COE誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡變過程中l(wèi)ncRNA的檢測DetectionoflncRNAintheprocessofmalignanttransformationof16HBEinducedbyCOE摘要目的尋找焦?fàn)t逸散物(COE)誘導(dǎo)正常支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)發(fā)生惡變過程中表達(dá)差異的長鏈非編碼RNA(lncRNA)。方法1、差異lncRNA的篩選提取正常支氣管上皮細(xì)胞和COE誘導(dǎo)發(fā)生惡變的肺鱗癌細(xì)胞的總RNA，送公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，擬挑選在兩組細(xì)胞中差異倍數(shù)大于2或者小于0.5，p值小于0.05（經(jīng)FDR校正）的lncRNA作為表達(dá)差異的lncRNA。2、差異lncRNA的驗證查閱相關(guān)文獻(xiàn)，挑選研究較少且差異顯著的lncRNA進(jìn)行驗證。首先提取正常支氣管上皮細(xì)胞和COE誘導(dǎo)發(fā)生惡變的肺鱗癌細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用qRT-PCR技術(shù)對挑選的差異lncRNA進(jìn)行驗證。3、調(diào)控性lncRNA的確定采用Spearman等級相關(guān)系數(shù)對lncRNA與基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r>0.4（r<–0.4），則認(rèn)為兩者存在正（負(fù)）相關(guān)。我們認(rèn)為與lncRNA表達(dá)相關(guān)的基因數(shù)越多，則這個lncRNA為調(diào)控性lncRNA。結(jié)果1、lncRNA芯片結(jié)果檢測顯示以篩選標(biāo)準(zhǔn)FDR＜0.05,foldchange>2倍，p<0.05計，轉(zhuǎn)錄組測序出來的差異lncRNA有899個。2、進(jìn)一步挑選標(biāo)準(zhǔn)FPKM>20的lncRNA包括SFTA1P、AL031600.1、AC124312.2。3、SFTA1P、AL031600.1、AC124312.2調(diào)控的基因數(shù)分別為82、4、16。結(jié)論1、部分lncRNA在人支氣管上皮惡變細(xì)胞中出現(xiàn)表達(dá)差異。2、推測lncRNA可能與人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制密切相關(guān)，SFTA1P、AL031600.1、AC124312.2可以作為分子性生物標(biāo)記物用于易感人群的篩檢和肺癌的早期診斷。關(guān)鍵詞：焦?fàn)t逸散物人支氣管上皮細(xì)胞細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化長鏈非編碼RNAABSTRACTObjectTofindlongnoncodingRNAsexpressingdifferencesinnormalhumanbronchialepithelialcellsduringmalignanttransformationinducedbycokeovenemissions.Methods1ScreeningofdifferentiallncRNAToextractthetotalRNAfromnormalbronchialepithelialcellsandCoe-inducedmalignantlungsquamouscellcarcinoma,tosendthecompanytosequencingthetranscriptiongroup,andtoselectlncRNAwithdifferencemultiplesgreaterthan2orlessthan0.5,pvaluelessthan0.05(correctedbyFDR)inthetwogroupsofcellsaslncRNA.2ValidationofdifferentiallncRNAReviewtherelevantliteraturesandselectthelncRNAwithlessresearchandsignificantdifference.ThetotalRNAfromnormalbronchialepithelialcellsandtheCoe-inducedmalignanttumorofthelungsquamouscellcarcinomawasextracted,andtheQRT-PCRtechniquewasusedtoverifytheselecteddifferencelncRNA.3DeterminationofRegulatorylncRNAThecorrelationbetweenlncRNAandgeneexpressionwasanalyzedbySpearmangradecorrelationcoefficient,andthecorrelationcoefficientr>0.4(R<–0.4)wasconsideredtohavepositive(negative)correlation.WebelievethatthemoregenesassociatedwithlncRNAexpression,thelncRNAistheregulatorylncRNA.Results1LncRNAchipresultsshowedthatthescreeningstandardFDR<0.05,foldchange>2times,p<0.05,thetranscriptomesequencingdifferencelncRNAhas899.2FurtherselectionofstandardFPKM>20lncRNAincludesSFTA1P,AL031600.1andAC124312.2.3SFTA1P,AL031600.1andAC124312.2controlgeneswere82,4and16respectively.Conclusion1PartiallncRNAexpressionisdifferentincancerationcellsofhumanbronchialepithelialcells.2.ItispresumedthatlncRNAmaybeoneofthemolecularmechanismsofmalignanttransformationofhumanbronchialepithelialcells.SFTA1P,AL031600.1andAC124312.2canbeusedasmolecularbiomarkersforscreeningofsusceptiblepopulationandearlydiagnosisoflungcancer.Keywords:cokeovenemissions;humanbronchialepithelialcell;cellmalignanttransformation；longnon-codingRNA目錄前言……………………1材料與方法……………32.1材料………………32.2方法………………32.2.1芯片實驗………………………32.2.2qRT-PCR技術(shù)對差異lncRNA的驗證…………42.2.3調(diào)控性lncRNA的確定………5結(jié)果……………………53.1轉(zhuǎn)錄組測序出來的差異lncRNA………………53.2lncRNA的驗證…………………73.3調(diào)控性lncRNA的確定…………94討論…………………95結(jié)論…………………106謝辭…………………107參考文獻(xiàn)……………118畢業(yè)論文（設(shè)計）成績評分表……………………129附錄…………………12前言腫瘤（tumor，neoplasm）是機(jī)體在各種致瘤因素所用下，局部組織的細(xì)胞在基因水平上失去了其對生長的正常調(diào)控，導(dǎo)致異常增生而形成的新生物。它是一直多基因遺傳的常見病和多發(fā)病，在其發(fā)生發(fā)展過程中，遺傳因素與化學(xué)因素、物理因素、生物因素（病毒）等環(huán)境因素長期、多階段的相互作用［1-3］。其中九成以上是惡性腫瘤，也就是癌癥（cancer）。癌癥是局部組織細(xì)胞增殖和分化異常而導(dǎo)致的細(xì)胞生長失控，伴隨著腫瘤局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特征，是一個多因子、多步驟的復(fù)雜過程，其危險因素包括不良生活習(xí)慣，環(huán)境污染，遺傳因素等，分為引發(fā)、促長和進(jìn)展三個階段［4-5］。在全世界范圍內(nèi)，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）的世界癌癥報告數(shù)據(jù)顯示：2000年，全球惡性腫瘤患者約2200萬人，每年新增患病人數(shù)約為1010萬人，每年死亡人數(shù)約為620萬人，占全部死亡人數(shù)的12%，在發(fā)展中國家占9%，在發(fā)達(dá)國家占21%。2008年，全球惡性腫瘤患者約為24600萬人，每年新增人數(shù)約為12700萬人，死亡人數(shù)約為760萬人，其中發(fā)展中國家新發(fā)病數(shù)約占全世界的56%，而死亡人數(shù)約占世界的63.7%。由于人類生活習(xí)慣以及人口結(jié)構(gòu)變化和環(huán)境污染加劇，預(yù)計到2020年，各項統(tǒng)計結(jié)果將是2000年數(shù)據(jù)結(jié)果的兩倍，預(yù)測到2030年癌癥死亡人數(shù)將高達(dá)1150萬人。肺癌（lungcancer）也就是原發(fā)性支氣管腫瘤（primarybronchogeniccarcinoma），為起源于支氣管粘膜或腺體的惡性腫瘤。腫瘤發(fā)病與吸煙、職業(yè)致癌因子、空氣污染、電離輻射、飲食和營養(yǎng)、遺傳和基因改變等密切相關(guān)。其中，由于煙霧中的尼古丁和苯并芘等均有致癌作用，吸煙成為誘發(fā)肺癌的首要原因［6］。