生物類似藥雜質定性與定量分析方法進展演講人生物類似藥雜質定性與定量分析方法進展壹引言貳生物類似藥雜質的分類與特性叁雜質定性分析方法進展肆雜質定量分析方法進展伍技術挑戰(zhàn)與未來展望陸目錄結論柒01生物類似藥雜質定性與定量分析方法進展02引言引言生物類似藥作為原研生物藥的“相似版本”，其研發(fā)與上市的核心在于實現(xiàn)與原研藥在質量、安全性和有效性上的“高度相似”。然而，生物藥分子量大、結構復雜（如單抗通常由兩條重鏈和兩條輕鏈通過二硫鍵連接，分子量約150kDa），且對生產(chǎn)工藝敏感，極易在表達、純化、儲存等環(huán)節(jié)產(chǎn)生多種雜質。這些雜質若未被有效控制，可能引發(fā)免疫原性反應、降低藥效甚至導致嚴重不良反應。因此，雜質定性與定量分析是生物類似藥質量控制的重中之重，也是貫穿研發(fā)始終的關鍵環(huán)節(jié)。在從事生物類似藥質量研究的十余年中，我深刻體會到：雜質分析不僅是實驗室中的技術操作，更是連接“工藝設計-質量表征-臨床應用”的橋梁。隨著分析技術的飛速發(fā)展和監(jiān)管要求的日益嚴格，雜質分析已從傳統(tǒng)的“指標檢測”向“過程解析-風險控制-功能關聯(lián)”的縱深方向演進。本文將結合行業(yè)實踐，系統(tǒng)梳理生物類似藥雜質分類與特性，重點闡述定性與定量分析方法的最新進展，并探討技術挑戰(zhàn)與未來方向，以期為同行提供參考。03生物類似藥雜質的分類與特性生物類似藥雜質的分類與特性雜質分析的前提是明確“雜質是什么”。根據(jù)來源、結構及性質，生物類似藥雜質通?？煞譃槿箢?，每一類雜質的分析策略均存在顯著差異。1產(chǎn)品相關雜質產(chǎn)品相關雜質是生物類似藥中最復雜、最具挑戰(zhàn)的一類雜質，其產(chǎn)生與藥物分子自身的結構異質性和工藝過程直接相關。根據(jù)分子層面變化，可進一步細分為：1產(chǎn)品相關雜質1.1結構變體雜質結構變體是指藥物分子一級結構、空間構象或翻譯后修飾（PTM）發(fā)生改變而產(chǎn)生的異構體，是生物類似藥“相似性”評價的核心指標之一。-電荷異構體：如天冬酰胺脫酰胺化（Asndeamidation）產(chǎn)生天冬氨酸或異天冬氨酸，導致分子負電荷增加；N端焦谷氨酸化（pyroglutamation）或C端賴氨酸切除（lysineclipping）則改變分子電荷分布。此類雜質通常通過離子交換色譜（IEX）或毛細管等電聚焦（cIEF）分離，其含量直接影響藥物與靶點結合的親和力。-大小變體：包括二聚體、多聚體（由分子間疏水作用或二硫鍵錯配形成）以及片段（如酸/堿水解或蛋白酶切割產(chǎn)生的輕鏈/重鏈片段）。體積排阻色譜（SEC）是傳統(tǒng)檢測方法，但對于高聚體（>1%）的定量，需結合SEC-MALS（多角度激光散射）以準確測定分子量分布。1產(chǎn)品相關雜質1.1結構變體雜質-疏水性變體：如甲硫氨酸氧化（Metoxidation）導致疏水性降低，或色氨酸氧化（Trpoxidation）引入極性基團，此類雜質常用反相色譜（RPC）分離，其保留行為與氧化程度直接相關。1產(chǎn)品相關雜質1.2翻譯后修飾（PTM）雜質PTM是生物藥區(qū)別于化學藥的重要特征，也是生物類似藥與原研藥“相似性”的關鍵體現(xiàn)。常見的PTM雜質包括：-糖基化修飾：如N-糖鏈的巖藻糖基化（afucosylation）、唾液酸化（sialylation）或甘露糖基化（mannosylation），影響藥物抗體依賴細胞介導的細胞毒性（ADCC）效應。此類雜質需通過肽圖分析結合LC-MS/MS鑒定，或使用HILIC（親水作用色譜）分離后聯(lián)用質譜。-二硫鍵錯配：如鏈間二硫鍵錯接（形成重鏈-輕鏈錯配物）或鏈內二硫鍵異構，可能導致分子構象改變。非還原型CE-SDS（毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉凝膠電泳）是常用檢測方法，但對于復雜錯配模式，需結合酶解肽圖與質譜解析。