前言鈷，元素符號Co，銀白色鐵磁性金屬，其表面物理性狀呈銀白略帶淡粉色，在周期表中位于第4周期、第Ⅷ族，原子序數(shù)27，原子量58.9332，密排六方晶體。鈷的用途廣泛，被譽(yù)為戰(zhàn)略金屬，它有效地保證了合金的高強(qiáng)度耐高溫耐腐蝕性質(zhì)，是生產(chǎn)加工中重要的原材料?？捎糜谥圃靽姎獍l(fā)動機(jī)零件及管道壓縮機(jī)、電子設(shè)備和移動裝置、手機(jī)鋰電池，還可用作石油制造和化學(xué)加工的催化劑、油漆和油墨的干燥劑等等，因其廣泛應(yīng)用也產(chǎn)生了很多鈷廢料：如耐高溫耐腐蝕的磁性材料、廢棄合成金屬、廢棄電子設(shè)備和移動裝置，廢棄化工產(chǎn)品等，對環(huán)境的承受能力提出了很大挑戰(zhàn)[6]。鈷可以在土壤中蓄積，并且具有環(huán)境遷移的能力，很容易污染水源，過量的鈷元素充斥生活很容易對人體造成傷害。鈷離子隨血液游走于身體各部位，形成細(xì)胞內(nèi)ROS物質(zhì)損害身體健康[7]。不同濃度的鈷可不同程度的影響人體對鐵離子的代謝，血紅蛋白的合成，細(xì)胞發(fā)育及酶的功能等[4，5]。鈷過量蓄積可危害全身器官，使得心臟、肝臟、肺臟、循環(huán)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等不堪重負(fù)，日漸衰落，嚴(yán)重危害人群身心健康。鈷中毒引起的細(xì)胞損害機(jī)制，主要涉及自由基破壞和線粒體損傷以及細(xì)胞缺氧性壞死，長期小劑量接觸鈷和短期大劑量接觸鈷導(dǎo)致的嚴(yán)重鈷中毒可讓人陷入昏迷暈厥甚至失去生命體征[3]。這種機(jī)制常發(fā)生在神經(jīng)細(xì)胞退行性病變中，與細(xì)胞鐵死亡有著千絲萬縷的關(guān)系。鐵死亡是一種鐵離子依賴性的、以細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧聚集等為特征的細(xì)胞死亡形式，與細(xì)胞凋亡、自噬、壞死在機(jī)理、反應(yīng)過程等方面有明顯的區(qū)別[1]。鐵死亡特征為：細(xì)胞質(zhì)膜完整，線粒體膜密度增加，線粒體嵴減少或消失，氧化性多不飽和脂肪酸（PUFAs）釋放增加，脂質(zhì)中ROS增多，可被鐵死亡抑制劑Fer-1、DFO等減緩損傷程度[2]。鐵死亡的發(fā)生機(jī)制有鐵離子代謝障礙、脂質(zhì)ROS累計及谷胱甘肽耗竭等途徑，鐵死亡誘導(dǎo)劑或抑制劑可通過不同機(jī)制影響其效應(yīng)。鐵死亡的誘導(dǎo)劑有systemXc-抑制劑、GPX4抑制劑、GSH耗竭劑，它的抑制劑有鐵離子螯合劑、脂質(zhì)ROS抑制劑如Fer-1、DFO等。本次研究通過環(huán)境毒物氯化鈷對神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡效應(yīng)的初級探索，期待能更加深入地解析神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制，為神經(jīng)系統(tǒng)鐵死亡靶向治療、相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)藥物研發(fā)及環(huán)境衛(wèi)生建設(shè)等方面提供理論依據(jù)和新的研究方向。1材料與方法材料1.1.1細(xì)胞系人腦H4膠質(zhì)瘤細(xì)胞體系，該細(xì)胞系被廣泛用于神經(jīng)毒性及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究，所以選擇該細(xì)胞系為體外研究的神經(jīng)細(xì)胞。1.1.2試劑與耗材谷胱甘肽檢測試劑盒(G263)谷胱東仁化學(xué)科技(上海)有限公司細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒-CCK8試劑盒（CK04）東仁化學(xué)科技(上海)有限公司DMEM液體培養(yǎng)基美國HyClone公司胎牛血清杭州四季青生物公司0.25%胰酶-EDTA美國GIBCO公司TRIZOL美國Invitrogen公司無水乙醇分析純上海三鷹化學(xué)試劑有限公司氯仿分析純國藥集團(tuán)試驗試劑有限公司BCA蛋白濃度測定試劑盒碧云天生物技術(shù)公司甲醇分析純天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