職業(yè)致癌因素包括煤焦油、石棉、砷等。室內(nèi)小環(huán)境和室外大環(huán)境污染中均含有致癌物。大劑量電離輻射能引起肺癌。而食用富含Β胡蘿卜素的綠色、黃色和黃綠色蔬菜和水果可作為保護(hù)作用減少肺癌的危險性。與此同時，我們已逐步認(rèn)識到，肺癌很可能是外因?qū)е聝?nèi)因發(fā)病的一種疾病［7-10］。在世界范圍內(nèi)，世界衛(wèi)生組織（WHO）調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，2008年，肺癌年發(fā)病人數(shù)約為16萬人，年死亡人數(shù)約為140萬人，在世界常見惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率排行中均占首位。而在我國，發(fā)病率和死亡率均處于持續(xù)不斷升高趨勢，肺癌發(fā)病率為腫瘤的首位，也是所有癌癥死亡的首要原因。在1973年～2005年間肺癌死亡率增加了464.65%，由1973年～1975年間的7.1/10萬增加到1990年～1992年間的17.5/10萬人，增長147.7%。自2004年至2007年間，肺癌發(fā)病率從45.22/10萬人增加至51.25/10萬人，主要高發(fā)城市有北京、天津、上海等發(fā)達(dá)城市。城市死亡率從32.66/10萬人增加到46.56/10萬人，增長15.96%；農(nóng)村死亡率從28.67/10萬人增加到33.58/10萬人，增長17.13%。肺癌已成為影響人類公共健康的重大問題之一，給全世界各個國家和地區(qū)造成了極大的直接經(jīng)濟(jì)損失和間接經(jīng)濟(jì)損失，美國和歐盟每年用于肺癌的費用數(shù)額巨大，而在我國，如果不及時控制吸煙并治理環(huán)境污染問題，預(yù)計到2025年，每年肺癌人數(shù)將超過100萬，成為世界第一肺癌大國。目前，癌癥狀況不容忽視。在我國，據(jù)國家衛(wèi)生部全國衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展情況統(tǒng)計顯示，我國腫瘤發(fā)病率已經(jīng)上升到127例/10萬人，從20世紀(jì)70年代至21世紀(jì)初死亡率上升了83.13%。2000年，癌癥占居民死亡原因的19%，在北京和上海分別為24%和26%。進(jìn)入21世紀(jì)以來，惡性腫瘤的每年新發(fā)病約為282萬人，死亡約為196萬人，帶癌生存86萬人。2005年，農(nóng)村地區(qū)人口惡性腫瘤以107.1/10萬人居死因第三位，而在城市人口中以126.0/10萬人居第一位。目前，按死亡率高低排列最常見的惡性腫瘤，在女性分別為乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、子宮頸癌、肝癌、卵巢癌、食管癌等;在男性分別為肺癌、腎癌、肝癌、結(jié)直腸癌、食管癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病等。由此可知，近半個世紀(jì)以來，世界癌癥的發(fā)病率和死亡率一直處于上升趨勢，惡性腫瘤已經(jīng)成為人類死亡構(gòu)成的重要病因，是目前危害人類健康和生命安全的最嚴(yán)重的重大疾病之一，全世界各個國家和地區(qū)惡性腫瘤的疾病負(fù)擔(dān)均呈不斷上升趨勢，而當(dāng)代面臨的最重要的公共衛(wèi)生問題之一就是腫瘤的預(yù)防和控制。隨著人口不斷增長和人口結(jié)構(gòu)老齡化加快，在未來的幾十年內(nèi)，發(fā)展中國家癌癥疾病負(fù)擔(dān)將持續(xù)快速增加，而在我國，惡性腫瘤給國民經(jīng)濟(jì)造成了重大損失，給個人、家庭和社會造成沉重負(fù)擔(dān)。癌癥作為一種常見的多基因遺傳病，是遺傳易感性和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，其中，環(huán)境因素占主導(dǎo)作用。環(huán)境因素包括化學(xué)因素、物理因素、生物因素等，其中最主要的是化學(xué)因素，即因化學(xué)致癌物（chemicaicarcinogen）而導(dǎo)致的化學(xué)致癌作用（chemicalcarcinogenesis）［11-12］?；瘜W(xué)致癌物是指能引起人類和動物腫瘤、具有化學(xué)致癌作用并增加其發(fā)病率和死亡率的化學(xué)物質(zhì)。化學(xué)致癌作用即化學(xué)致癌物作用于正常細(xì)胞使其惡化并最終發(fā)展成為腫瘤的過程。化學(xué)致癌物從開始作用到腫瘤發(fā)生并出現(xiàn)明顯臨床癥狀有一段相當(dāng)長的潛伏期。而到目前為止，經(jīng)確定對人類和動物有致癌作用的化學(xué)致癌物已有1000多種，包括多環(huán)芳烴、真菌毒素、烷化劑和?；瘎┑龋?3］。目前，關(guān)于化學(xué)致癌物研究比較多也比較明確的是多環(huán)芳烴類。