1產(chǎn)品相關雜質1.2翻譯后修飾（PTM）雜質-其他修飾：如糖基化（O-GlcNAc化）、磷酸化、羥基化等，通常含量較低（<0.1%），但對藥物穩(wěn)定性或活性可能產(chǎn)生顯著影響，需高靈敏度方法（如PRM-parallelreactionmonitoring）進行精準分析。2工藝相關雜質工藝相關雜質來源于生產(chǎn)過程中的引入，主要包括：-宿主細胞蛋白（HCP）：來自宿主細胞（如CHO、NS0）的蛋白雜質，可能引發(fā)免疫原性。其檢測依賴于ELISA試劑盒，但試劑盒的覆蓋范圍（通常針對CHO細胞HCP庫約5000種蛋白）和交叉反應性是關鍵挑戰(zhàn)，需結合2D電泳或LC-MS/MS進行補充鑒定。-宿主細胞DNA（HCD）：殘留的宿主細胞基因組DNA，具有潛在致瘤性。傳統(tǒng)方法為qPCR，但靈敏度受引物設計限制；新型數(shù)字PCR（dPCR）可實現(xiàn)絕對定量，且對DNA片段長度適應性更強。-工藝添加劑殘留：如吐溫80（Tween80，用于減少聚集）、蛋白A（用于親和層析）、抗生素（如氨芐西林）等。吐溫80需通過LC-ELSD（蒸發(fā)光散射檢測）或LC-MS定量，蛋白A殘留則采用ELISA或生物層干涉技術（BLI）檢測。2工藝相關雜質-培養(yǎng)基組分相關雜質：如胎牛血清（FBS）中的動物源蛋白，或無血清培養(yǎng)基中的生長因子，需通過特異性抗體或質譜方法進行篩查。3降解產(chǎn)物雜質降解產(chǎn)物雜質是生物藥在儲存或運輸過程中因環(huán)境因素（溫度、光照、pH）或化學/酶促反應產(chǎn)生的雜質，主要包括：-化學降解：如氧化（Met、Trp、Tyr殘基）、水解（肽鍵斷裂、Asn/Gln脫酰胺）、外消旋化（Cys殘基）等。此類雜質通常具有結構明確但含量低（ppm級）的特點，需高分辨率質譜（如Orbitrap）結合同位素標記技術進行鑒定。-物理聚集：如可溶性聚集體（直徑50-1000nm）或亞可見顆粒（1-100μm），可能引發(fā)血管栓塞或免疫反應。除SEC外，微流控電阻脈沖傳感（MFI）和流式成像（FlowImaging）技術可更全面表征顆粒分布。-微生物污染：如細菌內毒素（熱原）、真菌或支原體，需采用鱟試劑法（LAL）或PCR方法檢測，其限度控制直接關系到臨床用藥安全。04雜質定性分析方法進展雜質定性分析方法進展雜質定性分析的核心是“識別雜質結構”，為工藝優(yōu)化和質量控制提供依據(jù)。隨著質譜技術、色譜技術和生物信息學的融合，定性分析已從“已知雜質鑒定”向“未知雜質解析”和“痕量雜質表征”縱深發(fā)展。1色譜-質譜聯(lián)用技術：結構解析的核心工具色譜-質譜聯(lián)用技術（LC-MS/MS、GC-MS）憑借高分離能力與高靈敏度的優(yōu)勢，已成為生物類似藥雜質定性的“金標準”。1色譜-質譜聯(lián)用技術：結構解析的核心工具1.1液相色譜-高分辨質譜（LC-HRMS）的應用LC-HRMS（如Q-TOF、Orbitrap）通過高分辨率（>60,000）和高質量精度（<5ppm），可實現(xiàn)雜質分子量的精準測定，并結合碎片離子解析一級結構。例如，在研究某款阿達木單抗類似藥時，我們發(fā)現(xiàn)SEC色譜圖中保留時間略主峰前的小峰（含量約0.05%），通過OrbitrapMS檢測到分子量比主峰缺失115.06Da（對應C5H7NO2，即天冬氨酸殘基），結合肽圖分析（胰酶酶解后LC-MS/MS鑒定），最終確認該雜質為重鏈第49-50位天冬氨酸缺失變體。對于糖基化修飾，LC-HRMS可結合酶解（如PNGaseF去除N-糖鏈）實現(xiàn)糖基化位點和糖型分布的鑒定。例如，通過MALDI-TOFMS分析某曲妥珠單抗類似藥的Fc段糖鏈，發(fā)現(xiàn)其巖藻糖基化比例比原研藥低3%，這一發(fā)現(xiàn)直接推動了工藝中巖藻糖基轉移酶（FUT8）敲除工藝的優(yōu)化。