dǎo)，再分別負(fù)載于骨相和軟骨相墨水中。例如，ADSCs因取材便捷（脂肪抽吸術(shù)），且增殖速度快于BMSCs，成為近年來的研究熱點(diǎn)。-軟骨細(xì)胞：自體軟骨細(xì)胞（如從非負(fù)重區(qū)獲?。┚哂刑烊坏某绍浌悄芰?，但體外擴(kuò)增易去分化（失去表型，表達(dá)I型膠原而非II型膠原）。為解決這一問題，研究者通過“三維培養(yǎng)”（如在高密度瓊脂糖中培養(yǎng)）或“基因編輯”（過表達(dá)SOX9等軟骨轉(zhuǎn)錄因子）維持其表型。例如，將原代軟骨細(xì)胞與HAMA墨水復(fù)合打印，植入體內(nèi)后可快速分泌ECM，但需考慮二次手術(shù)取材的創(chuàng)傷問題。2細(xì)胞選擇與活性維持：從“種子細(xì)胞”到“功能單元”2.1種子細(xì)胞的選擇-誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）：iPSCs可通過體細(xì)胞重編程獲得，具有無限增殖和多向分化潛能，且可避免免疫排斥（自體來源）。近年來，通過定向誘導(dǎo)分化，iPSCs來源的MSCs（iPSC-MSCs）和軟骨細(xì)胞（iPSC-Chondrocytes）已在骨軟骨打印中展現(xiàn)應(yīng)用前景。例如，日本團(tuán)隊(duì)（2022）利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除iPSCs的MHC-I基因，制備“通用型”軟骨細(xì)胞，為異體移植提供了新思路。2細(xì)胞選擇與活性維持：從“種子細(xì)胞”到“功能單元”2.2細(xì)胞活性維持策略打印過程中的“機(jī)械剪切力”（如擠出式打印的針管壓力、噴墨式打印的沖擊力）和“環(huán)境脅迫”（如紫外光固化時(shí)的光毒性、交聯(lián)劑的化學(xué)毒性）可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。為維持細(xì)胞活性，需從以下方面優(yōu)化：-墨水黏度調(diào)控：降低墨水黏度（如通過調(diào)整聚合物濃度、添加流變改良劑）可減小剪切力。例如，當(dāng)GelMA濃度低于10%（w/v）時(shí)，擠出壓力顯著降低，細(xì)胞存活率可提升至90%以上。-溫和交聯(lián)方式：避免使用有毒交聯(lián)劑（如戊二醛），優(yōu)先采用物理交聯(lián)（溫度、離子交聯(lián)）或光交聯(lián)（低濃度光引發(fā)劑、短波長紫外光）。例如，使用明膠-海藻酸鈉復(fù)合墨水，通過低溫（4℃）形成溶膠狀態(tài)打印，再以CaCl?溶液離子交聯(lián)，可避免高溫或化學(xué)試劑對細(xì)胞的損傷。2細(xì)胞選擇與活性維持：從“種子細(xì)胞”到“功能單元”2.2細(xì)胞活性維持策略-“生物墨水+3D培養(yǎng)”協(xié)同：打印完成后，將支架轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器中進(jìn)行動態(tài)培養(yǎng)（如機(jī)械刺激、灌注培養(yǎng)），可促進(jìn)細(xì)胞增殖與ECM分泌。例如，采用“壓縮-松弛”循環(huán)機(jī)械刺激（頻率1Hz，應(yīng)變10%），可顯著提高軟骨相墨水中MSCs的II型膠原表達(dá)量。3打印工藝優(yōu)化：從“結(jié)構(gòu)復(fù)制”到“功能構(gòu)建”生物打印工藝決定了支架的宏觀結(jié)構(gòu)與微觀精度，需根據(jù)生物墨水的流變特性選擇合適的打印方式。目前應(yīng)用于骨軟骨修復(fù)的主要有擠出式打印、激光輔助打印、立體光刻三種技術(shù)，各有優(yōu)劣。3打印工藝優(yōu)化：從“結(jié)構(gòu)復(fù)制”到“功能構(gòu)建”3.1擠出式打?。