多環(huán)芳烴（polycyclicaromatichydrocarbon，PAHs）主要來源于各種含碳有機(jī)物的熱解和不完全燃燒，如煤、石油產(chǎn)品的燃燒、烹調(diào)油煙以及各種有機(jī)廢物的焚燒等。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)200多種PAHs，其中致癌性相當(dāng)強(qiáng)的有3,4-苯并芘，1,2,5,6-雙苯并蒽等。第一個被發(fā)現(xiàn)的致癌作用很強(qiáng)的環(huán)境化學(xué)污染物是苯并A芘（benzoApyrene，Bap），它是唯一經(jīng)吸入染毒實驗證實可引起肺癌的PAH。它是煤焦油的主要致癌成分，而煤焦油揮發(fā)物是焦?fàn)t逸散物的重要組成部分［14］。焦?fàn)t逸散物（cokeovenemissions，COE）是生產(chǎn)焦炭時，煙煤等在高溫缺氧的焦?fàn)t碳化室內(nèi)產(chǎn)生的煙類、氣體和蒸汽。它是工業(yè)焦化生產(chǎn)過程形成的主要環(huán)境污染物，由于含有大量的致癌性多環(huán)芳烴，長期暴露其中容易引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞惡變和腫瘤。所以說它是“明確的人類致癌物”，即國際癌癥研究署（IARC）定義的“Ⅰ類致癌物”［15］?；瘜W(xué)致癌物大多與環(huán)境污染和職業(yè)因素有關(guān)，近年來國內(nèi)外許多研究表明，大氣的污染程度與肺癌的發(fā)生和死亡存在正相關(guān)關(guān)系。城市人群肺癌死亡率與農(nóng)村人群相比較高，提示肺癌發(fā)生的危險因素之一就是大氣污染。我國研究發(fā)現(xiàn)，天津、上海、沈陽等大城市居民肺癌死亡率與大氣中苯并A芘濃度存在顯著地正相關(guān)關(guān)系。而對職業(yè)因素的研究與認(rèn)識可追溯到1775年，當(dāng)時有英國醫(yī)師發(fā)現(xiàn)易患陰囊癌的工人多數(shù)曾做過煙囪清掃工作，而現(xiàn)在焦化廠焦?fàn)t作業(yè)工人人群的肺癌發(fā)病率和死亡率明顯高于正常人群。核糖核酸（ribonucleicacid，RNA）是以核糖核苷酸為基本組成單位，具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和重要的生物學(xué)功能。RNA是脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA）的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，參與遺傳信息的復(fù)制和表達(dá)。RNA包括核糖體RNA(rRNA),信使RNA(mRNA),轉(zhuǎn)運RNA（tRNA),微RNA（microRNA),不均一核RNA（hnRNA),核小RNA（snRNA),核仁小RNA（snoRNA)等，RNA在生命活動中發(fā)揮著重要作用，擔(dān)負(fù)著基因的表達(dá)和表達(dá)調(diào)控功能［16］。除了上面的三種RNA，還存在著其他非編碼RNA（non-codingRNA,ncRNA)。這是一類不編碼蛋白質(zhì)但具有重要生物學(xué)功能的RNA分子，分為長鏈非編碼RNA（longnon-codingRNA)和短鏈非編碼RNA(smallnon-codingRNA)［17］。通常將長度大于200nt的非編碼RNA稱為lncRNA,短鏈非編碼RNA的長度一般小于200nt。它們參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA的修飾和剪切、mRNA的穩(wěn)定調(diào)控、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定和轉(zhuǎn)運、染色體的形成和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等重要細(xì)胞功能，進(jìn)而調(diào)控組織分化、器官形成等基本生命活動過程以及某些如腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等的發(fā)生和發(fā)展過程［18］。短鏈非編碼RNA也稱非編碼小RNA，主要包括snRNA、snoRNA、scRNA、ribozyme、miRNA和piRNA。長鏈非編碼RNA（lncRNA）與mRNA結(jié)構(gòu)相似，但在序列中無開放讀框，具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，并與一些疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，一些lncRNA能使基因沉默，另一些lncRNA卻可以激活基因的表達(dá)［19］?，F(xiàn)在的研究大部分只針對于短鏈RNA如miRNA、piRNA等的生成和調(diào)控機(jī)制，對lncRNA的認(rèn)識則相對較少。