1色譜-質譜聯(lián)用技術：結構解析的核心工具1.2多維色譜-質譜聯(lián)用技術對于復雜基質中的痕量雜質（如HCP或降解產(chǎn)物），傳統(tǒng)一維色譜分離能力不足，需結合多維色譜技術。例如，SCX-RPC（陽離子交換-反相色譜）二維聯(lián)用可分離復雜肽段混合物：第一維SCX按肽段電荷分離，第二維RPC按疏水性分離，最終通過LC-MS/MS鑒定肽段序列。我們在某依那西普類似藥研究中，采用此方法鑒定出3種含量均低于0.01%的HCP，均來自宿主細胞的熱休克蛋白（HSP70），為工藝除雜提供了明確方向。2毛細管電泳-質譜聯(lián)用技術：電荷異構體的精準解析毛細管電泳（CE）憑借高分辨率（可分離電荷差異僅0.01的異構體）和樣品消耗量少（nL級）的優(yōu)勢，在電荷異構體分析中具有獨特價值。CE-MS聯(lián)用可同時實現(xiàn)電荷異構體的分離與結構鑒定。例如，某貝伐珠單抗類似藥在cIEF中發(fā)現(xiàn)主峰附近存在3個微小雜質峰（總含量<0.1%），通過CE-MS分析，確認分別為N端焦谷氨酸化（+0.02Da電荷偏移）、天冬酰胺脫酰胺化（-0.98Da電荷偏移）以及糖鏈唾液酸化缺失（-1.02Da電荷偏移），為工藝控制中的酶切（焦谷氨酸酶）和糖基化修飾優(yōu)化提供了依據(jù)。3核磁共振技術：復雜結構的終極確證核磁共振（NMR）是唯一可無需破壞樣品即可獲取分子三維結構的技術，尤其適用于復雜降解產(chǎn)物或翻譯后修飾的解析。例如，某利妥昔單抗類似藥在長期穩(wěn)定性研究中發(fā)現(xiàn)一種新的氧化降解產(chǎn)物（含量約0.2%），通過1H-15NHSQCNMR（異核單量子相干譜）定位氧化位點為重鏈Trp-52，進一步通過NOESY（核Overhauser效應譜）確認氧化產(chǎn)物為N-甲酰犬尿氨酸（N-formylkynurenine），這一結果為處方中抗氧化劑（如甲硫氨酸）的篩選提供了關鍵數(shù)據(jù)。盡管NMR靈敏度較低（需μg級樣品），但其對復雜結構的解析能力仍是質譜等技術的有力補充。4肽圖分析與數(shù)據(jù)庫檢索：高通量結構鑒定肽圖分析是生物藥結構表征的常規(guī)方法，通過蛋白酶（如胰酶、Lys-C）酶解藥物分子為肽段，再通過LC-MS/MS鑒定肽段序列，從而確認一級結構和PTM位點。隨著蛋白質組學數(shù)據(jù)庫的發(fā)展（如UniProt、PeptideAtlas），肽圖分析已實現(xiàn)高通量鑒定。例如，在某個生物類似藥的研發(fā)中，我們建立了包含500+肽段的“雜質肽段數(shù)據(jù)庫”，結合靶向MS/PRM（平行反應監(jiān)測）技術，可在30min內完成對20種常見結構變體（如脫酰胺、氧化、二硫鍵錯配）的篩查，效率較傳統(tǒng)方法提升5倍以上。05雜質定量分析方法進展雜質定量分析方法進展雜質定量分析的核心是“準確測定雜質含量”，確保其符合監(jiān)管要求（如ICHQ6B、FDA/EMA生物類似藥指導原則）。隨著技術進步，定量分析已從“單一指標檢測”向“多組分同步定量”和“生物活性相關定量”發(fā)展。1色譜定量技術：常規(guī)與高靈敏度方法色譜技術是雜質定量的主力，根據(jù)雜質性質可選擇不同色譜模式：1色譜定量技術：常規(guī)與高靈敏度方法1.1反相色譜（RPC）RPC適用于疏水性雜質（如氧化變體、片段）的定量，通過優(yōu)化流動相（乙腈/水梯度、離子對試劑）和色譜柱（C4、C8、C18），可實現(xiàn)高分辨率分離。例如，某阿托伐他汀單抗類似藥中Met氧化變體的定量，采用RPC-UV（214nm），方法學驗證顯示線性范圍0.01%-0.5%，RSD<2%，準確度98%-102%，滿足雜質定量的要求。對于痕量雜質（<0.01%），RPC-MS/MS（MRM模式）可顯著提升靈敏度，檢測限可達ppb級。