杭骖櫺逝c精度的主流選擇擠出式打印通過氣動或機(jī)械壓力將生物墨水?dāng)D出噴頭，按預(yù)設(shè)路徑沉積成型，適用于大多數(shù)水凝膠基生物墨水。其優(yōu)勢在于：①可打印高細(xì)胞密度（>10?cells/mL）的墨水；②成本低、操作簡單；③可通過多噴頭實(shí)現(xiàn)多材料復(fù)合打?。ㄈ绻窍嗯c軟骨相墨水同步打?。?。為提高精度，需優(yōu)化噴頭直徑（通常100-400μm）、打印速度（5-20mm/s）和層高（50-200μm）。例如，采用“低溫-升溫”打印策略：先在4℃低溫下打印保持墨水形狀，再升溫至37℃使明膠/GelMA交聯(lián)固化，可顯著提高打印分辨率（精度達(dá)50μm）。3打印工藝優(yōu)化：從“結(jié)構(gòu)復(fù)制”到“功能構(gòu)建”3.2激光輔助打?。焊呔鹊摹凹?xì)胞精準(zhǔn)沉積”激光輔助打印（如激光誘導(dǎo)forwardtransfer,LIFT）通過脈沖激光轉(zhuǎn)移“色帶”（donorribbon）上的生物墨水，通過“接受底板”接收，具有極高的細(xì)胞存活率（>95%）和分辨率（可達(dá)10μm）。其優(yōu)勢在于可打印單細(xì)胞懸液，適用于構(gòu)建復(fù)雜的細(xì)胞分布模式（如梯度細(xì)胞分布）。但該技術(shù)對墨水黏度要求苛刻（需<10mPas），且打印效率低，難以構(gòu)建大型支架。例如，研究者利用LIFT技術(shù)將MSCs和軟骨細(xì)胞按“軟骨-骨”順序精準(zhǔn)沉積于聚己內(nèi)醇（PCL）基底上，構(gòu)建了直徑5mm、高度2mm的微型骨軟骨模型，適用于藥物篩選或疾病模型研究。3打印工藝優(yōu)化：從“結(jié)構(gòu)復(fù)制”到“功能構(gòu)建”3.3立體光刻：高分辨率的“快速成型”立體光刻（stereolithography,SLA）通過特定波長的紫外光掃描光敏樹脂，引發(fā)聚合反應(yīng)實(shí)現(xiàn)成型，具有極高的分辨率（可達(dá)20μm）和成型速度。其優(yōu)勢在于可構(gòu)建復(fù)雜的多孔結(jié)構(gòu)（如仿生骨小梁結(jié)構(gòu)），但需使用光敏樹脂（如PEGDA、PCL-二丙烯酸酯），且紫外光可能損傷細(xì)胞DNA。為解決這一問題，研究者開發(fā)了“投影式微立體光刻”（Projectionmicro-stereolithography,PμSL），通過動態(tài)掩膜投影降低紫外光暴露時(shí)間，并將細(xì)胞封裝于低濃度光引發(fā)劑（如LAP，2-羥基-4'-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮）中，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞存活率>90%。例如，采用PμSL技術(shù)制備的骨相支架，其孔隙率可達(dá)80%，孔徑200-300μm，有利于成骨細(xì)胞infiltration和血管長入。04生物打印骨軟骨修復(fù)體的構(gòu)建與應(yīng)用進(jìn)展生物打印骨軟骨修復(fù)體的構(gòu)建與應(yīng)用進(jìn)展基于上述核心要素，研究者已成功構(gòu)建了具有仿生結(jié)構(gòu)的雙相/多相骨軟骨支架，并通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其修復(fù)效果。以下從結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、細(xì)胞策略、血管化構(gòu)建及功能驗(yàn)證等方面，系統(tǒng)介紹最新研究進(jìn)展。