司異丙醇分析純國藥集團(tuán)試驗試劑有限公司四甲基乙二胺國藥集團(tuán)試驗試劑有限公司四水氯化鈷美國SIGMA公司氯化鈉國藥集團(tuán)試驗試劑有限公司脫脂奶粉美國碧迪醫(yī)療器械有限公司30%ACR-Bis廈門鷺隆生物有限公司Tris-鹽酸緩沖液（PH8.8）上海百賽生物技術(shù)有限公司Tris-鹽酸緩沖液（PH6.8）上海百賽生物技術(shù)有限公司過硫酸銨（AP）美國Amresco公司三（羥甲基）氨基甲烷（TRIS）中國Solarbio公司Comeplete,EDTA-free,EASYpack,20瑞士Roche公司NE-PERNuclearandCytoplasmicExtractionReagents美國Pierce公司甘氨酸中國Solarbio公司十二烷基硫酸鈉（SDS）美國SIGMA公司PBS緩沖液美國Hyclone公司雙抗（鏈霉素、青霉素）美國Gibco公司辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）二級抗體中國碧云天生物技術(shù)公司W(wǎng)estern及IP細(xì)胞裂解液中國碧云天生物技術(shù)公司75mL、100mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶Falcon公司15mL、50mL離心管、1.5mL細(xì)胞凍存管Coring公司6孔板、24孔板、96孔板、一次性移液管Costar公司1mL、200uL、10uLTip頭Axygen公司1.5mLEP管、PCR管Axygen公司1.1.3儀器與設(shè)備HF-safe1200型生物安全柜香港力康科學(xué)儀器有限公司Forma系列CO2培養(yǎng)箱美國Thermo公司DK-8D電熱恒溫水槽上海精密實(shí)驗設(shè)備廠GI54DWS自動壓力蒸汽滅菌器玫微廈門儀器有限公司立式壓力蒸汽滅菌器上海博訊實(shí)業(yè)有限公司EASYpure超純水系統(tǒng)裝置美國BarnsteaedS公司司4℃低溫冰箱中國海爾集團(tuán)有限公司團(tuán)-80℃超低溫冰箱中國海爾集團(tuán)有限公司團(tuán)-80℃超低溫冰箱美國Thermo公司司-30低溫冰箱日本三洋公司司低速離心機(jī)德國EPPendorf公司司Z323K型臺式冷凍高速離心機(jī)德國HERMLE公司GZX-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥機(jī)上海博訊實(shí)業(yè)有限公司SERIAL000582型制冰機(jī)廈門精藝興業(yè)科技有限公司CK40-F200BH-2倒置顯微鏡日本OLYMPUS公司GeneGenius凝膠成像系統(tǒng)英國SYNGENE公司外分光光度計ND-1000型英國NanoDrop公司電泳槽美國Bio-Rad公司電轉(zhuǎn)儀美國Bio-Rad公司ImageQuantLAS4000mini美國通用公司微量移液器德國Eppendorf公司1.2研究方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)（1）細(xì)胞換液①實(shí)驗前紫外線消毒生物安全柜臺面、物品傳遞柜、細(xì)胞房地面等30分鐘；②攜帶進(jìn)入層流室：垃圾桶、PBS、培養(yǎng)液、0.25%胰酶-EDTA、雙抗、六孔板等；③用酒精消毒手部、桌面、移液槍、待拿入生物安全柜的物品；④倒去原培養(yǎng)液；⑤加入PBS1-2mL洗1-2次，待洗凈雜質(zhì)后棄用；⑥加入4mL培養(yǎng)基于100mL玻璃培養(yǎng)瓶，“8”或“W”字形搖勻，擰松瓶蓋放入恒溫培養(yǎng)箱37℃、5%CO2/95%O2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞傳代H4細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70%時傳代步驟①-⑤同前⑥加入0.5mL0.25％胰酶進(jìn)行消化⑦加入2mL培養(yǎng)基，用移液槍各角度吹打⑧平分進(jìn)兩個100mL玻璃培養(yǎng)瓶加培養(yǎng)基到4mL，“8”或“W”字形搖勻，擰松瓶蓋放入恒溫培養(yǎng)箱37℃、5%CO2/95%O2條件下培養(yǎng)。1.2.2CCK8-細(xì)胞活性實(shí)驗

