AES降解菌的分離鑒定及降解特性研究ScreeningandIdentificationofAlcoholEtherSulfate（AES）

DegradingBacteriaandStudyonBiodegradationCharacteristics目錄摘要 AES降解菌的分離鑒定及降解特性研究摘要：AES作為陰離子表面活性劑的代表物，其污染的治理已成為環(huán)保工作者的研究熱點之一。本文從湖南麗臣實業(yè)股份有限公司污水處理池污泥中分離篩選到一株能以AES為唯一碳源生長并能高效降解AES的細菌Z-8。通過形態(tài)學觀察、生理生化試驗、16SrRNA序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對該菌株進行鑒定，探討了AES初始濃度、溫度、初始pH值和發(fā)酵時間對AES降解率的影響。利用紅外光譜技術探索了AES的降解機理以及AES對降解菌細胞特性的影響。結(jié)果表明，菌株Z-8被鑒定為Pseudomonas假單胞菌Z-8。AES適宜的降解條件為初始濃度400mg/L、培養(yǎng)溫度35℃、初始pH值9.0、發(fā)酵時間12h的條件下。在此條件下，AES降解率達到99.59%。通過紅外檢測AES的初步降解經(jīng)過了-CH2-以及-C-O-S-鍵的斷裂，菌體表面的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和多糖參與了AES的降解過程。關鍵詞：AES；Pseudomonasknackmussii；16SrDNA；降解特性；降解機理ScreeningandIdentificationofAlcoholEtherSulfate（AES）

DegradingBacteriaandStudyonBiodegradationCharacteristicsAbstract.Asarepresentativeofanionicsurfactants,AEShasbecomeoneoftheenvironmentalists'researchtopicalpointsforthetreatmentofpollution.Inthisarticle,abacterium,calledZ-8,whichcangrowwithAESastheonlycarbonsourceanddegradeAESinhighefficiency,wasisolatedfromthesewagesludgeofHunanLixinIndustrialCo.ThestrainwasidentifiedbyMorphologicalobservations,physiologicalandbiochemicaltests,16SrRNAsequenceanalysisandphylogenetictreeconstruction,andtheninvestigatetheinfluenceofAESinitialconcentration,fermentationtemperature,initialpHandculturetimeonthedegradationrateofAES,andtoinvestigatethedegradationmechanismofAESandtheeffectsofAESoncellularpropertiesofdegradedbacteria.

TheresultsshowedthatstrainZ-8wasidentifiedasPseudomonasknackmussiiZ-8.ThesuitabledegradationconditionswereAESataninitialconcentrationof400mg/L,incubationtemperatureof35°C,initialpHof9.0andfermentationtimeof12h.Undertheseconditions,theAESdegradationratereached99.59%.TheprimarydegradationofAESbyinfrareddetectionunderwent-CH2-aswellas-C-O-S-bondbreaks,andlipids,proteinsandpolysaccharidesonthesurfaceofthebacteriumwereinvolvedinthedegradationprocessofAES.Keywords.AES；Pseudomonasknackmussii；16SrDNA；characteristicofdegradation;mechanismofdegradation1前言1.1AES的簡介AES（全名為脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉）是烷基硫酸鹽的改性產(chǎn)物，屬于一種陰離子表面活性劑，具有發(fā)泡、去污、分散、乳化等特性。由于其在親水基和疏水基中間嵌入了聚氧乙烯鏈，因而兼具非離子和陰離子表面活性劑的一些特性，可取代配方中使用的烷基硫酸鹽（SDS）而廣泛用于餐具洗滌劑、香波和浴液等洗滌產(chǎn)品中，在紡織、金屬加工、農(nóng)藥和造紙等工業(yè)領域亦有應用[1]，預測脂肪醇醚硫酸鹽的市場規(guī)模到2024年將增加至15億美元[2]。