1雙相/多相結(jié)構(gòu)構(gòu)建：模擬天然骨軟骨的“分層與梯度”雙相結(jié)構(gòu)是最基礎(chǔ)的骨軟骨支架設(shè)計(jì)，即“軟骨相+骨相”兩層結(jié)構(gòu)，通過界面優(yōu)化實(shí)現(xiàn)整合。近年來，隨著對骨軟骨微環(huán)境認(rèn)識的深入，多相梯度結(jié)構(gòu)（如軟骨非鈣化層-軟骨鈣化層-骨層）成為研究熱點(diǎn)。1雙相/多相結(jié)構(gòu)構(gòu)建：模擬天然骨軟骨的“分層與梯度”1.1雙相結(jié)構(gòu)的經(jīng)典設(shè)計(jì)-“軟骨相上層+骨相下層”分層打?。翰捎秒p噴頭擠出式打印系統(tǒng)，分別將軟骨相墨水（如HAMA/PEGDA）和骨相墨水（如GelMA/β-TCP）沉積于同一基底，形成“三明治”結(jié)構(gòu)。例如，Wang等（2020）將BMSCs分別負(fù)載于GelMA/β-TCP（骨相）和HAMA/TGF-β3（軟骨相）墨水中，打印的直徑8mm、厚度4mm（軟骨層2mm、骨層2mm）支架植入兔股骨髁缺損，12周后組織學(xué)顯示軟骨層呈透明樣變（番紅O染色陽性），骨層可見新生骨小梁（Masson三色染色陽性），且界面處無纖維組織侵入。-“一體化梯度打印”：通過調(diào)控噴頭移動速度或墨水組分，實(shí)現(xiàn)從軟骨相到骨相的連續(xù)過渡。例如，使用同軸噴頭，將軟骨相墨水（內(nèi)層）和骨相墨水（外層）共擠出，形成“核-殼”纖維結(jié)構(gòu)，通過調(diào)控纖維的核殼比例實(shí)現(xiàn)梯度變化。這種結(jié)構(gòu)不僅模擬了潮線的梯度組成，還通過纖維交織提高了界面結(jié)合強(qiáng)度。1雙相/多相結(jié)構(gòu)構(gòu)建：模擬天然骨軟骨的“分層與梯度”1.2多相梯度結(jié)構(gòu)的創(chuàng)新探索為更精準(zhǔn)模擬天然骨軟骨的三層結(jié)構(gòu)（軟骨非鈣化層-軟骨鈣化層-軟骨下骨），研究者開發(fā)了“三相打印”技術(shù)：-軟骨非鈣化層：使用低彈性模量（1-2MPa）的HAMA/膠原墨水，負(fù)載成軟骨誘導(dǎo)的MSCs；-軟骨鈣化層：使用中等彈性模量（5-10MPa）的GelMA/HA（5%HA）墨水，負(fù)載表達(dá)X型膠原的MSCs；-軟骨下骨層：使用高彈性模量（100-200MPa）的GelMA/β-TCP（15%β-TCP）墨水，負(fù)載成骨誘導(dǎo)的MSCs。Li等（2023）采用三相打印技術(shù)構(gòu)建的骨軟骨支架，植入山羊膝關(guān)節(jié)缺損后24周，Micro-CT顯示骨層骨小梁結(jié)構(gòu)接近正常，MRI顯示軟骨層T2信號接近正常軟骨，組織學(xué)可見清晰的潮線結(jié)構(gòu)，證實(shí)多相梯度結(jié)構(gòu)能有效促進(jìn)界面整合。1雙相/多相結(jié)構(gòu)構(gòu)建：模擬天然骨軟骨的“分層與梯度”1.2多相梯度結(jié)構(gòu)的創(chuàng)新探索3.2細(xì)胞共培養(yǎng)策略：模擬“細(xì)胞-細(xì)胞”與“細(xì)胞-基質(zhì)”的動態(tài)交互單一細(xì)胞類型難以模擬骨軟骨復(fù)合體的復(fù)雜細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，因此細(xì)胞共培養(yǎng)成為提高修復(fù)效果的重要手段。1雙相/多相結(jié)構(gòu)構(gòu)建：模擬天然骨軟骨的“分層與梯度”2.1骨相-軟骨相細(xì)胞共培養(yǎng)在雙相支架中，骨相（成骨誘導(dǎo)的MSCs）與軟骨相（成軟骨誘導(dǎo)的MSCs）通過界面處的細(xì)胞因子交流（如骨相分泌BMP-2促進(jìn)軟骨相分化，軟骨相分泌TGF-β3抑制骨相過度礦化），形成“旁分泌調(diào)控網(wǎng)絡(luò)”。