ICS65.150

CCSB51

37

山東省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB37/T4879—2025

大型海藻附生和內(nèi)生細(xì)菌分離鑒定方法

Methodfortheseparationandidentificationofepiphyticandendophyticbacteriaof

macroalgae

2025-07-29發(fā)布2025-08-29實(shí)施

山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB37/T4879—2025

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由山東省海洋局提出并組織實(shí)施。

本文件由山東省海洋標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。

I

DB37/T4879—2025

大型海藻附生和內(nèi)生細(xì)菌分離鑒定方法

1范圍

本文件描述了大型海藻附生和內(nèi)生細(xì)菌分離純化、鑒定和保藏的方法。

本文件適用于大型海藻附生和內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682—2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T30744—2014深海微生物樣品前處理技術(shù)規(guī)范

DB37/T4092—2020魚類腸道微生物分離鑒定通用技術(shù)要求

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

大型海藻macroalgae

肉眼可見(jiàn)的、絕大多數(shù)是多細(xì)胞的絲狀體、膜狀體、管狀體或葉狀體植物。

注：主要包括紅藻、綠藻和褐藻。

附生細(xì)菌epiphyticbacteria

定殖于大型海藻藻體表面的細(xì)菌。

內(nèi)生細(xì)菌endophyticbacteria

生長(zhǎng)在大型海藻藻體內(nèi)部的細(xì)菌。

4試劑與耗材

試劑

4.1.1無(wú)菌1×PBS緩沖液：2mMKH2PO4，0.137MNaCl，10mMNa2HPO4，2.7mMKCl。

4.1.2陳海水：天然海水避光保存三周及以上，使用時(shí)經(jīng)孔徑0.45μm濾膜過(guò)濾的濾液。

4.1.3超純水：符合GB/T6682—2008中一級(jí)水要求。

4.1.4酒精：75％乙醇。

4.1.5次氯酸鈉溶液：濃度2.5％。

4.1.6生理鹽水：0.9％的NaCl溶液。

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經(jīng)121℃，20min滅菌處理。

4.1.7保種液。

向配置好的0.9％的NaCl溶液中添加甘油，至終濃度為15％（V/V），將配置好的保種液置于封閉容

器儲(chǔ)存。121℃，20min滅菌處理。

4.1.8Zobell2216E培養(yǎng)基：5.0g蛋白胨，1.0g酵母膏，0.01gFePO4，20.0g瓊脂（固體培養(yǎng)基

添加），1000mL陳海水，pH7.4～7.8。

121℃滅菌20min。

4.1.9無(wú)菌液體石蠟。

耗材

4.2.1細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（市售）。

4.2.2槍頭：材料為聚丙烯的微量加樣器套頭，規(guī)格為0.2mL、1.0mL和5.0mL。

4.2.3凍存管：材料為聚丙烯，或其它可耐121℃高溫和液氮的塑料管，容積大于或等于2.5mL。

4.2.4其他生物實(shí)驗(yàn)常用耗材：紗布、封口膜。

5儀器與設(shè)備

生化培養(yǎng)箱：培養(yǎng)室溫度能在0℃～60℃范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。

振蕩培養(yǎng)箱：培養(yǎng)室溫度能在0℃～60℃范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)速能在0r/min～300r/min范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。

電子天平：精度為0.01g。

玻璃試管：直徑×長(zhǎng)度為18mm×180mm的平口玻璃試管和直徑×長(zhǎng)度為15mm×150mm的平口玻

璃試管。

錐形瓶：容量為250mL的廣口玻璃錐形瓶。

脈沖場(chǎng)電泳儀系統(tǒng)：最高輸出電壓350V，電壓連續(xù)可調(diào)，最大輸出電流0.5A，轉(zhuǎn)換范圍50ms到

18h，轉(zhuǎn)換角度為0°～360°，包括電泳儀、水浴循環(huán)儀和電冰槽。

其他生物實(shí)驗(yàn)常規(guī)儀器：超凈工作臺(tái)、漩渦振蕩器、高壓滅菌鍋和酒精燈等。

6藻類樣品采集與處理

樣品采集

采用隨機(jī)抽樣的方法，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、長(zhǎng)勢(shì)一致的藻類樣本，每株樣本的重量約為30g；樣本