1.2AES的危害近年來隨著AES的廣泛使用，其在生態(tài)環(huán)境中的含量逐年升高，對環(huán)境的影響表現(xiàn)在：AES進入土壤和水體后，能在水體中產(chǎn)生大量的持久性泡沫，阻斷水體與空氣的交換，減少水體中的溶解氧，造成對生態(tài)環(huán)境的污染[3]。AES對河流生態(tài)進行毒理性研究結(jié)果表明AES在高濃度下對蜉蝣類群和蛤蜊種群都有顯著損害，影響了水體中魚類和水生無脊椎動物的生長[4-6]。用小鼠模擬人體接觸AES的方式研究結(jié)果表明，長期接觸和使用AES可使小鼠毛發(fā)脫落數(shù)量顯著增加，末梢血中中性粒細胞百分數(shù)明顯降低、淋巴細胞百分數(shù)明顯增加以及降低外周血血清中超氧化物歧化酶的含量，使小鼠體內(nèi)抗氧化能力的降低，從而影響其正常生理功能[7-8]。1.3AES生物降解的研究性進展生物降解是指在微生物的作用下將表面活性劑分子分解成為微生物的代謝物或細胞物質(zhì)，并釋放CO2及H2O的過程。微生物降解法具備其獨特的優(yōu)點如降解快、費用低、二次污染少等。Swisher[9]對表面活性劑生物降解性與結(jié)構(gòu)的關系研究表明，表面活性劑的生物降解性主要由疏水基團決定，并隨著疏水基線性程度增加而增加，末端季碳原子會顯著降低降解度，表面活性劑的親水基性質(zhì)對生物降解度有次要的影響。其降解需要經(jīng)歷三個過程：初級降解，包括吸附、裂解兩個過程，經(jīng)此階段，AES表面活性基本喪失；下一階段是生物降解產(chǎn)物能被環(huán)境接受，不會造成二次污染；最終階段是AES被降解為CO2和水等無機質(zhì)和其他代謝物[10]。近年來，國內(nèi)外學者對主要從好氧和厭氧生物降解兩大類角度研究AES微生物降解途徑，而好氧生物降解的研究則更為集中。1.3.1AES好氧生物降解好氧生物處理法用得最普遍的是活性污泥法[10]，李遵峰等[11]用半連續(xù)活性污泥（SCAS）法測定表面活性劑的生物降解度，結(jié)果表明，AES在有氧條件下最終生物降解率為95.5%。周大鵬等[12]采用BOD5/COD來評價陰離子表面活性劑的生物降解性，結(jié)果表明28天AES生物降解率為70%。1.3.2AES厭氧生物降解已有研究較少關注到AES在厭氧條件下的生物降解。近來的研究確定了AES的初級厭氧生物降解率[1]。董慶斌等[13]在厭氧條件下，研究不同試驗條件對AES生物降解性的影響。MadsenT等[14]在厭氧條件下選用高濃度的細菌培養(yǎng)液來測定底物比率，結(jié)果表明在厭氧條件下，AES降解更為充分。1.4本文的研究意義及目的AES作為一種應用廣泛的陰離子表面活性劑，既易溶于水又溶于油脂，因具備良好的去污、起泡、乳化等性能以及性質(zhì)溫和、不傷皮膚等特點，是餐具洗滌劑、沐浴露、洗發(fā)液、洗手液、洗衣液等洗滌劑中的主要組成成分[16]。由于AES在人們?nèi)粘Ｉ钪械膽妹嬖黾?，其安全性也愈發(fā)受到消費者和研究工作者的重視。關于AES的生物降解及降解機理的相關研究，國內(nèi)外鮮有文獻報道。本文采用選擇分離法從日用化工廠污水中分離能高效分解AES的細菌，并對分離菌株進行鑒定，探討AES降解條件并初步探討其降解機理，試圖為AES的生物降解提供理論依據(jù)和技術支持。1.5主要研究內(nèi)容AES降解菌的分離純化和鑒定從日用化工廠污水中分離篩選出一株AES降解菌，并對其進行形態(tài)學、生理生化特性觀察以及分子學鑒定。AES降解菌的降解特性研究AES降解菌在降解AES的過程中，AES初始濃度、溫度、pH、降解時間等條件對AES降解菌降解率的影響。菌株的降解機理的初步研究通過紅外光譜儀考察，降解過程AES官能團以及化學鍵以及菌體表面官能團的變化，初步探究AES生物降解機理。1.6技術路線圖富集、篩選一株能高效降解A富集、篩選一株能高效降解AES的菌株（亞甲基藍法確定其降解率）AESAES降解菌的分離純化和鑒定革蘭氏染色、生理生化分析、革蘭氏染色、生理生化分析、16SrDNA分析鑒定菌株研究A研究AES初始濃度、初始pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間對菌體降解AES能力的影響菌株PseudomonasknackmussiiZ-8對AES的降解特性紅外光譜法考察降解A紅外光譜法考察降解AES前后，菌體表面官能團的變化情況菌株菌株PseudomonasknackmussiiZ-8對AES的降解機理紅外光譜法考察降解A紅外光譜法考察降解AES前后，檢測降解產(chǎn)物中AES化學鍵的變化圖1技術路線圖Fig1Technologyroadmap2材料與方法2.1試驗材料2.1.1分離樣品取自于湖南麗臣實業(yè)股份有限公司污水處理池中的污泥，置于無菌容器中，立即帶回實驗室進行AES降解菌的富集和分離。