1色譜定量技術：常規(guī)與高靈敏度方法1.2離子交換色譜（IEX）IEX是電荷異構體定量的首選方法，包括陽離子交換（CEX，分析酸性雜質）和陰離子交換（AEX，分析堿性雜質）?，F(xiàn)代UHPLC-IEX（超高效液相色譜離子交換）技術通過小顆粒填料（1.7-2.5μm）和高壓系統(tǒng)（>15,000psi），可將分析時間從傳統(tǒng)的30-60min縮短至10-15min，且峰容量提升2倍以上。例如，某帕博利珠單抗類似藥中酸性雜質（脫酰胺、糖基化缺失）的定量，采用CEX-UPLC，方法精密度（RSD）<1.5%，準確度>95%，且與cIEF結果具有良好的相關性（r>0.99）。1色譜定量技術：常規(guī)與高靈敏度方法1.3體積排阻色譜（SEC）SEC用于大小變體（聚集體、片段）的定量，傳統(tǒng)SEC存在分析時間長（30-40min）、柱效低等問題，而新型SEC-UPLC通過亞2μm填料和優(yōu)化流動相（如含150mMNa2SO4的磷酸鹽緩沖液），可將分析時間縮短至10min內，且對聚集體和片段的分離度顯著提升。對于亞可見顆粒（1-100μm），流式成像技術（如FlowCam）可同步顆粒數(shù)量、大小和形態(tài)，而微流控電阻脈沖傳感（MFI）則可實現(xiàn)>0.5μm顆粒的計數(shù)與sizing，為注射劑安全性評價提供全面數(shù)據(jù)。2免疫學定量技術：高特異性方法免疫學方法基于抗原-抗體特異性結合，適用于HCP、蛋白A殘留等雜質的定量，具有高靈敏度（可達pg/mL）和高特異性。2免疫學定量技術：高特異性方法2.1酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）ELISA是HCP殘留檢測的常規(guī)方法，通過包被抗-HCP抗體、加樣、酶標二抗顯色，實現(xiàn)定量。但其局限性在于：不同批次試劑盒的抗體親和力差異可能導致結果波動；且對于CHO細胞HCP，約10%-20%的蛋白無法被抗體識別（“隱蔽HCP”）。為此，我們團隊在研究中采用“多試劑盒交叉驗證”策略，結合2D電泳-MS識別隱蔽HCP，建立更全面的HCP質量控制標準。2免疫學定量技術：高特異性方法2.2生物層干涉技術（BLI）BLI是一種label-free的實時檢測技術，通過傳感器表面的抗體捕獲目標物，干涉光信號變化反映結合量，適用于蛋白A、宿主細胞蛋白等殘留的快速定量。與傳統(tǒng)ELISA相比，BLI無需酶標記，分析時間從4-6h縮短至30min以內，且樣品消耗量減少90%（僅需10μL）。例如，在某西妥昔單抗類似藥純化工藝中，我們采用BLI實時監(jiān)測蛋白A殘留，當上樣量從10mg/mL增至20mg/mL時，蛋白A殘留從50ppm降至5ppm，為工藝放大提供了關鍵數(shù)據(jù)。3質譜定量技術：高靈敏度與多組分同步質譜定量技術（如LC-MS/MSMRM、PRM）憑借高靈敏度和特異性，已成為痕量雜質（如降解產(chǎn)物、翻譯后修飾）定量的首選方法。3質譜定量技術：高靈敏度與多組分同步3.1多重反應監(jiān)測（MRM）MRM通過選擇母離子→子離子的特定轉換，實現(xiàn)目標雜質的精準定量，適用于已知結構的雜質（如氧化、脫酰胺變體）。例如，某英夫利西單抗類似藥中Trp氧化變體的定量，采用胰酶酶解后LC-MS/MSMRM，監(jiān)測母離子m/z655.3（氧化肽段）→子離子m/z689.3（b7離子），檢測限（LOD）達0.005%，定量限（LOQ）為0.01%，方法精密度（RSD）<5%，較傳統(tǒng)UV靈敏度提升100倍以上。3質譜定量技術：高靈敏度與多組分同步3.2平行反應監(jiān)測（PRM）PRM是高分辨質譜（如Orbitrap）的定量模式，可同時監(jiān)測所有母離子的碎片離子，適用于未知雜質或復雜基質的定量。與MRM相比，PRM無需優(yōu)化碰撞能量，且通過高分辨率（>70,000）消除基質干擾，定量準確性更高。