現(xiàn)在已經(jīng)有研究表明，lncRNA參與調(diào)控了基因組印記、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、體內(nèi)運輸、X染色體沉默以及染色體修飾等重要生命活動過程［20］。lncRNA將不再是基因組轉(zhuǎn)錄的噪音，它的大量的未知的功能吸引了越來越多科研工作人員的廣泛關(guān)注，也因此使越來越多的lncRNA被相繼發(fā)現(xiàn)［21］。腫瘤危害嚴(yán)重，其病因與發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，傳統(tǒng)診斷方法主要以疾病的表型改變?yōu)橐罁?jù)，而表型改變往往在很多情況下不都是特異的，且通常會在疾病發(fā)生一段時間后才出現(xiàn)，因此不能及時作出明確的診斷，致使早期診斷不足而預(yù)后差［22］。常規(guī)治療方法如手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療效果不十分理想。所以想要大幅度提高生存率，需要大力提倡早期診斷和創(chuàng)新治療方法。近年來對lncRNA的研究表明其差異表達(dá)于惡性腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間。lncRNA表達(dá)或功能異常與腫瘤及其他重大疾病密切相關(guān)［23］。因此，差異表達(dá)的特異性lncRNA可作為COE暴露致癌的早期生物標(biāo)志物，進(jìn)一步研究細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的作用機(jī)制，有利于揭示環(huán)境化學(xué)物致細(xì)胞癌變的分子機(jī)制，也可將其作為環(huán)境化學(xué)物致癌的潛在分子標(biāo)志。在臨床應(yīng)用方面，lncRNA可作為一項參考指標(biāo)進(jìn)行早期預(yù)警性風(fēng)險預(yù)測診斷，對具有個體易感性的高危人群進(jìn)行篩檢，基因診斷作為病因診斷，既特異又靈敏，同時可作為藥物靶向治療的潛在靶點提供有效的臨床個體化治療，如基因治療藥物對腫瘤細(xì)胞的選擇性強(qiáng)，且腫瘤細(xì)胞耐藥性和患者全身反應(yīng)較輕，從而顯示出較好的臨床療效。材料與方法2.1材料（1）主要試劑： TRZOL試劑、氯仿、異丙醇、75%乙醇、Rnase-free水、電泳緩沖液、瓊脂糖凝膠等。（2）主要儀器：基因芯片、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、QRT-PCR試劑盒、PCR儀器、超凈工作臺、玻璃勻漿器、移液槍、離心機(jī)、離心管、電泳儀、紫外投射儀、凝膠電泳分析儀、分光光度計、制冰機(jī)、低溫冰箱、倒置顯微鏡、高壓蒸汽滅菌器等。（3）正常人支氣管上皮細(xì)胞、經(jīng)焦?fàn)t逸散物誘導(dǎo)的支氣管上皮惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞。2.2方法2.2.1芯片實驗2.2.1.1細(xì)胞總RNA的提?。?）制作細(xì)胞勻漿：在分別盛有正常16HBE和惡變16HBE的培養(yǎng)皿中加入適量TRIZOL試劑，并用槍吹打幾次然后轉(zhuǎn)移到離心管中，于15℃～30℃靜置5min。（2）RNA分離：向樣品試管加入適量氯仿，用力振蕩離心管體使其充分混勻，室溫靜置15min，于4℃，1200g條件下離心10min，使混合液體分層，RNA存在于水相中。（3）RNA沉淀：吸取含有RNA的上層水相置于新的試管中，加入異丙醇并混勻，室溫靜置10min，在4℃，1200g條件下離心10min。（4）RNA清洗：除去上清液，加入適量75%乙醇，充分洗滌沉淀，輕輕振蕩試管，于4℃，7500g條件下離心5min。（5）RNA溶解：除去上清液，空氣中干燥RNA沉淀10min，加入適量無RNA酶水，用槍反復(fù)吹打幾次，然后于56℃溫育10min。（6）保存與分類：將得到的RNA溶液分裝，一份可以用于核算質(zhì)量測定，一份可用于逆轉(zhuǎn)錄，剩余部分可以保存在-70℃超低溫冰箱。2.2.1.2細(xì)胞總RNA的純化應(yīng)用純化試劑盒對兩種細(xì)胞總RNA進(jìn)行過柱純化2.2.1.3細(xì)胞總RNA的質(zhì)量檢測對純化后細(xì)胞總RNA樣品進(jìn)行定量和質(zhì)檢。用紫外分析儀定量測定細(xì)胞總RNA純度和濃度，用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)胞總RNA純度。2.2.1.4對細(xì)胞總RNA進(jìn)行熒光標(biāo)記反應(yīng)應(yīng)用熒光標(biāo)記反應(yīng)試劑盒，將純化后的細(xì)胞總RNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再體外轉(zhuǎn)錄為cRNA，最后反轉(zhuǎn)錄為cRNA，并用酶進(jìn)行熒光標(biāo)記。具體步驟如下：（1）將純化后的總RNA加入離心管。（2）加入啟動子引物。