2.1.2主要試劑表1實驗試劑Table1Experimentreagent名稱純度生產(chǎn)廠家牛肉浸膏BP上海盛思生化科技有限公司蛋白胨BP上海盛思生化科技有限公司瓊脂BP合肥博美生物科技有限公司氯化鈉AR國藥集團化學試劑有限公司七水合硫酸鎂AR國藥集團化學試劑有限公司七水合氯化亞鐵AR國藥集團化學試劑有限公司磷酸氫二鉀AR國藥集團化學試劑有限公司氯化鉀AR國藥集團化學試劑有限公司2.1.3主要儀器設備表2實驗儀器設備Table2Experimentinstrumentsandequipment名稱型號生產(chǎn)廠家冰箱BCD-286H青島海爾股份有限公司電子天平TMP-510湘儀天平儀器設備有限公司電子分析天平AL204梅特勒—托利多儀器有限公司恒溫培養(yǎng)箱MJ-160C上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠高溫高壓滅菌鍋SS-325TOMY.KOGYO.CO,LTD立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-75KBS上海博迅實業(yè)有限公司單人單面超凈工作臺SW-CJ-1B（U）蘇州設備凈化有限公司pH計pHS-3C上海霄盛儀器制造有限公司雙目光學生物顯微鏡EB-81BF麥克奧迪實業(yè)集團有限公司高速冷凍離心機CR21G無錫凱派克斯科技有限公司紫外可見分光光度計752上海光譜儀器有限公司DNA電泳槽DYCP-31DN北京六一儀器廠穩(wěn)壓電泳儀DYY-5北京六一儀器廠凝膠成像儀FR980上海復日科技儀器有限公司PCR儀2720thermalcyclerAppliedBiosystems真空冷凍干燥機CM-25S常州市恒邁干燥設備有限公司紅外分光光度計alpha德國布魯克2.1.4培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基：AES0.4g，NH4Cl3g，MgSO4·7H2O0.25g，KCl0.25g，K2HPO41g，F(xiàn)eCl2·4H2O0.001g，H2O1L，pH7.2-7.4。121℃滅菌25min。篩選培養(yǎng)基：與富集培養(yǎng)基相同，另加2%的瓊脂。121℃滅菌25min。斜面培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂20.0g，H2O1L，pH7.0-7.2。121℃滅菌25min[15]。液體種子培養(yǎng)基：同斜面培養(yǎng)基成分，除去瓊脂粉。發(fā)酵培養(yǎng)基：成分同富集培養(yǎng)基2.2試驗方法2.2.1AES降解菌的分離純化（1）采樣：污泥樣品取自于湖南麗臣實業(yè)股份有限公司污水處理池。（2）AES降解菌的富集：稱取5.00g污泥樣品接入100mL富集培養(yǎng)基中，于37℃、170r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中富集培養(yǎng)3d。（3）AES降解菌的初篩：按照10倍稀釋法[15]將富集液進行稀釋，取不同稀釋度的稀釋液0.1mL涂布于篩選培養(yǎng)基平板中央，涂布均勻，于37℃細菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)至長出單菌落。挑取單菌落于選擇培養(yǎng)基表面劃線純化，待顯微鏡鏡檢時菌體形態(tài)一致，將其保存并編號。（4）AES降解菌的復篩：將保存于斜面的菌株分別接種到液體種子培養(yǎng)基中，37℃，170r/min條件下振蕩培養(yǎng)24h后，以2%（V/V）的接種量接入AES濃度為400mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在相同條件下恒溫振蕩培養(yǎng)48h，分別測定培養(yǎng)基中AES的含量，計算AES的降解率[16]。（5）菌種保存：將菌種接種在斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24h后放置4℃冰箱保存。2.2.2菌株形態(tài)觀察與鑒定（1）菌體顯微形態(tài)觀察：菌體經(jīng)革蘭氏染色后進行光學顯微鏡觀察。（2）菌落形態(tài)特征：制備菌懸液，按一定倍數(shù)稀釋后涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基表面，然后將固體培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察菌落形狀、大小、顏色、表面等各方面特征。（3）生理生化特性：按照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[17]進行生理生化鑒定。包括接觸酶實驗、葡萄糖氧化發(fā)酵實驗、糖或醇類發(fā)酵實驗、甲基紅實驗、V-P測定實驗、淀粉水解實驗、纖維素分解實驗、硝酸鹽還原實驗、亞硝酸鹽還原實驗、反硝化實驗、吲哚實驗[16]。（4）16SrDNA序列分析：菌株在種子液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，采用上海生工生物工程Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒進行DNA提取。以提取的基因組DNA為模板，擴增16SrDNA基因片段。