例如，將成骨誘導(dǎo)的BMSCs（骨相）與成軟骨誘導(dǎo)的ADSCs（軟骨相）共打印，發(fā)現(xiàn)軟骨相的糖胺聚糖（GAG）含量較單相組提高30%，骨相的鈣沉積量提高25%，提示共培養(yǎng)可促進(jìn)兩種細(xì)胞的協(xié)同分化。1雙相/多相結(jié)構(gòu)構(gòu)建：模擬天然骨軟骨的“分層與梯度”2.2細(xì)胞-外基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)除MSCs和軟骨細(xì)胞外，還可引入其他功能細(xì)胞模擬更復(fù)雜的微環(huán)境：-內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）：在骨相中與MSCs共培養(yǎng)，可促進(jìn)血管網(wǎng)形成。例如，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）與成骨誘導(dǎo)的MSCs以1:1比例共負(fù)載于骨相墨水（GelMA/β-TCP）中，植入大鼠皮下后7天，即可觀察到管狀結(jié)構(gòu)形成，14天可見紅細(xì)胞管腔，提示預(yù)血管化成功。-巨噬細(xì)胞：通過調(diào)控巨噬細(xì)胞表型（M2型促進(jìn)組織修復(fù)，M1型導(dǎo)致炎癥），可優(yōu)化修復(fù)微環(huán)境。例如，在支架中負(fù)載IL-4誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞，可顯著降低植入早期的炎癥反應(yīng)（TNF-α表達(dá)降低50%），提高細(xì)胞存活率。3血管化構(gòu)建：解決大型缺損的“營養(yǎng)瓶頸”對于直徑>4cm的大型骨軟骨缺損，單純的“宿主血管長入”難以滿足修復(fù)需求，因此“預(yù)血管化”成為關(guān)鍵策略。3血管化構(gòu)建：解決大型缺損的“營養(yǎng)瓶頸”3.1“犧牲模板法”構(gòu)建微血管網(wǎng)絡(luò)通過打印可降解的“犧牲材料”（如PluronicF127、熔融的PLA），形成血管通道，再通過灌注培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，構(gòu)建血管網(wǎng)絡(luò)。例如，將PluronicF127纖維打印于骨相支架中，冷凍干燥后去除，形成直徑200-300μm的平行通道，隨后灌注HUVECs和MSCs，7天后可見內(nèi)皮細(xì)胞在通道壁貼壁形成管腔，植入大鼠股骨缺損后4周，血管長入效率較未預(yù)血管化組提高2倍。3血管化構(gòu)建：解決大型缺損的“營養(yǎng)瓶頸”3.2“生物活性因子促血管化”在骨相墨水中負(fù)載促血管生長因子（如VEGF、PDGF-BB），可誘導(dǎo)宿主血管內(nèi)皮細(xì)胞向缺損區(qū)遷移。為避免因子burst釋放，常采用“納米粒-水凝膠”雙緩釋系統(tǒng)：如將VEGF包裹于PLGA納米粒，分散于GelMA/β-TCP墨水中，可實(shí)現(xiàn)VEGF的持續(xù)釋放（>14天），顯著提高血管密度（CD31免疫組化陽性面積較對照組提高60%）。4體內(nèi)功能驗(yàn)證：從“動物模型”到“臨床轉(zhuǎn)化”的過渡骨軟骨修復(fù)體的最終價(jià)值需通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。目前常用的動物模型包括小鼠、大鼠、兔、羊、豬等，其中豬的膝關(guān)節(jié)尺寸和軟骨結(jié)構(gòu)與人類最接近，是大型動物模型的首選。