（3）加入無酶水調(diào)節(jié)總體積。（4）65℃離心管溫育10min。（5）置于冰上5min降溫。（6）在冰上將試劑順序加入另一個潔凈的離心管。（7）冰上低溫瞬時離心。（8）將已備好的試劑加入各樣品中，并吹打至均勻。（9）在40℃下樣品水浴2小時。（10）在65℃水浴15min。（11）移回冰上瞬時離心5min。（12）將試劑順序加入另一個潔凈的離心管。（13）在樣品中加入預(yù)先混合的以上溶劑，上下吹打混勻。（14）40℃樣品水浴2小時。2.2.1.5芯片雜交和洗滌應(yīng)用芯片雜交試劑盒進(jìn)行標(biāo)記DNA雜交實驗，并用相應(yīng)沖洗液清洗芯片等待芯片干燥。2.2.1.6芯片掃描掃描芯片，采集圖像和數(shù)據(jù)。2.2.1.7分析圖像和數(shù)據(jù)，篩選特異性lncRNA經(jīng)過折疊倍率（foldchange）分析獲得的RNA數(shù)據(jù)，挑選在兩組細(xì)胞中差異倍數(shù)大于2或者小于0.5，p值小于0.05（經(jīng)FDR校正）的lncRNA作為表達(dá)差異的lncRNA。2.2.2qRT-PCR技術(shù)對差異lncRNA的驗證2.2.2.1細(xì)胞總RNA的提?。?）制作細(xì)胞勻漿：在分別盛有正常16HBE和惡變16HBE的培養(yǎng)皿中加入適量TRIZOL試劑，并用槍吹打幾次然后轉(zhuǎn)移到離心管中，于15℃～30℃靜置5min。（2）RNA分離：向樣品試管加入適量氯仿，用力振蕩離心管體使其充分混勻，室溫靜置15min，于4℃，1200g條件下離心10min，使混合液體分層，RNA存在于水相中。（3）RNA沉淀：吸取含有RNA的上層水相置于新的試管中，加入異丙醇并混勻，室溫靜置10min，在4℃，1200g條件下離心10min。（4）RNA清洗：除去上清液，加入適量75%乙醇，充分洗滌沉淀，輕輕振蕩試管，于4℃，7500g條件下離心5min。（5）RNA溶解：除去上清液，空氣中干燥RNA沉淀10min，加入適量無RNA酶水，用槍反復(fù)吹打幾次，然后于56℃溫育10min。（6）保存與分類：將得到的RNA溶液分裝，一份可以用于核算質(zhì)量測定，一份可用于逆轉(zhuǎn)錄，剩余部分可以保存在-70℃超低溫冰箱。2.2.2.2細(xì)胞總RNA的質(zhì)量檢測對純化后細(xì)胞總RNA樣品進(jìn)行定量和質(zhì)檢。用紫外分析儀定量測定細(xì)胞總RNA純度和濃度，用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)胞總RNA純度。2.2.2.3QRT-PCR對lncRNA進(jìn)行實時定量的表達(dá)測定按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將lncRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體步驟如下：（1）引物設(shè)計：利用軟件，根據(jù)引物設(shè)計原則，設(shè)計引物。（2）制備逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：在37℃進(jìn)行15min反轉(zhuǎn)錄實驗并在85℃，5s使反轉(zhuǎn)錄酶失活，最終4℃保存在冰箱中。（3）實時PCR儀上qPCR反應(yīng)：先在95℃條件下進(jìn)行30s預(yù)變性反應(yīng)，再在95℃條件下進(jìn)行5s、60℃條件下進(jìn)行6sPCR反應(yīng)總共35個循環(huán)，最后熔解。2.2.2.4統(tǒng)計學(xué)處理將qRT-PCR實驗得到的圖像和數(shù)據(jù)整理并用統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行分析與描述。2.2.3調(diào)控性lncRNA的確定采用Spearman等級相關(guān)系數(shù)對lncRNA與基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r>0.4（r<–0.4），則認(rèn)為兩者存在正（負(fù)）相關(guān)。我們認(rèn)為與lncRNA表達(dá)相關(guān)的基因數(shù)越多，則這個lncRNA為調(diào)控性lncRNA。3結(jié)果3.1轉(zhuǎn)錄組測序出來的差異lncRNA(899個)注：篩選標(biāo)準(zhǔn)FDR<0.05，foldchange>2倍，p<0.05正常人支氣管上皮細(xì)胞與惡性轉(zhuǎn)化的人支氣管上皮細(xì)胞的總RNA分別經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序，以FDR<0.05，foldchange>2倍，P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)差異的lncRNA共有899個，由火山圖（圖A）發(fā)現(xiàn)，紅色部分具有統(tǒng)計學(xué)意義，左邊紅色部分表示特異性lncRNA在惡變細(xì)胞相對低表達(dá)，右邊紅色部分表示特異性lncRNA在惡變細(xì)胞相對高表達(dá)。