正向引物序列：27F：5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3',反向引物序列：1492R.5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR擴增體系和反應條件如表3、表4所示，測序由上海生工生物工程有限公司完成。通過BLAST程序\h(http.//www.ncbi.nlm\h./BLAST/Blast.cgi)將16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，并提交給GenBank。采用NJ法，用MEGA7.0.26構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。表3PCR反應體系Table3PCRreactionsystemPCR反應體系濃度體積模板DNA20～50ng/μL0.5μL引物F10μmol/L0.5μL引物R10μmol/L0.5μLdNTP（mix）2.5mmol/L1μLTaqBuffer（withMgCl2）10×2.5μLTaq酶5U/μL0.2μLddH2O19.8μL表4PCR反應條件Table4PCRreactionconditions序號程序溫度時間1預變性94℃4min2變性94℃45s3退火55℃45s4延伸72℃1min5循環(huán)2to435cycles6修復延伸72℃10min7保存4℃—2.2.3培養(yǎng)方法斜面培養(yǎng)：將保存的菌種接種于斜面培養(yǎng)基表面，37℃恒溫培養(yǎng)24-36h。備用[16]。液體種子培養(yǎng)：將活化后的斜面菌種接種于液體培養(yǎng)基中，37℃，170r/min條件下恒溫培養(yǎng)24h[16]。發(fā)酵培養(yǎng)：按2%（V/V）的接種量將培養(yǎng)好的液體種子接種于裝有100mL/300mL三角瓶的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，170r/min條件下恒溫培養(yǎng)48h，測定培養(yǎng)液中AES含量，并計算AES降解率[16]。三次重復。2.2.4菌株Z-8對AES降解特性研究（1）AES初始濃度對菌株Z-8降解AES的影響在培養(yǎng)基中分別添加400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L、1200mg/L、1400mg/L的AES，37℃、170r/min條件培養(yǎng)48h，測定培養(yǎng)液中AES含量，計算AES的降解率。（2）培養(yǎng)溫度對菌株Z-8降解AES的影響：基于上述試驗結(jié)果，將三角瓶分別置于28℃、30℃、32℃、35℃和37℃條件下，170r/min恒溫振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)48h，其它條件不變，測定培養(yǎng)液中AES含量，并計算AES的降解率。（3）培養(yǎng)基初始pH值對菌株Z-8降解AES的影響：在上述試驗結(jié)果的基礎上，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值分別為3.0、5.0、7.0、9.0和11.0，其它條件不變，48h后測定培養(yǎng)液中AES含量，并計算AES的降解率。（4）培養(yǎng)時間對菌株Z-8降解AES的影響：在上述試驗結(jié)果的基礎上，每隔3h取樣測定三角瓶中發(fā)酵液的AES含量，從而計算AES的降解率，到培養(yǎng)48h為止。2.2.5AES含量測定測定方法參照國標GB/T15818-2018[17]，稍加改動。AES標準曲線的制作:操作如表5表5AES標準曲線制作步驟Table5AESstandardcurvepreparationsteps操作藥品空白12345—AES含量(mg)00.030.060.090.120.15加液AES溶液(mL)03.06.09.012.015.0ddH2O(mL)10097.094.091.088.085.0振蕩靜置亞甲基藍溶液(mL)25萃取三氯甲烷(mg)15，重復萃取三次振蕩靜置磷酸二氫鈉溶液(mL)50萃取三氯甲烷(mg)5，重復萃取三次定容三氯甲烷(mg)至100紫外分光光度計測OD650（2）發(fā)酵液預處理4℃，在10000r/min、15min條件下離心發(fā)酵液，取上清液，測定AES的含量。以不接種為對照。（3）AES含量測定準確移取適量體積（降解初始取樣量2mL～5mL，降解過程取樣量可以增至50mL）的降解液于250mL分液漏斗中，加水至100mL,以下步驟按表5“加入亞甲基藍25mL……再用三氯甲烷定容”程序進行[18]。AES降解率計算公式如下：D=(m0-mn)/m0×100%式中：D為第n小時后AES的降解率，%；m0為初始表面活性劑質(zhì)量，mg；mn為第n小時后表面活性劑質(zhì)量，mg[13]。2.2.6AES降解菌降解過程中表面官能團及降解產(chǎn)物變化AES降解菌菌體表面官能團變化：將AES降解菌在發(fā)酵培養(yǎng)基降解0h、12h和24h后，于4℃，10000r/min條件下離心15min后分別取沉淀和上清部分。