處理前應(yīng)置于原位海水中或在4℃冰箱中保存（不超過(guò)24h），2h內(nèi)處理分析。

用121℃，20min滅菌過(guò)濾后的海水洗滌清除藻體表面附加的沙粒、沉積物、食草動(dòng)物和雜藻，備

用。

樣品處理

6.2.1附生細(xì)菌樣品的處理

稱取藻體樣品2.00g（精確至0.01g），置于250mL無(wú)菌錐形瓶中，加入18mL無(wú)菌1×PBS緩沖液，

用滅菌封口膜封口，使用振蕩培養(yǎng)箱（溫度25℃，轉(zhuǎn)速200r/min）振蕩30min，獲取藻體表面分離的附

生細(xì)菌懸液。

6.2.2內(nèi)生細(xì)菌樣品的處理

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DB37/T4879—2025

6.2.2.1取洗凈的藻體樣品2.00g放入燒杯中，先用75％乙醇浸泡，后用2.5％的次氯酸鈉溶液浸泡，

浸泡時(shí)間根據(jù)藻體種類及實(shí)際情況確定，浸泡后的藻體使用超純水清洗5次以上。為了確定除菌是否徹

底，可將最后一次沖洗液接種在2216E平板上，若無(wú)菌落生長(zhǎng)則認(rèn)為藻體表面除菌徹底。藻體表面除菌

效果記錄表，見(jiàn)附錄A。

6.2.2.2取6.2.2.1中表面除菌徹底的藻體置于無(wú)菌研缽中，加入18mL生理鹽水研磨，獲取內(nèi)生細(xì)

菌懸液，備用。

7細(xì)菌樣品的分離與純化

細(xì)菌樣品的分離

7.1.1附生細(xì)菌

7.1.1.1取1mL附生細(xì)菌懸液（6.2.1），加入生理鹽水進(jìn)行10倍系列稀釋，獲得稀釋倍數(shù)分別為10

倍、100倍和1000倍的樣品稀釋液，振蕩混勻，備用。

7.1.1.2取6.2.1和7.1.1.1制備的樣品各100μL，分別涂布于Zobell2216E固體培養(yǎng)基上。25℃

培養(yǎng)72h，每24h觀察記錄單菌落形態(tài)特征，記錄表格見(jiàn)附錄B。

7.1.2內(nèi)生細(xì)菌

7.1.2.1取1mL內(nèi)生細(xì)菌懸液（6.2.2.2），加入生理鹽水進(jìn)行10倍系列稀釋，獲得稀釋倍數(shù)10倍、

100倍和1000倍的樣品稀釋液，振蕩混勻，備用。

7.1.2.2取6.2.2.2和7.1.2.1制備的樣品各100μL，分別涂布于Zobell2216E固體培養(yǎng)基上。25℃

培養(yǎng)72h，每24h觀察記錄單菌落形態(tài)特征，記錄表格見(jiàn)附錄B。

細(xì)菌樣品的純化

7.2.1根據(jù)菌落生長(zhǎng)狀況及菌落形態(tài)特征，選擇合適稀釋度（每培養(yǎng)皿30個(gè)～300個(gè)菌落）的培養(yǎng)皿，

進(jìn)行單菌落挑取，劃線純化。方法如下：

a)菌落數(shù)在30左右的培養(yǎng)皿，每個(gè)菌落都挑取，進(jìn)行劃線純化；

b)菌落數(shù)在50左右的培養(yǎng)皿，挑取1/2個(gè)培養(yǎng)皿上的單菌落，進(jìn)行劃線純化；

c)菌落數(shù)在100左右的培養(yǎng)皿，挑取1/4個(gè)培養(yǎng)皿上的單菌落，進(jìn)行劃線純化；

d)菌落數(shù)大于100的培養(yǎng)皿，挑取特殊的其它培養(yǎng)皿上沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)的菌落，進(jìn)行劃線純化。