由聚類圖（圖B）發(fā)現(xiàn)，兩種細(xì)胞從藍(lán)色到紅色，越接近紅色，lncRNA特異性表達(dá)越高，越接近藍(lán)色，lncRNA特異性表達(dá)越低。而且同一分組細(xì)胞內(nèi)lncRNA表達(dá)差異相對較小，不同的兩組細(xì)胞間lncRNA表達(dá)差異相對較大。兩組細(xì)胞間出現(xiàn)差異表達(dá)的部分lncRNA見圖C。ABCRef_SymbolPValueFDRRP5-973M2.200RPE6500AC012513.61.67E-2114.20E-209CTD-2636A23.21.43E-1872.62E-185SCEL-AS13.58E-1665.42E-164CTD-3060P21.11.59E-1652.37E-163AC007750.58.26E-1631.18E-160UCA11.32E-1551.68E-153AC004510.33.60E-1494.29E-147RP11-244F12.32.59E-1442.87E-142TM4SF1-AS11.30E-1401.39E-138AP001623.18.17E-1408.66E-138RP11-22N19.26.47E-1366.49E-134CTD-2024P10.14.64E-1264.09E-124RP11-666A8.97.55E-1246.21E-122AC096574.41.40E-1181.05E-116RP11-69I8.33.17E-1122.24E-110NMNAT22.01E-1071.35E-105CTD-2033D15.12.87E-1031.83E-101PSIP14.96E-862.58E-84XIST1.90E-859.78E-84SFTA1P6.63E-803.14E-78IDI2-AS11.46E-796.91E-783.2lncRNA的驗證注：進(jìn)一步挑選標(biāo)準(zhǔn)FPKM>20分別對正常人支氣管上皮細(xì)胞和惡性轉(zhuǎn)化的人支氣管上皮細(xì)胞提取提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為Crna,利用qRT-PCR技術(shù)對差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行驗證，以FPKM>20，P<0.0001為篩選標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步挑選出在兩組不同細(xì)胞間特異性表達(dá)最為明顯的三種lncRNA：SFTA1P在惡變細(xì)胞相對低表達(dá)，AL031600.1在惡變細(xì)胞相對高表達(dá)，AC124312.2在惡變細(xì)胞相對高表達(dá)，而且特異性lncRNA表達(dá)結(jié)果芯片實驗結(jié)果一致。ABC3.3調(diào)控性lncRNA的確定采用Spearman等級相關(guān)系數(shù)對lncRNA與基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r>0.4（r<–0.4），則認(rèn)為兩者存在正（負(fù)）相關(guān)。我們認(rèn)為與lncRNA表達(dá)相關(guān)的基因數(shù)越多，則這個lncRNA為調(diào)控性lncRNA。由表得知SFTA1P、AL031600.1、AC124312.2調(diào)控的基因數(shù)分別為82、4、16。則SFTA1P為最主要的調(diào)控基因?；蛎{(diào)控的基因數(shù)SFTA1P82AL031600.14AC124312.2164討論焦?fàn)t逸散物（cokeovenemissions，COE）是生產(chǎn)焦炭時，煙煤等在高溫缺氧的焦?fàn)t碳化室內(nèi)產(chǎn)生的煙類、氣體和蒸汽。它是工業(yè)焦化生產(chǎn)過程形成的主要環(huán)境污染物，由于含有大量的致癌性多環(huán)芳烴，長期暴露其中容易引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞惡變和腫瘤。所以說它是“明確的人類致癌物”，即國際癌癥研究署（IARC）定義的“Ⅰ類致癌物”。長鏈非編碼RNA（longnon-codingRNA，lncRNA)，是一類不編碼蛋白質(zhì)但具有重要生物學(xué)功能的RNA分子，長度通常大于200nt，而且與一些疾病尤其是腫瘤等的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，一些lncRNA能使基因沉默，另一些lncRNA則可以激活基因的表達(dá)?，F(xiàn)在的研究大部分只針對于短鏈RNA如miRNA、piRNA等的生成和調(diào)控機(jī)制，對lncRNA的認(rèn)識相對較少?，F(xiàn)在已經(jīng)有研究表明，lncRNA參與調(diào)控了基因組印記、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、體內(nèi)運輸、X染色體沉默以及染色體修飾等重要生命活動過程。