用于檢測菌體表面官能團的沉淀部分需先置于－57℃~－60℃真空冷凍干燥儀中干燥24h；而用于檢測降解產(chǎn)物化學鍵變化的上清部分略去此步驟。再加入干燥的光譜純溴化鉀研磨、壓片取片狀干燥物放置在紅外光譜儀的檢測臺上，將得到的試驗結(jié)果與上海有機所紅外譜圖數(shù)據(jù)庫：http.///scdb/main/irs-introduce.asp檢索的AES譜圖結(jié)果進行對比分析，檢測降解前后AES降解菌表面基團以及降解產(chǎn)物的變化［18］。3結(jié)果與分析3.1菌株篩選3.1.1菌株初篩通過篩選、純化后，得到8株能以AES為唯一碳源生長的菌株，結(jié)果見表6。表6初篩結(jié)果Table6Theresultsofinitialscreening編號顯微形態(tài)菌落形態(tài)泡沫消失時間1）（h）Z-1球狀紅色，圓形，表面濕潤、光滑，中央稍凸起48Z-2球狀淡黃色，圓形，表面濕潤、光滑，菌落扁平96Z-3長桿狀黃色，圓形，表面濕潤、光滑，中央稍凸起72Z-4長桿狀淡黃色，卵圓形，表面干燥、光滑，菌落扁平108Z-5長桿狀灰色，圓形，表面干燥、光滑，中央稍凸起96Z-6短桿狀乳白色，圓形，表面干燥、粗糙，菌落扁平96Z-7短桿狀乳白色，圓形，表面濕潤、光滑，菌落扁平48Z-8短桿狀灰白色、圓形、表面濕潤、光滑、中央稍凸起12注：結(jié)果統(tǒng)計時以初始泡沫降解75%視為全部降解。Notes.Degradationof75%oftheinitialfoamisregardedastotaldegradation.3.1.2菌株復篩將8株菌株分別接種到400mg/L的AES發(fā)酵培養(yǎng)基中，并于37℃、170r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)48h后，分別測定培養(yǎng)液中AES的含量，并計算AES的降解率。結(jié)果見圖2。所分離的菌株中，相較于其它菌株（降解率均低于60%）。菌株Z-8對AES的降解率最高，為99.67%。因此選擇菌株Z-8為試驗菌株進行后續(xù)試驗[16]。 圖2AES降解菌復篩結(jié)果Fig2ThescreeningresultsofAES-degradingstrain3.2菌株鑒定結(jié)果3.2.1形態(tài)鑒定結(jié)果菌株Z-8在以AES為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基上菌落呈灰白色、圓形、表面潮濕、邊緣整齊、不透明,結(jié)果見圖3。在光學顯微鏡下菌體為短桿狀、無芽孢、革蘭氏染色為陰性，結(jié)果見圖4[16]。圖4圖4細胞形態(tài)Fig4Cellmorphology圖3菌落形態(tài)Fig3Colonymorphology3.2.2生理生化試驗生理生化指標見表7。表7菌株Z-8生理生化指標Table7PhysiologicalandbiochemicalindicatorsofstrainZ-8項目實驗結(jié)果項目實驗結(jié)果甘露醇＋丁二酸鈉－乳糖－麥芽糖＋蔗糖－草酸－木糖＋甲基紅（M.R）－山梨醇－硝酸鹽還原＋葡萄糖＋反硝化－果糖＋乙酸氧化－甘油－產(chǎn)氨試驗＋檸檬酸鈉－注：“+”表示陽性，“-”表示陰性。Notes:"+"indicatespositivewhile"-"indicatesnegative.3.2.316SrDNA序列分析結(jié)果菌株Z-8的電泳后凝膠成像分析，結(jié)果見圖4。將其16SrDNA測序結(jié)果在NCBI中比對分析，序列全長為1404bp，與假單胞菌屬序列相似度最高。選擇Pseudomonasaeruginosa(GQ926936.1)作為外類群，采用NJ法，用MEGA7.0構(gòu)建與假單胞菌屬部分模式種16SrDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖6[16]。表明菌株Z-8與Pseudomonasknackmussii(HG322950.1)的親緣關系最近，同處一個進化分支。綜合菌落形態(tài)特征、生理生化特征和16SrDNA基因序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果，將菌株Z-8初步鑒定為PseudomonasknackmussiiZ-8[16]。30001000300010005001500Z-8Marker圖5菌株Z-8的16SrDNAPCR擴增結(jié)果Fig5PCRamplificationresultofZ-816SrDNA圖6菌株Z-8的16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig6PhylogenetictreeofZ-8basedonthe16SrDNAsequence3.3發(fā)酵條件篩選結(jié)果3.3.1AES標準曲線利用Excel軟件作AES的標準曲線，以AES含量為橫坐標，650nm處的吸光值為縱坐標，結(jié)果如圖7，y=7.0827x+0.0172，R2=0.9971，因此，該標準曲線具有良好的線性關系和擬合度。