7.2.2觀察劃線菌落形態(tài)特征是否一致，如不一致，再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)菌株，

并填寫附錄B菌落形態(tài)特征統(tǒng)計(jì)表。

8藻類細(xì)菌鑒定與保藏

細(xì)菌的鑒定

8.1.1DNA提取

將獲得的純培養(yǎng)菌株（7.2.2）接種于斜面培養(yǎng)試管，培養(yǎng)獲得適齡斜面菌苔，加入4.5mL滅菌后的

生理鹽水通過(guò)漩渦振蕩器振蕩得到菌懸液。按照GB/T30744相關(guān)規(guī)定，進(jìn)行基因組DNA提取。

8.1.2細(xì)菌基因組16SrRNA基因擴(kuò)增

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采用細(xì)菌通用的正向引物338F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)和反向引物806R(3’-

GGACTACHVGGGTATCTAAT-5’)對(duì)16SrRNA的V3＋V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。

8.1.3PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)

對(duì)擴(kuò)增所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，按照DB37/T4092—2020相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

8.1.4PCR產(chǎn)物測(cè)序及序列比對(duì)

對(duì)檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與模式菌數(shù)據(jù)庫(kù)EzBioCloud進(jìn)行序列比對(duì)，選取

序列相似度最高的前10個(gè)菌種的序列，與待鑒定菌的序列通過(guò)MEGA中鄰接法、最大似然法和最小進(jìn)化法

三種方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，將細(xì)菌鑒定到種。

細(xì)菌的保藏

8.2.1石蠟油封存

在斜面培養(yǎng)物上，加封一層（2cm～3cm）無(wú)菌液體石蠟，然后置于15℃培養(yǎng)箱中保存。填寫《菌

株信息記錄表》，見(jiàn)附錄C。

8.2.2冷凍保存

將獲得的純培養(yǎng)菌株（7.2.2）接種于斜面培養(yǎng)試管，獲得適齡斜面菌苔，加入4.5mL滅菌后的保種

液，通過(guò)漩渦振蕩器振蕩斜面培養(yǎng)試管，將細(xì)菌培養(yǎng)物振蕩至保種液中，或直接向液體培養(yǎng)物中添加甘

油，至終濃度為15％（V/V）。隨后，轉(zhuǎn)移至凍存管中，做好標(biāo)記，保存于-20℃冰箱或經(jīng)預(yù)冷凍（-20℃，

20min；-40℃，20min～30min；-60℃，20min～30min）處理后長(zhǎng)期保存于超低溫（-80℃）條件下。

保藏的菌種不能反復(fù)凍融，如取用保藏菌株，需及時(shí)重新保藏菌種。填寫附錄C菌株信息記錄表。

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附錄A

（資料性）

大型海藻表面除菌效果記錄表

大型海藻表面除菌效果記錄表見(jiàn)表A.1。

表A.1大型海藻表面除菌效果記錄表

75％酒精浸泡

浸泡時(shí)間

3min5min

2.5％次氯酸鈉浸泡板1板2板3板1板2板3

3min

5min

10min

15min

注：“＋”代表有菌落長(zhǎng)出；“－”代表無(wú)菌落

記錄者校對(duì)者審核者

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附錄B

（資料性）

菌落形態(tài)特征記錄表

菌落形態(tài)特征記錄表見(jiàn)表B.1。

表B.1菌落形態(tài)特征記錄表

菌種編號(hào)顏色大小形狀質(zhì)地有無(wú)光澤是否濕潤(rùn)是否透明是否凸起培養(yǎng)時(shí)間記錄人記錄時(shí)間

記錄者校對(duì)者審核者

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附錄C

（資料性）

菌株信息記錄表

菌株信息記錄表見(jiàn)表C.1。

表C.1菌株信息記錄表

大型海藻信息

物種名編號(hào)采集日期采集地點(diǎn)樣品狀態(tài)采集人

菌株16SrDNA鑒定及保藏信息

菌株編號(hào)最相似物種相似度(％)保藏時(shí)間保藏方式保藏孔位