lncRNA將不再是基因組轉(zhuǎn)錄的噪音，它的大量的未知的功能吸引了越來越多科研工作人員的廣泛關(guān)注，也因此使越來越多的lncRNA被相繼發(fā)現(xiàn)。惡性腫瘤已經(jīng)成為人類死亡構(gòu)成的重要病因，是目前危害人類健康和生命安全的最嚴(yán)重的重大疾病之一，全世界各個國家和地區(qū)惡性腫瘤的疾病負(fù)擔(dān)均呈不斷上升趨勢，而當(dāng)代面臨的最重要的公共衛(wèi)生問題之一就是腫瘤的預(yù)防和控制。而在我國，發(fā)病率和死亡率均處于持續(xù)不斷升高趨勢的肺癌發(fā)病率為腫瘤的首位，也是所有癌癥死亡的首要原因。肺癌危害尤其嚴(yán)重，它已成為影響我國人民群眾公共健康的重大問題，但其病因與發(fā)病機(jī)制尚不十分明確。肺癌傳統(tǒng)診斷方法主要以疾病的表型改變?yōu)橐罁?jù)，而表型改變往往在很多情況下不都是特異的，而且通常會在疾病發(fā)生一段時間后才出現(xiàn)，因此不能及時作出明確的診斷，致使早期診斷不足而預(yù)后差。常規(guī)治療方法如手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療效果不十分理想。所以想要大幅度提高生存率，需要大力提倡早期診斷和創(chuàng)新治療方法。近年來對lncRNA的研究表明其差異表達(dá)于惡性腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間。lncRNA表達(dá)或功能異常與腫瘤及其他重大疾病密切相關(guān)。因此，差異表達(dá)的特異性lncRNA可作為COE暴露致癌的早期生物標(biāo)志物，進(jìn)一步研究細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的作用機(jī)制，有利于揭示環(huán)境化學(xué)物致細(xì)胞癌變的分子機(jī)制，也可將其作為環(huán)境化學(xué)物致癌的潛在分子標(biāo)志。在臨床應(yīng)用方面，lncRNA可作為一項參考指標(biāo)進(jìn)行早期預(yù)警性風(fēng)險預(yù)測診斷，對具有個體易感性的高危人群進(jìn)行篩檢，基因診斷作為病因診斷，既特異又靈敏，同時可作為藥物靶向治療的潛在靶點提供有效的臨床個體化治療。5結(jié)論1、部分lncRNA在人支氣管上皮惡變細(xì)胞中出現(xiàn)表達(dá)差異。2、推測lncRNA可能與人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制密切相關(guān)，AL031600.1、AC124312.2尤其是SFTA1P可以作為分子性生物標(biāo)記物用于易感人群的篩檢和肺癌的早期診斷。6謝辭通過這一階段的努力，我的畢業(yè)論文《COE誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡變過程中l(wèi)ncRNA的檢測》最后完成了，光陰似箭，歲月如梭，一眨眼大學(xué)生活即將結(jié)束，而這份論文就是最后一份答卷。這篇論文的順利完成離不開老師和同學(xué)對我的幫助和指導(dǎo)。首先要感謝我的導(dǎo)師趙艷潔老師，從寫作提綱，到一遍又一遍地指出每稿中的具體問題，嚴(yán)格把關(guān)，循循善誘，給了我很多專業(yè)知識的指導(dǎo)和建設(shè)性的意見，趙老師嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度，豐富的專業(yè)知識和盡職盡責(zé)的工作精神給了我很大的鼓舞和動力。在臨近畢業(yè)之際，我還要借此機(jī)會向給予我諸多教誨和幫忙的各位老師表示由衷的謝意，感謝他們的辛勤栽培。不積跬步何以至千里，各位任課老師認(rèn)真負(fù)責(zé)，在他們的悉心教導(dǎo)下，我才能夠熟練的掌握和運用專業(yè)知識，并在設(shè)計中得以體現(xiàn)，順利完成畢業(yè)論文。同時，在論文寫作過程中，我還參考了有關(guān)的書籍和論文，在這里一并向有關(guān)的作者表示謝意。我還要感謝我的同學(xué)們以及我的各位室友，在畢業(yè)設(shè)計的這段時間里，你們給了我很多的啟發(fā)，提出了很多寶貴的意見，對于你們幫忙和支持，在此我表示深深地感謝!7參考文獻(xiàn)[1]劉紅梅.GMA誘導(dǎo)的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞相關(guān)差異LncRNA篩選及其研究[D].中國疾病預(yù)防控制中心,2016.[2]毒理學(xué)研究中的體外細(xì)胞毒性評價[J].劉濤,郭辰,趙曉紅.

生命科學(xué).2014(03)[3]TheprognosticroleofPRUNE2inleiomyosarcoma[J].Lin-RuZhao,WeiTian,Guo-WenWang,Ke-XinChen,Ji