圖7AES標準曲線Fig7AESstandardcurve3.3.2AES初始濃度對菌株Z-8降解能力的影響從圖8可以看出，在AES初始濃度400mg/L-1400mg/L條件下菌株Z-8均對其具有一定的降解能力。當菌株Z-8在AES濃度為400mg/L-600mg/L時，其降解率無明顯差異且均在98%以上，當AES濃度為600mg/L時，生長量達到了0.63。且在400mg/L時，對AES具有最佳的去除能力，去除率為99.38%。在AES濃度超過800mg/L，菌株對AES的降解能力急劇下降。在AES初始濃度達到1400mg/L時，AES的降解率僅為2.87%，生長量為0.13。表明菌株Z-8在高濃度的AES條件下生長受到顯著的抑制作用，從而影響其降解效率。可能是由于高濃度的AES促進了菌體對胞內(nèi)離子的釋放，同時抑制對胞外離子的利用[18]。因此，選擇培養(yǎng)基中AES初始濃度為400mg/L進行后續(xù)研究。圖8菌株Z-8降解率及生長量隨不同初始AES濃度的變化曲線Fig8CurveofdegradationrateandgrowthofstrainZ-8withdifferentinitialAESconcentration3.3.3溫度對菌株Z-8降解能力的影響細胞內(nèi)代謝酶的活性、細胞膜的結(jié)構(gòu)與功能受溫度影響，從而影響微生物的生長和代謝。酶只有在最適溫度下活性最強，細胞內(nèi)酶促反應在溫度過高或過低都會降低甚至完全停止，導致細胞內(nèi)物質(zhì)合成受阻。從圖9可以看出，菌株Z-8對溫度的適應性范圍較廣：在溫度為30～37℃時，菌株Z-8對AES的降解率均在99%以上[16]。當培養(yǎng)溫度為35℃時，AES的生長量最大，達到0.72。隨著培養(yǎng)溫度的降低，AES的降解率和生長量均緩慢下降。表明低溫影響了菌株Z-8的生長。因此，選擇培養(yǎng)溫度為35℃進行后續(xù)試驗。圖9菌株Z-8降解率及生長量隨不同溫度的變化曲線Fig9CurveofdegradationrateandgrowthofstrainZ-8withdifferenttemperature3.3.4初始pH對菌株Z-8降解能力的影響由圖10結(jié)果可知，菌株Z-8對AES的降解率受培養(yǎng)基pH值影響較大，在一定的pH值閾值內(nèi)，隨著培養(yǎng)基初始pH值的升高，AES的降解率也隨之提高。當培養(yǎng)基初始pH值為9.0時，AES降解率達到99.47%，生長量也達到了0.73。但培養(yǎng)基初始pH值超過9.0，AES降解率顯著下降。分析原因為細胞膜電荷、細胞間物質(zhì)交換以及細胞結(jié)構(gòu)受環(huán)境酸堿度影響，從而影響了細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、代謝酶系的活性的改變，從而降低細胞對AES的利用率。圖10菌株Z-8降解率及生長量隨不同pH值的變化曲線Fig10CurveofdegradationrateandgrowthofstrainZ-8withdifferentPhvalue3.3.5培養(yǎng)時間對菌株Z-8降解能力的影響由圖11可知，菌株Z-8對AES降解率和生長量均隨著培養(yǎng)時間的延長而提高。當培養(yǎng)時間為12h時，AES降解率達到99.59%，生長量達到0.49[16]。而當繼續(xù)延長培養(yǎng)時間，菌株Z-8對AES降解率間并不存在明顯差異。因此，選擇培養(yǎng)時間為12h。圖11菌株Z-8降解率及生長量隨培養(yǎng)時間的變化曲線Fig11CurveofdegradationrateandgrowthofstrainZ-8withculruraltime3.4降解機理3.4.1AES降解菌降解過程中菌體表面官能團變化紅外吸收光譜是一種根據(jù)分子內(nèi)部原子間的相對振動和分子轉(zhuǎn)動等信息來確定物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和鑒別化合物的分析方法，也是研究生物降解有機物的活性基團變化的常用方法[19]。降解AES0h、12h和24h的菌體在官能團區(qū)和指紋區(qū)均有吸收峰，結(jié)果見表8。降解0h的菌體官能團吸收帶在4000～2900cm-1和1800～550cm-1，降解12h和24h的菌體官能團吸收帶在1700～480cm-1。圖12顯示，與降解0d的菌體相比，降解12h和24h的菌體表面官能團吸收帶在4000～2900cm-1消失，代表脂質(zhì)CH、CH2、CH3基團，O-H伸縮振動或胺鹽-NH2伸縮振動，證明脂質(zhì)參與AES降解[20]。在1800～480cm-1出現(xiàn)了官能團吸收帶的偏移，代表了羧基C=O、COO-、多糖P=O、酰胺C-N伸縮振動以及蛋白質(zhì)特有的C-N-C剪式振動，證明菌體表面的蛋白質(zhì)和多糖參與了AES降解[21]。3.4.2AES降解菌降解過程中降解產(chǎn)物的檢測試樣的紅外光譜圖見圖13。1245cm-1(Vc-o-s)為AES中硫酸酯的特征吸收峰,并且1125cm-1處出現(xiàn)了醚鍵(Vc-o-c)的吸收峰。