①在96孔板中配制大約100μl的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(在37℃、5%CO2/95%O2條件培養(yǎng))。

②向培養(yǎng)板中加入10μl不同濃度（0、10、50、100、200、400、600μmol/L）的待測物質(zhì)，培養(yǎng)板在37℃、5%CO2/95%O2培養(yǎng)箱中孵育不同的時間（6、12、24、36h）。

③向每孔加入10μl

CCK8溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù))。

④將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4小時。

⑤用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光值（如果暫時不打算測定吸光值的話可以向每孔中加入10μl

0.1MHCI溶液或者1%w/vSDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下，在24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。)1.2.3谷胱甘肽試劑盒檢測（1）樣品制備①培養(yǎng)細(xì)胞至1×107濃度，在4℃，200×g離心10min后收集細(xì)胞，棄上清。②用300ulPBS清洗細(xì)胞，在4℃，200×g離心10min,棄上清。③加入80ul10mMHCl，反復(fù)凍融2次使細(xì)胞裂解。④加入20ul5％的SSA，在8,000×g離心10min。⑤轉(zhuǎn)移上清液至一支新管中，用ddH2O稀釋，將SSA濃度調(diào)節(jié)為0.5％。⑥加1.2mlBufferSolution至Substrate(DTNB)管中，溶解DTNB。⑦轉(zhuǎn)移上述全部溶液至15ml錐形管中，并用2.4mlBufferSolution稀釋(總體積為3.6ml)。（2）反應(yīng)溶液制備①制備SubstrateWorkingSolution：加1.2mlBufferSolution至Substrate(DTNB)管中，溶解DTNB。②轉(zhuǎn)移上述全部溶液至15ml錐形管中，并用2.4mlBufferSolution稀釋(總體積為3.6ml)③制備Enzyme/CoenzymeWorkingSolution：用移液器吹打混勻EnzymeSolution，吸取20l至15ml錐形管中，用4mlBufferSolution稀釋。④取2.4ml上述溶液至一支新的15ml錐形管中。⑤加2.4mlddH2O至Coenzyme管中并溶解。⑥轉(zhuǎn)移上述全部溶液至步驟④的15ml錐形管中，并用2.4mlBufferSolution稀釋(總體積：7.2ml)。⑦加2.0ml0.5％的SSA至StandardGSH管中并溶解。⑧加2.0ml0.5％的SSA至StandardGSSG管中并溶解。樣品檢測①每孔加入40μlGSSGStandardSolution,GSHStandardSolution,GSSG樣品或GSH樣品。②每孔加入60μlBufferSolution。③在37℃培養(yǎng)1h。④每孔加入60μlSubstrateWorkingSolution。⑤每孔加入60μlEnzyme/CoenzymeWorkingSolution。⑥在37℃培養(yǎng)10min。⑦用酶標(biāo)儀在405nm或415nm下測定吸光度。⑧用GSSG標(biāo)準(zhǔn)曲線測定所得GSSG樣品溶液中的GSSG濃度。⑨用GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線測定所得GSH樣品溶液中總谷胱甘肽(GSH+GSSG)的濃度⑩GSH濃度使用以下公式計算【總谷胱甘肽(GSH+GSSG)和GSSG】GSH=TotalGlutathione(GSH+GSSG)–GSSG×21.2.4逆轉(zhuǎn)實(shí)驗選擇200μM、24h作為氯化鈷處理濃度和時間點(diǎn)，用鐵死亡抑制劑Fer-1（1μM）、DFO（100μM）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)實(shí)驗。