例如，在某阿柏西普類似藥長期穩(wěn)定性研究中，我們采用PRM定量3種新型降解產(chǎn)物（均為未知結構），通過同位素稀釋法校正回收率，最終確定其含量隨時間的變化規(guī)律，為貨架期預測提供了依據(jù)。4生物活性定量技術：功能相關的質量控制傳統(tǒng)定量方法僅檢測“含量”，但雜質可能通過改變藥物分子構象影響生物活性（如ADCC、CDC效應）。因此，生物活性定量技術（如細胞法、表面等離子共振SPR）成為雜質分析的重要補充。4生物活性定量技術：功能相關的質量控制4.1細胞活性測定細胞法直接反映雜質對藥效的影響，如ADCC活性測定（通過效應細胞NK細胞與靶細胞共培養(yǎng)，檢測LDH釋放）、FcγR結合實驗（SPR或BLI測定抗體與FcγRIIIa的結合力）。例如，某奧法木單抗類似藥中巖藻糖基化降低（5%vs原研藥8%），通過ADCC細胞法檢測，其活性比原研藥高15%，與巖藻糖基化比例降低導致的ADCC增強效應一致，驗證了工藝優(yōu)化的有效性。4生物活性定量技術：功能相關的質量控制4.2表面等離子共振（SPR）SPR通過檢測生物分子結合過程中的折射率變化，實現(xiàn)實時、無標記的親和力測定，適用于雜質與靶點結合能力的評價。例如，某貝伐珠單抗類似藥中一種酸性雜質（脫酰胺化，含量0.3%），通過SPR測定其與VEGF的結合力（KD=1.2nMvs主峰1.0nM），雖然結合力略有下降，但仍在可接受范圍內，無需進一步工藝調整。06技術挑戰(zhàn)與未來展望技術挑戰(zhàn)與未來展望盡管生物類似藥雜質分析技術已取得顯著進展，但在實際應用中仍面臨諸多挑戰(zhàn)，同時新興技術的涌現(xiàn)也為領域發(fā)展帶來新的機遇。1現(xiàn)存技術挑戰(zhàn)1.1復雜基質中痕量雜質檢測的靈敏度與特異性生物類似藥樣品基質復雜（如含有大量蛋白、鹽、輔料），痕量雜質（<0.01%）易被基質干擾，導致假陽性或定量不準確。例如，HCP檢測中，低豐度HCP（<10ppm）可能因抗體親和力不足而漏檢；降解產(chǎn)物中，氧化變體可能與主峰共流出，影響定量結果。1現(xiàn)存技術挑戰(zhàn)1.2新型雜質的快速識別與表征隨著生產(chǎn)工藝的創(chuàng)新（如連續(xù)生產(chǎn)、無細胞表達系統(tǒng)），新型雜質（如mRNA疫苗中的uncappedRNA、細胞治療產(chǎn)品中的外源病毒載體）不斷出現(xiàn)，其結構未知且缺乏對照品，傳統(tǒng)分析方法難以快速鑒定。1現(xiàn)存技術挑戰(zhàn)1.3方法轉移與標準化的難度不同實驗室間的分析方法（如HPLC色譜條件、MS參數(shù)）存在差異，導致結果可比性差。例如，同一生物類似藥在不同CRO公司的HCP檢測結果可能偏差達20%，給全球多中心臨床試驗的質量控制帶來挑戰(zhàn)。1現(xiàn)存技術挑戰(zhàn)1.4生物活性相關性的缺乏傳統(tǒng)定量方法僅關注“含量”，但某些雜質含量雖低（如0.01%），若其免疫原性或活性影響顯著，可能對患者安全構成風險。如何建立“含量-結構-活性-毒性”的相關性模型，是雜質分析亟待解決的問題。2未來發(fā)展方向2.1人工智能與大數(shù)據(jù)輔助方法開發(fā)人工智能（AI）可通過機器學習算法優(yōu)化色譜條件（如流動相梯度、色譜柱選擇），預測雜質保留行為，減少方法開發(fā)時間。例如，某公司開發(fā)的“AI-MS平臺”通過分析10萬+肽段的質譜數(shù)據(jù)，可在1h內完成肽圖方法的優(yōu)化，較傳統(tǒng)方法（1-2周）效率提升100倍。此外，大數(shù)據(jù)技術可整合多批次數(shù)據(jù)，建立雜質產(chǎn)生與工藝參數(shù)的關聯(lián)模型，實現(xiàn)“過程分析技術（PAT）”驅動的雜質控制。2未來發(fā)展方向2.2微流控與單細胞分析技術微流控芯片（如“芯片實驗室”）可整合樣品前處