隨著AES的降解，可以看到在24h時1245cm-1處的峰明顯消失，表明化合物AES中C-O-S鍵的斷裂[22]；同時2850cm-1的吸收峰也消失了，表明在降解過程中亞甲基-CH2斷裂，推測AES的脂肪鏈發(fā)生了斷裂。表8菌體降解AES的吸收峰波數(shù)和基團Table8FunctionalgroupsforbiodegradationofAESbyPseudomonasknackmussiiZ-8吸收峰基團及振動形式3000～2700cm-1飽和-CH-、-CH2-、-CH3基團3400～3200cm-1O-H伸縮振動760～1660cm-1胺鹽-NH2伸縮振動1600～1550cm-1、1410cm-1羧基C=O伸縮振動1250cm-1COO-、多糖P=O、酰胺C-N伸縮振動小于650cm-1蛋白質(zhì)特有的C-N-C剪式振動400030002000100000.2400030002000100000.21.00降解12h菌體降解24h菌體降解0h菌體Wavenumber/cm-1透過率率率11462.2透過率透過率2966.7540.01406.72966.7540.01406.713371337.81555.1555.63440.03440.0圖12AES降解過程中菌體表面官能團的變化40003000200010000Wavenumber/cm-112h降解產(chǎn)物40003000200010000Wavenumber/cm-112h降解產(chǎn)物0h降解產(chǎn)物24h降解產(chǎn)物1.000.2透過率112512452850透過率112512452850圖13AES降解產(chǎn)物的變化Fig13ChangeofAESdegradationproducts4討論與結(jié)論4.1討論本文從富含陰離子表面活性劑的污泥中篩選到一株能以AES為唯一碳源且高效降解菌株Z-8，根據(jù)16SrDNA基因序列分析比對及形態(tài)學觀察和生理生化特征，將其鑒定為PseudomonasknackmussiiZ-8[16]。對AES降解特性試驗表明菌株Z-8能適應高濃度醇醚硫酸鹽，并且對溫度適應性較廣。顯示了該菌對含較高濃度AES廢水的處理中具有極好的應用前景。目前已經(jīng)報道污水中陰離子表面活性劑降解方法主要有震蕩培養(yǎng)法、活性污泥模擬法、開放（密閉）法等[23]。對于從自然界分離純化微生物并應用于陰離子表面活性劑的降解主要集中于十二烷基苯磺酸鈉（LAS）的降解研究。國內(nèi)研究工作者分離出了能有效降解LAS的芽孢桿菌（Bacillussp.）[24]、黃單胞菌(Xanthomonassp.)[25]、可動苯基桿菌

（Phenylobacteriummobile）[26]等，張蔚文等[25]發(fā)現(xiàn)LAS降解菌株利用LAS的能力于降解質(zhì)粒的存在有關，并且國外發(fā)現(xiàn)的主要是假單胞菌（Pseudomonasputida），與本文分離得到的菌株結(jié)果一致，表明假單胞菌（Pseudomonasputida）在陰離子表面活性劑降解方面存在較好的應用前景。目前關于AES的研究工作集中在對其生物降解性及生態(tài)學毒性評價上。王鵬等[27]概述了AES生物降解性的指標以及研究方法和手段。禾治宇等[28]發(fā)現(xiàn)AES在生態(tài)毒性上表現(xiàn)出比脂肪醇硫酸鹽更強的毒性，且生物降解速度相對兩種最常見的陰離子表面活性劑(LAS、SDS)較慢。但對AES生物降解特性及降解機理的研究較少，僅有董慶斌等[14]用活性污泥對AES進行了降解特性的研究，而從自然界分離微生物并對微生物進行鑒定和研究AES微生物降解特性的研究，國內(nèi)外未見文獻報道。本文探究各因素（溫度、AES初始濃度、pH、培養(yǎng)時間）影響AES降解菌菌株降解能力。其中溫度影響AES降解能力試驗結(jié)果表明，菌株PseudomonasknackmussiiZ-8對溫度具有較好的適應性，且在35℃時降解能力最佳，這與董慶斌等[13]研究結(jié)果一致。菌株PseudomonasknackmussiiZ-8在弱堿性條件下（pH為9）降解率達到最大，而菌株Plesiomonassp.90-3、Plesiomonassp.90-4在pH為8時具備較好的降解陰離子表面活性劑能力[25]，與本研究結(jié)果相似。本文在AES降解機理方面的并未進行深層次的闡述，在檢測AES降解產(chǎn)物時采用紅外光譜技術，發(fā)現(xiàn)AES的初級降解經(jīng)過C-O-S鍵的斷裂，這一結(jié)果與董慶斌[14]紅外光譜檢測活性污泥初級降解AES的結(jié)果一致，但這一結(jié)果仍是對AES降解機理的初步解析。而鄭力文[29]等則推測AES乳化成分的親水基團里都含有孤對電子和帶部分負電荷的“類氫鍵”有利于初級降解的吸附階段。紀樹蘭[26]在實時監(jiān)測LAS降解的紫外光譜圖后，結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜探究了一株可動苯基桿菌對LAS的生物降解機理。白瓊潔[19]在探究表面活性劑對菌體的影響時，結(jié)合了原子力顯微鏡和掃描電子顯微鏡分析菌體表面變化。