細(xì)胞分組為對照組、Fer-1、DFO、Fer-1+Cocl2、DFO+Cocl2組，進(jìn)行谷胱氨肽和CCK8的逆轉(zhuǎn)實(shí)驗。1.2.5蛋白印跡實(shí)驗從細(xì)胞中提取總蛋白（2）SDS電泳①清洗玻璃板②根據(jù)要求配制分離膠（12%）和濃縮膠（5%），加入定量的蛋白樣品。③電泳：電泳1.5h，濃縮膠為80V，分離膠為120V。④轉(zhuǎn)膜：用濕轉(zhuǎn)液在電轉(zhuǎn)儀中將聚丙烯酰胺凝膠上分離的蛋白轉(zhuǎn)移至0.22um的PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為25mA/膜，1.2h。⑤將PVDF膜放入牛奶封閉液中，室溫下?lián)u床封閉1h。切下需要的條帶，用TBST將一抗稀釋至適當(dāng)濃度，4℃搖床孵育10h或過夜。⑥在室溫下，用TBST在搖床上洗一抗6次，5min/次。⑦上配制二抗稀釋液，將膜放入二抗中，室溫下孵育1h后，用TBST在搖床上洗6次，5min/次，最后再用TBST洗一次進(jìn)行曝光。⑧凝膠圖像分析：用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行曝光，用ImageJ軟件測出條帶凈光密度值，用Graphpad作圖分析趨勢。1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析用ImageJ軟件得出條帶凈光密度值、Graphpad6.01軟件進(jìn)行單因素方差分析，WesternBlot組間比較用Tukey分析，CCK8和谷胱甘肽結(jié)果組間比較用Dunnett's分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差（`X±S）的形式表示，時間效應(yīng)關(guān)系用Graphpad6.01單因素方差趨勢檢驗（α=0.05），所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和作圖都在Graphpad6.01軟件中完成。2結(jié)果2.1CCK82.1.1CCK8細(xì)胞活性實(shí)驗A2.1.2CCK8細(xì)胞活性逆轉(zhuǎn)實(shí)驗B結(jié)果：由A圖可知單因素方差分析及高劑量組（100、200、400、600μM）vs對照組的Dunnett's兩兩比較均有明顯統(tǒng)計學(xué)差異，由B圖可知氯化鈷引起的細(xì)胞活性降低被鐵死亡抑制劑逆轉(zhuǎn)。（*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，n=3）2.2谷胱甘肽2.2.1谷胱甘肽含量檢測實(shí)驗C2.2.2谷胱甘肽逆轉(zhuǎn)實(shí)驗D結(jié)果：由C圖可知單因素方差分析及劑量組vs對照組的Dunnett's兩兩比較均有明顯統(tǒng)計學(xué)差異，由D圖可知氯化鈷引起的谷胱甘肽減少被鐵死亡抑制劑逆轉(zhuǎn)。（*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，n=3）2.3WesternBlotE*********GAPDH(36kDa)XCT(55kDa)GPX4(25kDa)(*Contral:0μM;**Treated:400μM)F結(jié)果：經(jīng)單因素方差分析：以上圖像數(shù)據(jù)（P>0.05）均無統(tǒng)計學(xué)意義但是圖像提示XCT、GPX4蛋白表達(dá)在CoCl2染毒后有上升趨勢。3討論CCK8細(xì)胞活性實(shí)驗:由A圖可知隨著時間延長，各組分細(xì)胞活性持續(xù)降低，且Dunnett's兩兩比較提示高劑量組（100、20