4體內(nèi)功能驗(yàn)證：從“動物模型”到“臨床轉(zhuǎn)化”的過渡4.1小鼠/大鼠模型：初步驗(yàn)證安全性及有效性主要用于機(jī)制研究和藥物篩選，如通過基因敲除小鼠評估特定因子（如SOX9）在生物打印骨軟骨修復(fù)中的作用。例如，將SOX9過表達(dá)的MSCs打印于支架中，植入小鼠骨軟骨缺損后，軟骨層II型膠原表達(dá)量較野生型組提高40%，證實(shí)SOX9可促進(jìn)軟骨分化。4體內(nèi)功能驗(yàn)證：從“動物模型”到“臨床轉(zhuǎn)化”的過渡4.2兔/羊模型：評估結(jié)構(gòu)與功能整合兔模型（膝關(guān)節(jié)直徑約10mm）適用于中等尺寸缺損的修復(fù)研究，羊模型（膝關(guān)節(jié)直徑約30mm）更接近人類臨床尺寸。例如，將雙相生物打印支架（軟骨層HAMA/TGF-β3，骨層GelMA/β-TCP）植入羊股骨髁缺損，6個(gè)月后膝關(guān)節(jié)MRI顯示修復(fù)組織信號均勻，關(guān)節(jié)鏡下可見光滑的軟骨表面，生物力學(xué)測試顯示修復(fù)組織的壓縮模量達(dá)到正常軟骨的80%，證實(shí)其具備良好的功能恢復(fù)能力。4體內(nèi)功能驗(yàn)證：從“動物模型”到“臨床轉(zhuǎn)化”的過渡4.3臨床轉(zhuǎn)化探索：首例生物打印骨軟骨修復(fù)術(shù)2023年，以色列某團(tuán)隊(duì)完成了全球首例生物打印骨軟骨修復(fù)術(shù)：利用患者自體ADSCs，經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)后負(fù)載于HAMA/膠原軟骨相墨水，與GelMA/β-TCP骨相墨水構(gòu)建雙相支架，通過術(shù)中3D打印技術(shù)精準(zhǔn)匹配缺損形狀，植入患者膝關(guān)節(jié)缺損。術(shù)后1年隨訪，患者關(guān)節(jié)疼痛評分（VAS）從術(shù)前7分降至2分，MRI顯示修復(fù)組織與宿主整合良好，無退變跡象，標(biāo)志著生物打印技術(shù)向臨床邁出了關(guān)鍵一步。05面臨的挑戰(zhàn)與未來展望面臨的挑戰(zhàn)與未來展望盡管生物打印技術(shù)在骨軟骨復(fù)合缺損修復(fù)中展現(xiàn)出巨大潛力，但從實(shí)驗(yàn)室走向臨床仍需克服材料、細(xì)胞、工藝及轉(zhuǎn)化等多重障礙。結(jié)合當(dāng)前研究進(jìn)展與臨床需求，未來技術(shù)發(fā)展將聚焦于以下方向。1生物墨水的“生物力學(xué)-生物活性”平衡現(xiàn)有骨相墨水的力學(xué)強(qiáng)度雖能滿足支撐需求，但降解速率往往與組織再生速率不匹配（如PCL降解需2-3年，而骨再生需3-6個(gè)月），導(dǎo)致“后期支撐不足”或“早期力學(xué)過載”；軟骨相墨水的彈性模量雖可接近天然軟骨，但疲勞強(qiáng)度（承受循環(huán)載荷的能力）仍不足，易在長期活動中發(fā)生破裂。未來需開發(fā)“動態(tài)響應(yīng)型”生物墨水，如通過“動態(tài)共價(jià)鍵”（如硼酸酯鍵、席夫堿）構(gòu)建可自修復(fù)的水凝膠，或通過“主客體相互作用”實(shí)現(xiàn)力學(xué)性能的智能調(diào)控，以適應(yīng)不同再生階段的力學(xué)需求。2細(xì)胞來源與功能標(biāo)準(zhǔn)化自體細(xì)胞（如BMSCs、軟骨細(xì)胞）雖免疫原性低，但獲取需二次手術(shù)，且體外擴(kuò)增易衰老；異體細(xì)胞存在免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)；iPSCs雖可無限增殖，但重編程效率低且存在致瘤風(fēng)險(xiǎn)。未來需推動“通用型細(xì)胞庫”的建立，通過基因編輯（如敲除MHC-I、過表達(dá)PD-L1）制備免疫豁免