4.2結(jié)論與展望4.2.1結(jié)論從湖南麗臣實業(yè)股份有限公司污水處理池污泥中分離得到一株高效降解AES的菌株，其降解率達到了99.59%；根據(jù)形態(tài)觀察、生理生化分析及16SrDNA序列分析，菌株與Pseudomonasknackmussii（登錄號：HG322950.1）有99%的相似性，命名為Z-8。采用單因素試驗法研究了菌株Z-8在不同因素下對AES的降解能力，菌株Z-8的降解率隨其生長量同步增長，AES適宜的降解條件為初始濃度400mg/L、培養(yǎng)溫度35℃、初始pH值9.0、發(fā)酵時間12h，對其降解率達99.59%。紅外光譜技術結(jié)果顯示，菌株PseudomonasknackmussiiZ-8菌體表面的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和多糖均參與了AES降解。起作用的主要官能團為：-CH-、-CH2-、-CH3、O-H、-NH2、C=O、COO-、P=O、C-N、C-N-C。AES降解過程中主要經(jīng)過C-O-S鍵以及-CH2的斷裂，推測AES初步降解脂肪鏈發(fā)生了斷裂。4.2.1展望隨著人們生活水平及環(huán)保意識的提高，生物降解法愈發(fā)成為了一項低成本、高效率的選擇。目前已報道的文獻以評價AES的生物降解性和毒性為主，根據(jù)環(huán)境微生物學的發(fā)展趨勢，微生物降解的研究工作側(cè)重于從分子生物學層面定位微生物中參與降解的相關基因、降解產(chǎn)物的檢測以及降解機制的解析。因此，今后AES的研究的熱點將主要集中在：AES的不同生物降解途徑的探索；以及AES的降解過程代謝產(chǎn)物的形成機制、主要參與降解反應的微生物菌屬以及動力學。參考文獻[1]周大鵬,黃亞茹,秦志榮.脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鹽生物降解和環(huán)境安全性評價[J].日用化學品科學，2010，33(07)：33-38.[2]張紅梅.國外資訊[J].中國洗滌用品工業(yè)，2018，(02)：98-100.[3]俞凌云,孫冬梅,張新申.陰離子表面活性劑測定的方法研究[J].皮革科學與工程,2009，19(02)：72-76.[4]BelangerSE,MeiersEM,BauschRG.Directandindirectecotoxicologicaleffectsofalkylsulfateandalkylethoxysulfateonmacroinvertebratesinstreammesocosms[J].Aquatictoxicology，1995，33(1).：65-87.[5]WolfWD,FeijtelT.Terrestrialriskassessmentforlinearalkylbenzenesulfonate(LAS)insludge-amendedsoils[J].Chemosphere，1998，36(6):1319-1343.[6]ShcherbakovaVA,LaurinavichiusKS,AkimenkoVK.Toxiceffectofsurfactantsandprobableproductsoftheirbiodegradationonmethanogenesisinananaerobicmicrobialcommunity[J].Chemosphere，1999，39(11)：1861-1870.[7]全立群,鮑柱仁,王秀敏.脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鹽(AES)殘留對小鼠超氧化物歧化酶SOD的影響[J].中國繼續(xù)醫(yī)學教育，2015，7(14)：53-54.[8]全立群.脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鹽(AES)的殘留對小鼠的影響[J].中國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè),2013，10(33)：11-12.[9]SwisherRD.SurfactantBiodegration[M].NewYork:MarcelDekkerInc，1987.[10]王學川,任龍芳,強濤濤,等.皮革加脂劑的降解性及評價方法[J].中國皮革，2006，(01)：46-48+50.[11]李遵峰,張高勇,趙郁梅,等.半連續(xù)活性污泥法測定表面活性劑的好氧生物降解度[J].日用化學工業(yè)，2007，(02)：85-87+96.[12]周大鵬,黃亞茹,符林健,等.幾種陰離子表面活性劑生物降解性評價[J].日用化學品科學，2014，37(01)：27-31.[13]董慶斌,趙永紅,張廣良,等.醇醚硫酸鹽(AES)生物降解性的研究[J].印染助劑，2017，34(09)：32-35.[14]MadsenT,RasmussenD.Studiesonthefateoflinearalkylbenzenesulfonatesinsludgeandsludge-amendedsoil[J].TheClerReview，1999，(05)：14-19.[15]杜連祥主編.工業(yè)微生物學實驗技術[M].天津:天津科學技術出版社,1992.[16]曾典,唐啟玲,龐志宇,等.醇醚硫酸鹽（AES）降解菌的篩選